一种单链片段抗体－多肽融合蛋白及其应用

摘要

本发明提供了一种单链片段抗体－多肽融合蛋白及其应用，该蛋白是一种具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物双向功能的融合蛋白，可以作为抗癌siRNA的药物载体。其中，单链片段抗体为Her2－ScFv，多肽为鱼精蛋白片段多肽。该单链片段抗体－多肽融合蛋白的序列如SEQ ID NO.1所示的序列。本发明构建的Her2单链片段抗体与鱼精多肽的融合蛋白具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物的双向功能。本发明的融合蛋白能把抗癌siRNA药物定向导入目标癌细胞中，开发了非病毒载体工具，加速RNAi技术应用于临床。

说明书

技术领域

本发明属于生物和医药技术领域，具体涉及一种单链片段抗体-多肽融合蛋白及其应用。

背景技术

Her2是乳腺癌恶化的标志。近年研究发现，约25-30％的乳腺癌病人的癌组织细胞表达一种表皮细胞生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2，Her2)，Her2蛋白是乳腺癌恶化的分子标记。

目前通过阻断Her2受体来治疗乳腺癌的途径主要有抗Her2单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂和传统的反义基因方法等。其中，抗Her2单克隆抗体，如单抗Herceptin，通过阻断受体蛋白起作用，但由于乳腺癌细胞Her2受体是在基因水平过量表达，而新的Her2蛋白仍在源源不断地合成并输送到细胞膜，补充丧失的受体。而且鉴于心脏毒性和过敏反应，单抗的用量不可能无限制地加大。另一方面，Herceptin只作用于Her2跨膜蛋白的细胞外部分，其胞内部分的酪氨酸激酶仍可被邻近未被阻断的表皮生长因子受体激活来传导增殖信号。与酪氨酸激酶抑制剂往往只针对级联网络系统的某一环节，而Her2信号还可以通过旁路途径传导。此外，酪氨酸激酶抑制剂不能直接抑制过量表达的Her2基因，更不能彻底地阻断Her2蛋白的合成。更重要的是，酪氨酸激酶也是正常细胞所必需，使用其抑制剂干扰了很多正常组织细胞的信号传导途径，引起多种毒副作用。传统的反义基因方法包括特异性的反义寡核苷酸和核糖酶(ribozyme)均曾用于抑制乳腺癌细胞Her2基因表达的实验研究。但是由于这些传统的反义基因方法抑制基因表达的效果较弱，因此不能满足临床应用的需求。

Andrew Z.Fire和Craig C.Mello两位科学家于1998年报道发现了核糖核酸干扰(Ribonucleic Acid Interference，RNAi)现象，并于2006年获得诺贝尔医学奖。2001年，Tuchl等把长度约为19-23碱基对、人工合成的外源性(Small Interfering RNA，siRNA)导入哺乳动物细胞内，能诱导出特异地抑制互补序列基因表达的RNAi效应。与传统的抑制基因表达工具反义寡核苷酸和核糖酶比较，siRNA沉默基因表达的效应要强大数十倍至数百倍，其抑制疾病基因治疗疾病的潜力也远远大于传统的逆基因工具。目前，RNAi应用的主要障碍在于如何在临床应用时把特异的RNAi导入目标细胞胞浆内起作用，特别是导入过量表达目标基因的肿瘤细胞内。

针对肿瘤的靶向治疗要求把抗癌药物或基因物质高效特异地输送到癌细胞内，需要具备以下几个条件：①肿瘤细胞表面表达特异性的分子/受体，这些受体只在癌细胞大量表达，而在正常组织细胞基本不表达或表达极少；②受体与相应的配基或抗体结合后可通过细胞内吞作用把相应的受体/抗体或受体/配基复合物导入细胞内；③细胞吞入复合物后，可以通过细胞内的消化系统，如溶酶体等分离复合物，把配基或抗体连接的药物释放到胞浆中。

