更年期障碍预防·改善剂及功能性饮食品

摘要

本发明涉及通过将杜仲木酚素等木酚素与嗜酸乳杆菌一起培养来制备开环异落叶松树脂酚等雌激素样活性中间体的方法。本发明还提供一种含有与嗜酸乳杆菌一起培养的木酚素作为有效成分的更年期障碍预防·改善剂以及更年期障碍预防·改善用功能性饮食品。

说明书

技术领域

本发明涉及用于获得预防·改善伴随更年期发病的各种症状的作用的更年期障碍预防·改善剂及功能性饮食品。

背景技术

更年期障碍是指闭经前后来自卵巢的女性荷尔蒙(雌激素)分泌量降低导致的身体·精神的症状不定的自诉症状。然后，随着年龄的增长，开始出现皮肤老化、高血脂症、骨质疏松症、脑功能降低等各种症状。

针对上述症状，已知给与女性荷尔蒙的荷尔蒙补充疗法(HRT)是有效的。但是，2002年7月，WHI(女性健康促进会，Woman’s HealthInitiative)发表的使用5年时的中间结果中，报道了给与雌激素导致的乳腺癌发生率增加等危险。因此，现在人们要求更安全的更年期治疗。

已知日本人的更年期障碍的症状比欧美人轻。有报导认为其原因与大豆或大豆发酵食品的摄取有关。即，一般认为是由于大豆所含的异黄酮具有雌激素样活性。除大豆之外，摄取多种食物时均呈现出雌激素样活性。作为摄取时呈现雌激素样活性的植物，已知有芝麻、亚麻籽、杜仲等，实际上，市售有以上述植物为原料的添加剂(supplement)等。另外，Milder等(Ivon E.J.Milder etal.，Br.J.Nutr.，93，393-402(2005))报告了测定来自植物的各种食品中的4种木酚素(落叶松树脂醇、松脂醇、开环异落叶松树脂酚、罗汉松脂素(matai resinol))的含量的结果。

迄今为止已有关于含有在摄取时呈现雌激素样活性的木酚素的杜仲的更年期障碍诸症状改善效果的报告，在中药大辞典、中华人民共和国药典中记载有“具有补肝肾、强筋骨、安胎的效果，治疗腰、背酸痛、足膝虚弱(膝盖麻痹)、残余尿、女性的不正常出血、早流产、高血压”等。另外，在专利文献1中具体给出了抗高血脂症功能。

木酚素之一的松脂醇·二葡糖苷利用肠内细菌的作用除去糖，经由松脂醇、落叶松树脂醇、开环异落叶松树脂酚等，最终代谢为肠二醇(enterodiol)、肠内酯(enterolactone)，呈现雌激素样活性(图1)(Li-Hua Xie，et al.，Chem.Pham.Bull.51(5)508-515(2003))。但是，至今为止，几乎仍未阐明何种细菌或细菌群具有代谢木酚素的活性以及各种代谢中间体的何种成分具有雌激素样活性。

通过摄取芝麻、亚麻籽、杜仲或以它们为原料的添加剂所得的效果的程度因人而异。作为其原因之一，认为受到肠内细菌群因各人而不同的影响。即，多数情况下，人摄取生药时，该生药所含的有效成分被肠内细菌代谢·活化，呈现效果，但也有下述情况，即因肠内细菌的种类和菌数的不同，有效成分不进行代谢·活化，即使摄取也得不到其效果。

因此，为了预防·改善更年期障碍得到雌激素样活性，与直接摄取植物中所含的木酚素相比，预先将木酚素代谢·活化后进行摄取，可期待更高的效果。

另一方面，将木酚素进行化学转化，选择性地得到活性高的雌激素用活性中间体并不简单。因此，一般认为为了得到更年期障碍的预防·改善作用，开发通过生物学的方法预先将木酚素代谢·活化的方法是有用的。

本说明书中引用的参考文献如下所述。下述文献中记载的内容均作为本说明书的一部分引用于此。这些文献均不是针对本说明书的现有技术。

专利文献1：专利第3435415号公报

非专利文献1：Ivon E.J.Milder et al.，Br.J.Nutr.，93，393-402(2005)

非专利文献2：Li-Hua Xie et al.，Chem.Pham.Bull.51(5)，508-515(2003)