Her2受体符合上述靶向导入的前提条件，因为它只大量表达于癌细胞表面，在正常组织细胞中表达甚少，这也是癌细胞具有恶性表型的机制。另外，Her2受体与配基或抗体结合后，可通过细胞内吞作用循环到细胞内。研究证明，Her2受体/抗体复合物被吞入细胞后，复合体会被分离，如果复合体同时结合了化疗药物或基因物质，这些物质将会被吸收并释放到胞浆中。因此，Her2抗体或配基携带的抗癌药物只攻击Her2高表达的癌细胞，并能顺利把药物带入细胞内。

单链抗体片段(ScFv)，是指通过基因重组技术，人工表达保留了与抗原特异性结合的免疫球蛋白Fab片段中的简要部分，由一段重链和一段轻链组成，两链之间通过短多肽铰链连接。ScFv既保留了抗原识别和结合的特性，又去除了普通抗体中免疫原性最强的Fc段，同时其分子小，可以与荷正电的多肽重组成融合蛋白，便于携带基因物质。

鱼精蛋白是一种碱性蛋白，能与基因物质结合。我们使用的是鱼精蛋白多肽一段短肽，它保留了富含碱性氨基酸的序列，同样具有结合基因物质的功能。

如果能筛选并构建出这样一种物质，即既能应有于导向携带siRNA双链分子，又可特异性地投入Her2阳性癌细胞，达到减少细胞表面Her2分子，并可通过RNA干扰从基因水平减少Her2 mRNA表达，则可望彻底地阻断Her2的过量表达。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种单链片段抗体-多肽融合蛋白，该蛋白是一种具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物双向功能的融合蛋白，可以作为抗癌siRNA的药物载体。

本发明通过以下方案实现该目的：

本发明的一种单链片段抗体-多肽融合蛋白，所述的单链片段抗体为Her2-ScFv，所述的多肽为鱼精蛋白片段多肽。该单链片段抗体-多肽融合蛋白的序列是如SEQ IDNO.1所示的序列。本方明的一种单链片段抗体-多肽融合蛋白的基因序列的表达载体包括pAcGP67B载体，其表达载体转化的宿主细胞包括sf9昆虫细胞。

本发明的一种单链片段抗体-多肽融合蛋白作为抗癌siRNA的药物载体的应用。

本发明的方案具体如下：

1.构建具有结合Her2受体和携带siRNA药物双向功能的融合蛋白的质粒；

2.构建的pACgp67B-Her2-scfv-protamine质粒小量抽提；

3.酶切鉴定Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽构建的质粒pACgp67B-Her2-scfv-protamine；

4.pACgp67B-Her2-scfv-protamine质粒大量抽提；

5.Her2-scfv-protamine的测序；

6.绘制质粒图；

7.Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白在sf9昆虫细胞中的表达与纯化

8.Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白的鉴定

9.Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白浓度测定

10.检验Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白具有结合癌细胞表面Her2受体和浓缩DNA的双向功能。

本发明有以下优点：

1.本发明构建的Her2单链片段抗体与鱼精多肽的融合蛋白具有结合Her2受体和携带抗癌siRNA药物的双向功能；鱼精多肽带正电荷，能与带负电荷的DNA质粒载体结合，并可浓缩这些DNA分子，经与癌细胞Her2受体介导进入细胞内。在体外细胞培养实验中，应用Her2-ScFv与经删节的鱼精蛋白片段融合蛋白携带报告基因，能大大提高报告基因在Her2阳性的乳腺癌细胞中的表达。与同源的Her2阴性细胞比较，报告基因表达能提高8到10倍。SiRNA与DNA都是携带大量负电荷的分子，也能被荷正电的鱼精多肽浓缩。