发明内容

本发明的目的在于提供用于预防·改善更年期障碍有用的药物和功能性饮食品。

本发明人等发现嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)代谢木酚素能生成雌激素样活性中间体，从而完成了本发明。即，根据本发明，提供一种制备雌激素样活性中间体的方法，其特征在于将木酚素和嗜酸乳杆菌一起培养。优选木酚素为松脂醇或杜仲树脂酚。还优选木酚素为杜仲木酚素。另外优选雌激素样活性中间体为开环异落叶松树脂酚。

其他方案中，本发明提供一种含有与嗜酸乳杆菌一起培养的木酚素作为有效成分的更年期障碍预防·改善剂以及更年期障碍预防·改善用功能性饮食品。

通过摄取与嗜酸乳杆菌一起培养的木酚素或通过同时摄取嗜酸乳杆菌和木酚素，可以预防或改善更年期障碍。本发明的更年期障碍预防·改善剂及含有该更年期障碍预防·改善剂的功能性饮食品以已经被确认了其安全性的、被经口摄取的木酚素作为有效成分，所以可以安全地经口摄取。

附图说明

[图1]图1表示作为木酚素的一种的松脂醇·二葡糖苷经肠内细菌作用的假想代谢途径。

具体实施方式

以下，更详细地说明本发明。

本发明的更年期障碍预防·改善剂含有通过与嗜酸乳杆菌一起培养而被代谢·活化的木酚素作为有效成分，其效果比摄取代谢·活化前的木酚素高。作为木酚素，例如可以举出杜仲木酚素、亚麻籽木酚素、芝麻木酚素等。优选木酚素为杜仲木酚素。木酚素在嗜酸乳杆菌的作用下首先从木酚素糖苷转化为苷元(aglucon)。进一步，松脂醇、杜仲树脂酚被嗜酸乳杆菌代谢·活化，转化为各种雌激素样活性中间体。本说明书中，所谓雌激素样活性中间体包含下述两种物质：该物质本身具有雌激素样活性的物质，以及摄取后在生物体内被进一步代谢转化为具有雌激素样活性的物质的物质。雌激素样活性中间体包含落叶松树脂醇和开环异落叶松树脂酚等。本发明中优选雌激素样活性中间体为开环异落叶松树脂酚。

如下述实施例所示，本发明中可见木酚素被嗜酸乳杆菌代谢，生成雌激素样活性中间体，并且该雌激素样活性中间体实际上具有向雌激素受体结合的结合能。

作为嗜酸乳杆菌的菌株，没有特别限定，例如可以举出嗜酸乳杆菌CL-0062株(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号FERM BP-4980，保藏日1994年3月4日)、嗜酸乳杆菌L92株(独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，保藏编号FERM BP-4981，保藏日1994年3月4日)等。

嗜酸乳杆菌CL-0062株具有以下的细菌学性质。

1.形态学性质

1)细胞的形状：杆菌、2)运动性：无、3)有无孢子：无、4)革兰氏染色性：阳性。

2.生理学性质

1)过氧化氢酶：阴性、2)吲哚生成：阴性、3)硝酸盐的还原：阴性、4)对氧的态度：兼性厌氧性菌、5)在15℃下生长：无、6)利用均聚乳酸发酵由葡萄糖生成DL(-)乳酸，未产生气体。7)各种碳水化物的分解性：葡萄糖；+、乳糖；+、甘露糖；+、果糖；+；半乳糖；+、蔗糖；+、阿拉伯糖；-、麦芽糖；+、木糖；-、鼠李糖；-、纤维二糖(cellobiose)；+、海藻糖；+、蜜二糖(melibiose)；+、棉子糖；+、甘露醇；-、山梨醇；-、七叶苷；+、水杨苷；+、N-乙酰基葡糖胺；+、苦杏仁苷；+、龙胆双糖；+、松三糖；-、糊精；+、淀粉；-。

嗜酸乳杆菌L92株具有以下的细菌学性质。

1.形态学性质

1)细胞的形状：杆菌、2)运动性：无、3)有无孢子：无、4)革兰氏染色性：阳性。

2.生理学性质

1)过氧化氢酶：阴性、2)吲哚生成：阴性、3)硝酸盐的还原：阴性、4)对氧的态度：兼性厌氧性菌、5)在15℃下生长：无、6)利用均乳酸发酵由葡萄糖生成DL(-)乳酸，未产生气体。