2.本发明筛选并构建Her2-ScFv与鱼精蛋白片段多肽的融合蛋白，应用于导向携带siRNA双链分子，特异性地投入Her2阳性癌细胞。本发明构建的Her2单链片段抗体与鱼精多肽的融合蛋白成功把抗癌siRNA药物定向导入目标癌细胞中，开发了非病毒载体工具，加速RNAi技术应用于临床。

3.该融合蛋白既可利用ScFv迅速减少细胞表面的Her2分子，也可通过RNA干扰从基因水平减少Her2 mRNA表达，可望彻底地阻断Her2的过量表达。此融合蛋白的成功开发为发展新型的抗癌基因药物奠定坚实的基础，将为治疗晚期乳腺癌提供有效的武器。

附图说明

图1是pACgp67B-Her2-scfv-protamine用BamHI和XhoI的酶切鉴定图；

图2是pACgp67B-Her2-scfv-protamine用HindIII的酶切鉴定图；

图3是Her2-scfv-protamine的测序图谱与理论序列的比对图；

图4是pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒的简图；

图5是Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白经过Weston blot进行鉴定图。

图6是根据标准蛋白的浓度梯度和紫外分光光度计的读数平均值绘制的标准曲线；

图7是GFP siRNA与不同量的Her2单链片段抗体与鱼精蛋白的多肽融合蛋白和L-蛋白珠行免疫共沉淀结果图；

图8是通过改良Northern Blot检测细胞内GFP siRNA的含量结果图；

图9是共聚焦显微镜定位检测siRNA经Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白导入细胞后的分布情况结果图。

具体实施方式

实施例1.构建具有结合Her2受体和携带siRNA药物双向功能的融合蛋白的质粒。从基因文库中查到Her2单链片段抗体的全长序列后，用引物软件设计相关引物。

设计的Her2-ScFv引物：

正引物：NcoI为内切酶

5’-GGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCAGAG-3’

反引物：NotI为内切酶

5’-TTGCGGCCGCTCCGGAATTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’

设计的鱼精多肽引物：

正引物：NotI为内切酶

5’-CCGGAGCGGGCCGCAATGGCCAGGTACAGATGCTG-3’

反引物：PpuMI作为内切酶，终止密码子和6个组氨酸

5’-GCCGGGTCCCAGGAAAGGATCAGATCTGCATTAATGGTGGTGGTGATGATGAGATCTGTGTCTTCTACATCTCGGTCTG-3’