7)各种碳水化物的分解性：葡萄糖；+、乳糖；+、甘露糖；+、果糖；+；半乳糖；+、蔗糖；+、阿拉伯糖；-、麦芽糖；+、木糖；-、鼠李糖；-、纤维二糖；+、海藻糖；+、蜜二糖；-、棉子糖；+、甘露糖；-、山梨糖；-、七叶苷；+、水杨苷；+、N-乙酰基葡糖胺；+、苦杏仁苷；+、龙胆双糖；+、松三糖；-、糊精；-、淀粉；-。

木酚素可以从芝麻、亚麻籽、杜仲等中容易地得到。作为木酚素，特别优选杜仲木酚素。杜仲木酚素除可以使用杜仲的树皮或叶的提取液或将提取液适当分离、浓缩、精制等使用之外，还可以将该提取液或其浓缩物进行冷冻干燥、喷雾干燥等制成粉末进行使用。

为了将木酚素和嗜酸乳杆菌一起培养，在含有木酚素的培养基中添加嗜酸乳杆菌的菌体，通常通过静置或搅拌培养，例如在温度25℃～45℃下、优选在30℃～45℃下进行培养。木酚素例如可以以MeOH溶液等形态添加至终浓度为0.01-10mM。优选将预先在MRS培养基、GAM培养基、乳培养基等中在37℃进行前培养20～24小时的嗜酸乳杆菌菌体用作促酵物。初产菌数优选为10⁵-10⁹个/ml左右。培养时间为3～168小时，优选为12～96小时。乳酸酸度为1.5以上时可以停止培养。可以根据所用的菌种适当选择好氧/厌氧条件。

为了通过将木酚素与嗜酸乳杆菌一起培养所得的木酚素代谢中间体呈现雌激素样活性，代谢中间体必须与雌激素受体结合。雌激素受体结合能例如通过进行MCF-7细胞的增殖活性评价，或使用酵母进行雌激素受体分析进行调查。

另外，为了调查木酚素代谢中间体对生物体的作用，将与嗜酸乳杆菌一起培养的木酚素经口给与摘除了卵巢的更年期模型动物，以该动物的骨密度或血中胆固醇等为指标，确定其效果。

可以采用本领域技术人员公知的方法将与嗜酸乳杆菌一起培养的木酚素调制成医药制剂，从而制得本发明的更年期障碍预防·改善剂。例如，将与乳酸菌一起培养的木酚素与药学上能允许的载体或介质具体而言为灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、混悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋型剂、载色剂、防腐剂、粘合剂等适当地组合并混合，进行制剂化。用于经口给药时，可以制成片剂、丸剂、糖衣剂、胶囊剂、液体制剂、凝胶、糖浆、糊剂、悬浊液等。本发明的更年期障碍预防·改善剂除含有与乳酸菌一起培养的木酚素作为有效成分外，还可以含有其他具有更年期预防·改善效果的公知成分。

本发明的更年期障碍预防·改善剂的经口摄取量，可以根据给药时间或其继续性等适当地选择，以得到所希望的效果。给药量因年龄、体重、症状、治疗效果、给药方法、处理时间等而不同，通常成人每人在1次1mg～1000mg的范围，可以1日1次～数次地进行给药。需要说明的是，由于木酚素及乳酸菌均能食用，所以从安全性来看给药量没有限制。

本发明的更年期障碍预防·改善剂的给与可以在产生更年期伴随的诸多症状之后进行，还可以在为了预防上述症状的期间内持续每天给与或间歇地给与。

本发明的其他方案中，提供了含有与乳酸菌一起培养的木酚素的功能性饮食品。本发明的功能性饮食品中，与乳酸菌一起培养的木酚素的配合比例可以根据功能性饮食品的形态或摄取持续性等适当选择，没有特别限定。

作为上述功能性饮食品的形态，例如可以举出酸奶、乳酸菌饮料等发酵乳制品、配合有发酵乳乳清、或其浓缩物等的各种加工饮食品、茶饮料、干燥粉末、片剂、胶囊剂、颗粒剂等。

上述功能性饮食品中可以添加糖类、蛋白质、脂质、维生素、矿物质、香味增强剂(flavor)或上述物质的混合物等添加物。另外，还可以含有植物木酚素的提取液。

本发明的功能性饮食品是含有本发明的更年期障碍预防·改善剂的食品及饮料，可以作为诉求预防或改善伴随更年期诸症状的、例如特定的保健用食品等。

本发明的功能性饮食品的摄取量和摄取时间没有特别限定，例如，可以针对更年期障碍的各种症状，在必需改善效果的情况等之前持续或间歇地摄取、以及在上述情况出现之后持续地或间歇地摄取。