通过PCR克隆相关目的片段：，Her2-ScFv的PCR反应体系1∶50ul体系：

ddH₂O          37ul

dNTP           5ul

正引物         1ul

反引物         1ul

10×PCR Buffer 5ul

Easy pfu       1ul

鱼精多肽的PCR反应体系2∶50ul体系

ddH₂O          37ul

dNTP           5ul

正引物         1ul

反引物         1ul

10×PCR Buffer 5ul

Easy pfu       1ul

PCR反应循环

预变性94℃     5min

最后延伸72℃   10min

PCR产物酶切Her2 ScFv的PCR产物用Nco I和Not I内切酶切开50ul体系：

Her2 ScFv的PCR产物     20ul

ddH₂O           20ul

Nco I           2ul

Not I           2ul

10×Buffer      5ul

Her2 ScFv的PCR产物酶体系在37℃水浴4小时。

鱼精多肽的PCR产物用NotI和PpuMI内切酶切开

                   50ul体系

鱼精多肽的PCR产物  20ul

ddH₂O              20ul

PpuM I             2ul

Not I              2ul

10×Buffer         5ul

鱼精多肽的PCR产物酶体系在37℃水浴4小时。

pAcGP67B用NcoI和PpuMI内切酶切开

50ul体系：

pAcGP67B           20ul

ddH2O              20ul

PpuM I             2ul

Not I              2ul

10×Buffer         5ul

pAcGP67B的酶切体系在37℃水浴4小时。

将上述三个PCR产物进行切胶回收目的片段，将酶切鉴定片段大小正确的PCR产物全部上样1％琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段用干净的手术刀切下，放入1.5ml离心管，放入回收胶前离心管称重；称重后，在1.5ml离心管中加入以每毫克胶加入1微升体积的膜结合溶液；60℃水浴中放置10min(至胶完全溶解)，每2-3分钟混匀一次(溶胶液应与膜结合溶液颜色相同)；将柱子放样品转移入柱子中(柱子的最大容量为800uL)，室温放置1min，然后16000g×1min离心；取下柱子，弃流出液，将柱子放回原收集管中；加入700ul washing buffer至收集管，室温放置1min，然后16000g×1min离心；加入500ul Membrane washing solution至收集管，然后16000g×1min离心；取下收集管，弃流出液，再次16000g×1min离心；将收集管放置在一支新的1.5mL离心管中，加入50uL Nuclease-Free Water(或无菌H₂O)至膜中央，静置片刻，然后16000g×1min离心，收集回收质粒DNA。

将切胶回收的目的片段进行连接：

Her2 ScFv        5ul

Protamine        5ul

pAcGP67B         5ul

DNALigation Mix  15ul

PCR仪上连接16℃×1小时

连接产物转化感受态细胞，CaCl2制备感受态细胞DH5α。

在15ml试管中加入3ml LB培养基，从平板上挑取一单克隆接种，37℃，250rpm，培养过夜，约16小时。取2ml过夜菌接入200ml新鲜的LB培养基，37℃，260rpm，培养，直至OD600＝0.4-0.5，然后将菌液冰浴30-60分钟。4℃，5000rpm×5min离心收集细菌，弃上清。用10ml 0.1M的CaCl₂轻轻吹打，充分悬浮，冰浴10min。4℃，5000rpm×5min离心，弃上清。加入2ml 0.1M的CaCl₂轻轻吹打，充分悬浮，冰浴30min即感受态制备完成。

转化感受态细胞：准备1.5ml的离心管2支，冰浴预冷；分别取100ul DH5α感受态细胞，各加入10ul连接产物，混合均匀；将上述混合物放置冰上30min；将混合物转移至42℃水浴中温育90sec；将混合物转移至冰上放置2min后，加入800ul的LB培养液，在摇床上37℃，150rpm培养60min；4000rpm×5min离心；弃800ul的上清液，剩余100ul混匀后涂LA板；先取20ul IPTG和70ul Xgal混合后涂布在LA板上进行蓝白斑筛选，然后把上步骤剩余的100ul菌液混匀后涂LA板；LA板置37℃培养箱过夜培养；在过夜培养的LA板上挑取10个长得比较饱满的白色克隆，分别加入6mlLA培养基中，在摇床上37℃，250rpm培养16h。

实施例2 pACgp67B-Her2-scfv-protamine质粒小量抽提

以12000g×1min离心收菌。(一般抽提一份用3-4ml菌液)，弃上清。加250ul冰浴Buffer S1(含RnaseA)，涡旋振荡，使菌体充分悬浮。加250ul Buffer S2，温和混匀6次。(此过程不超过5min)加350ul Buffer S3，温和混匀6次。以12000g×10min离心。取上清，过DNA制备管，以12000g×1min，弃滤液。DNA制备管内加700ul BufferW1，12000g×1min，弃滤液。DNA制备管内加500ul Buffer W2，12000g×1min，弃滤液。再次以12000g×1min离心。加40ul ddH2O(或EB buffer)于DNA制备管的膜中央，室温静置1min(50℃预热EB buffer可能洗脱效果更好)。12000g×1min离心并收集洗脱液，即质粒DNA。

实施例3.酶切鉴定Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽构建的质粒pACgp67B-Her2-scfv-protamine

进行酶切鉴定pACgp67B-Her2-scfv-protamine质粒片段：

①.BamHI(G^GATCC)的酶切位点处于：4259；XhoI(C^TCGAG)的酶切位点处于：1902；所以酶切后的条带大小为：2357bp，位置准确。如图1所示，pACgp67B-Her2-scfv-protamine用BamHI和XhoI的酶切鉴定。M为marker，1，2，3，4，5，6，7为不同克隆细菌扩增并抽提质粒DNA后酶切可见2027bp处上方有相应的条带，与预期条带的位置相吻合。

②.HindIII(A^AGCTT)的酶切位点处于：2，5328，6256，7292，所以酶切后的四个条带大小为：5326bp，3423bp，1036bp，928bp，位置准确。如图2所示，pACgp67B-Her2-scfv-protamine用HindIII的酶切鉴定。M为marker，1，2，3，4，5，6，7为不同克隆细菌扩增并抽提质粒DNA后酶切可见4条不同的条带，与预期条带的位置(5326bp，3423bp，1036bp，928bp)相吻合。。

实施例4 pACgp67B-Her2-scfv-protamine质粒大量抽提

吸取0.5ml上述菌液加入500ml LA培养基中在摇床上37℃，250rpm培养16h，菌液密度大约为3-4×10⁹细胞/ml。将菌液收集在200ml离心管中，在4℃条件下，以6000g的速度离心15min。以同样的条件重复3次，把细菌收集在同一个离心管中。将细菌沉淀重悬在20ml Buffer P1(使用前加入RNaseA和LyseBluereagent)中。向离心管中加入20ml Buffer P2，并上下颠倒4-6次混匀，在室温(15-25℃)下放置5min，此时混合液变为蓝色。向离心管中加入20ml Buffer P3，并上下颠倒4-6次混匀，在冰上放置30min，此时混合液蓝色褪去，变为无色。将上述液体在4℃，20000g离心30min，并迅速收集含有质粒DNA的上清液。将上一步骤获得的上清液4℃，20000g离心15min，并迅速收集含有质粒DNA的上清液。向上清液中加入42ml异丙醇以沉淀其中的质粒DNA，并4℃，20000g离心15min，小心弃去上清液。向质粒DNA沉淀中加入500μl TE buffer(pH 8.0)，并加入Buffer QBT至总容量5ml。使用QIAGEN-tip 100进行质粒抽提，取4ml Buffer QBT加入QIAGEN-tip 100柱子进行平衡，并让液体在重力的作用下缓慢流尽。将步骤9所获得的含有质粒DNA的液体加入柱子，让其在重力的作用下缓慢进入交换树脂。用Buffer QC洗柱，2×10ml。用5ml Buffer QF过柱进行洗脱，用一个干净的离心管接洗脱液。于洗脱液中加3.5ml异丙醇以沉淀质粒DNA，并4℃，15000g离心30min。离心后将上清液小心弃去。室温下用2ml 70％的酒精洗质粒DNA，然后在4℃，15000g离心10min，离心后小心弃去上清液。沉淀物风干10min后加入250μl的TE buffer(pH 8.0)，抽提质粒浓度测定：应用紫外分光光度计测定质粒大量抽提后获得的pACgp67B-Her2-scfv-protamine质粒的浓度为：0.025×1000×50＝1.25ug/ul。

实施例5 Her2-scfv-protamine的测序

委托大连宝生物公司进行测序，Her2-scfv-protamine的序列完全正确：

ANGCTTATAAGGAAAACAGCAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCG

GCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCGGATCTTGGATCCCGGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGT

GCAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCT

GGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGA

GTACATGGGGCTCATCTATCCTGGTGACTCTGACACCAAATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCA

GGTCACCATCTCAGTCGACAAGTCCGTCAGCACTGCCTACTTGCAATGGAGCAGTCTGAAGC

CCTCGGACAGCGCCGTGTATTTTTGTGCGAGACATGACGTGGGATATGCAGTAGTTCCAACT

GCGCAAAGTGGCCTGAATACTTCCAGCATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGTTGACGC

AGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAG

CTCCAACATTGGGAATATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAACT

CCTCATCTATGATCACACCAATCGGCCCGCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTC

TGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGTTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTG

TGCCTCCTGGGACTACACCCTCTCGGGCTGGGTGTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGACCGTCC

TAGGTGCGGCCGCCGGCGGAGGAGGATCTCATCATCACCACCACCATTAATTAAGGATCTGAT

CCTTTCNTGGACCCGGCAAAACCAAAT

将Her2-ScFv-protamine的测序图谱与理论图谱进行比对，结果完全正确，如图3所示，Her2-scfv-protamine的测序图谱中可以直观的进行待测序列与理论序列的比对，可以看到我们插入的目标序列均完全正确的插入正确的位置。

实施例6绘制质粒图

绘制所构建质粒pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine的质粒图，如图4所示，为pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒的简图。这个质粒图阐明了质粒的英文全称为pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine，序列的总长度为10713bp，以及目标序列Her2-ScFv，protamine和纯化标签His-tag的插入位置，并说明相应的酶切位点等质粒信息。。这个质粒图阐明了质粒的英文全称为pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine，序列的总长度为10713bp，以及目标序列Her2-ScFv，protamine和纯化标签His-tag的插入位置，并说明相应的酶切位点等质粒信息。通过质粒可使本领域的专业技术人员可以迅速而全面的理解本发明。

实施例7Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白在sf9昆虫细胞中的表达与纯化

Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白的表达：

pAcGP67B-Her2-ScFv-protamine质粒与杆状病毒共转染sf9昆虫细胞(使用BDBaculoGold转染试剂盒)，接种2×10⁶Sf9于60mm组织培养皿中，初始细胞密度应在50-70％铺满。使细胞牢固贴壁(大约15min)。除去培养基，加入1ml转染缓冲液A。确认培养皿的所有区域被转染缓冲液A覆盖，以防止细胞干燥死亡。于一无菌15ml离心管中混合0.5μg Baculo Gold TM线性DNA和2μg重组转移载体质粒(含有目的基因)。混合物静置5min后加入1ml转染缓冲液B，混合均匀。

将1ml转染缓冲液B/DNA溶液逐滴加入组织培养皿，每加入2到3滴便温和地晃动培养皿以使起其与转染缓冲液A混匀。在此过程期间，应该可以见到形成的沉淀使得溶液呈现轻微乳状。27度培养4小时。4小时以后，除去转染溶液，并加入3mlGrace’s Insect Cell Culture Medium。温和晃动培养皿，然后除去培养基。加入3ml新鲜Grace’s Insect Cell Culture Medium，27℃培养4-5天。4-5天后，收集上清，用其感染更多细胞以扩增病毒，扩增病毒后行蛋白表达。Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白在sf9昆虫细胞中的表达。注意：生产目的蛋白时，病毒MOI应该在3-10。

接种9×10⁶ Sf9于T75培养瓶中，加入至含有10ml Sf9培养基(含有10％胎牛血清)。T75培养瓶置培养箱中27℃培养1小时。1小时吸去旧培养基换用新鲜培养基，并加入高滴度的病毒液，使MOI介于5-10之间。T75培养瓶置培养箱中27℃培养72小时。72小时后把细胞和上清吸到一个离心管中，4℃，1000g离心10分钟收集细胞。用预冷的PBS加入细胞中重悬洗涤，4℃，1000g离心10分钟收集细胞。裂解所有细胞沉淀于1ml裂解缓冲液：10mM Tris-HCl，pH7.5，200mM Nacl，1％TritonX-100，10mM NaF/10mM Sodium Pyrophosphate/10mM Sodium phosphate，1×photeaseinhibitor cocktail.。10000g，10min，4℃离心裂解液，收集上清。