本说明书中明确引用的所有专利及参考文献的内容均作为本说明书的一部分引用于其中。另外，作为本申请的优先权基础的申请即日本专利申请2005-221984号说明书及附图记载的内容均作为本说明书的一部分引用于其中。

实施例

以下，参见实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。

实施例1.嗜酸乳杆菌的木酚素代谢功能

评价各种微生物的木酚素代谢功能。使用MRS培养基或GAM培养基在37℃下将下述表1-3所示的各种微生物前培养20-24小时，以1-3％植菌在10ml MRS培养基或GAM培养基中。添加杜仲木酚素(松脂醇或杜仲树脂酚)直至培养基中的最终浓度为0.5mM，在37℃下继续培养。经时地进行采样，添加的木酚素被代谢转化为开环异落叶松树脂酚的情况可用HPLC定量地测定。50％以上的木酚素被转化的试样用○表示，几乎未转化的试样用×表示。结果示于表1-3。

[表1]

表1

  松脂醇→开环异落叶松树脂酚  瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)  ×  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)  ○  加氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)  ×  类干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)  ×  干酪乳杆菌(lactobacillus casei)  ×  植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)  ×  发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)  ×  路氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)  ×  德氏乳杆菌(lactobacillus lactis)  ×  粪肠球菌(Enterococcus faecalis)  ×  屎肠球菌(Enterococcus faecium)  ×  枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)  ×  凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)  ×  双歧杆菌(Bifidobacterium)  ×

[表2]

  松脂醇→开环异落叶松树脂酚  嗜酸乳杆菌(lactobacillis acidophilus)①  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)②  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)③  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)④  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)⑤  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)⑥  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)⑦  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)⑧  ○  嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)⑨  ○  食淀粉乳杆菌(lactobacillus amylovorus)  ×  卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)  ×  鸡乳杆菌(lactobacillus gallinarum)  ×  约氏乳杆菌(lactobacillus johosonii)  ×

[表3]

  杜仲松脂酚→开环异落叶松树脂酚  嗜酸乳杆菌①  ○  嗜酸乳杆菌④  ○

由表1-3可知，嗜酸乳酸菌具有由松脂醇生成开环异落叶松树脂酚的能力。并且，表明至少这次测定的嗜酸乳酸菌的菌株具有由松脂醇生成开环异落叶松树脂酚的能力。该结果表示嗜酸乳酸菌具有将木酚素代谢·活化转化为雌激素样活性中间体的能力。

实施例2.木酚素及其代谢产物与雌激素受体的结合

在含有重组表达的人型雌激素受体α或β的pH7.4的10mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris Buffer)(含有0.1％BSA、10％甘油、1mMDTT)中，使1mM试样(松脂醇·二葡糖苷、松脂醇、开环异落叶松树脂酚)和0.5nM的氚水平化的雌二醇在25度下反应2小时。反应结束后，回收·洗涤受体，根据通常方法测定与受体结合的氚水平化的雌二醇量。以0.5nM[³H]雌二醇与受体结合的量为100％，计算分别添加木酚素或代谢中间体时的[³H]雌二醇的结合度，用100减去该结合度得到的值为结合抑制率。结果示于下表。

[表4]

表4

与雌激素受体α结合的结合抑制率

  抑制率(％)  松脂醇·二葡糖苷  4  松脂醇  23  开环异落叶松树脂酚  43

与雌激素受体β结合的结合抑制率

  抑制率(％)  松脂醇·二葡糖苷  5  松脂醇  30  开环异落叶松树脂酚  52

由以上结果可以确认，木酚素及其代谢产物具有与雌激素受体的结合能力。另外可知，实际上在嗜酸乳杆菌中，伴随代谢为松脂醇·二葡糖苷→松脂醇→开环异落叶松树脂酚，与雌激素受体的结合能力增强，开环异落叶松树脂酚与松脂醇·二葡糖苷相比，与松脂醇结合的结合抑制率较高，为10倍左右。由以上可知，木酚素被嗜酸乳杆菌代谢，通过之后发生的靶向基因表达而发挥各种作用，由此可期待能得到更年期障碍预防·改善效果。

产业上的可利用性

本发明对更年期障碍的预防·改善有用。