纯化Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白：

先用3-5倍柱体积的Washing buffer洗Ni-NTA琼脂胶柱(Pierce)。待Washingbuffer流尽后，加入蛋白上清液过柱，让其缓慢流出。待上清液流尽，加入含有3-5倍柱体积的20mM咪唑洗涤Ni-NTA柱。加入含有不同浓度的咪唑缓冲液3倍柱体积进行洗脱，浓度分别为100mM，250mM，500mM和1000mM，并分别收集洗脱液进行分析。

实施例8 Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白的鉴定

我们成功构建了Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白的杆状病毒表达载体(pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine)，质粒图谱可见图4，在sf9昆虫细胞杆状病毒表达系统表达。我们把这一载体与杆状病毒包膜质粒DNA(BacuoGold Bright DNA，BD Pharmingen公司)一起共转染Sf9细胞，装配病毒载体颗粒，感染Sf9细胞，细胞裂解液过His-Tag蛋白分离柱进行纯化，表达出来的带有6个组氨酸尾巴(His-Tag)的Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白，用抗人IgG单抗作为一抗的WesternBlot鉴定分离的融合蛋白，如图5所示，Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白经过Weston blot进行鉴定图。Control为为感染病毒的细胞裂解蛋白，而MOI＝1，3，5，10和15则分别是不同病毒与细胞数量比时的结果，可以见到大小为36KD的目标条带，而且MOI＝5和10时表达量较高。

结果表明用pAcGP67B-Her2-ScFv-Protamine质粒和杆状病毒可以成功的表达出Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽这种融合蛋白。而且，在MOI＝5和10，即病毒与细胞数量比为5和10时的表达效果更好，表达出来的融合蛋白大小为36KD。

实施例9 Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白浓度测定

Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白经过表达和纯化后，由于洗脱液内含有较多的有机物质，需要通过透析去除有机溶剂和超滤进行浓缩。常用PBS，4℃透析48小时后进行超滤浓缩。

经过超滤后用蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定：

①.吸取180ul BSA(2mg/ml)于96孔板中的最靠边缘的第一孔，同一排的其它11个孔中各加入60ul 0.9％生理盐水；

②.吸取120ul第一孔的液体加入一个盛有60ul生理盐水的第二孔，并充分混合均匀；

③.用同样方法处理至第十二孔；

④.各吸取20ul上述稀释液体加入另外两排24个孔中；

⑤.各吸取20ul蛋白样品液体加入96孔板中，并设复孔；

⑥.分别吸取5ul 5×的细胞裂解液加入样品孔和BSA孔中；

⑦.以50∶1的比例配制A+B混合液；

⑧.吸取200ul A+B混合液加入上述各个孔中；

⑨.96孔板置37℃培养箱中孵育30分钟；

⑩.将板放置紫外分光光度计中进行读数。

根据标准蛋白的浓度梯度和紫外分光光度计的读数值绘制标准曲线：将曲线进行拟和后可得直线及其方程：

Y＝-0.12622+1.01542 X

R＝0.99666

P＜0.0001

如图6所示，根据标准蛋白的浓度梯度和紫外分光光度计的读数平均值绘制标准曲线，然后进行拟和直线，并得到直线的相应方程式。将待测样本的紫外分光光度读数值代入方程可得相应的蛋白浓度)纯化后Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白的浓度为100ug/ml，5×10⁷细胞可获得2ml融合蛋白溶液。

实施例10 Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白具有结合癌细胞表面Her2受体和浓缩DNA的双向功能，并能把目标DNA选择性导入Her2阳性细胞进行表达。

我们进一步检验Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白携带siRNA和靶向导入Her2阳性细胞的双向功能。

①.Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白与siRNA的结合力检测

我们用荧光素(FITC)标记的GFP siRNA与不同量的Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白和L-蛋白珠(L-protein beads：能结合人IgG)进行免疫共沉淀，通过分光计定量检测FITC-siRNA。

结果显示Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白与siRNA的饱和结合力约为1∶6摩尔比。图7为GFP siRNA与不同量的Her2单链片段抗体与鱼精蛋白的多肽融合蛋白和L-蛋白珠行免疫共沉淀，显示Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白与siRNA的饱和结合力约为1∶6摩尔比。

②.然后，我们用这种融合蛋白携带GFP siRNA(1∶6摩尔比)，处理Her2基因表达载体(pCMV-ErbB2)转染的Hela细胞(效率达89％)，通过改良Northern Blot检测细胞内GFP siRNA的含量。图8所示为Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白能有效地把GFP siRNA导入Her2阳性细胞。泳道1-3分别为100、500、1000pmol siRNA时细胞内检测到的siRNA信号，随着siRNA量的增加，胞内siRNA信号也越强。泳道4和5分别为Her2单链片段抗体携带GFP siRNA处理组和Her2阴性细胞组，可见胞内不能检测到siRNA信号。

结果显示Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白能有效地把GFP siRNA导入Her2阳性细胞，而且随着siRNA量的增加(100、500、1000pmol)，细胞内检测到的siRNA信号也越强(泳道1-3)。而作为对照的不含鱼精蛋白多肽片段的Her2单链片段抗体携带GFP siRNA处理组(泳道4)和Her2阴性细胞(泳道5)则不能检测到siRNA信号。说明Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白能把siRNA选择性地导入Her2阳性细胞内。

③.共聚焦显微镜定位检测Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白导入siRNA在细胞内的分布。

我们用共聚焦显微镜定位检测Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽融合蛋白导入FITC-siRNA在细胞内的分布，图9为共聚焦显微镜定位检测siRNA经Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白导入细胞后的分布情况。可见莹光siRNA分布于Her2阳性Hela细胞的胞浆中(A)，而Her2阴性细胞内则没有siRNA(B)。发现siRNA分布于Her2阳性Hela细胞的胞浆中，而Her2阴性细胞则没有siRNA。这些实验证实了Her2单链片段抗体与鱼精蛋白多肽的融合蛋白携带siRNA和特异导入Her2阳性细胞的功能。

序列表

SEQ ID NO：1

<110>中山大学附属第二医院

<120>Her2单链片段抗体与鱼精多肽融合蛋白作为抗癌siRNA的药物载体

<160>1

<170>

<210>1

<211>960

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)...(960)

<223>n＝a或g或c或t

<400>1

atggcccagg tgcagctggt gcagtctggg gcagaggtga aaaagcccgg ggagtctctg   60

aagatctcct gtaagggttc tggatacagc tttaccagct actggatcgc ctgggtgcgc  120

cagatgcccg ggaaaggcct ggagtacatg gggctcatct atcctggtga ctctgacacc  180

aaatacagcc cgtccttcca aggccaggtc accatctcag tcgacaagtc cgtcagcact  240

gcctacttgc aatggagcag tctgaagccc tcggacagcg ccgtgtattt ttgtgcgaga  300

catgacgtgg gatattgcag tagttccaac tgcgcaaagt ggcctgaata cttccagcat  360

tggggccagg gcaccctggt caccgtctcc tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc  420

tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg acgcagccgc cctcagtgtc tgcggcccca  480

ggacagaagg tcaccatctc ctgctctgga agcagctcca acattgggaa taattatgta  540

tcctggtacc agcagctccc aggaacagcc cccaaactcc tcatctatga tcacaccaat  600

cggcccgcag gggtccctga ccgattctct ggctccaagt ctggcacctc agcctccctg  660

gccatcagtg ggttccggtc cgaggatgag gctgattatt actgtgcctc ctgggactac  720

accctctcgg gctgggtgtt cggcggagga accaagctga ccgtcctagg tgcggccgca  780

atggccaggt acagatgctg tcgcagccag agccggagca gatattaccg ccagagacaa  840

agaagtcgca gacgaaggag gcggagctgc cagacacgga ggagagccat gaggtgttgt  900

cgccccaggt acagaccgag atgtagaaga cacagatctc atcatcacca ccaccattaa  960