黄瓜TTG1－like基因的蛋白编码序列

摘要

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的黄瓜TTG1－like基因的蛋白编码序列。包括：编码具有黄瓜TTG1－like蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且该核苷酸序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第160－1158位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述核苷酸序列能在45－55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第160－1158位的核苷酸序列杂交。在黄瓜中克隆与拟南芥决定表皮毛起始的TTG1同源的基因，不仅将有利于理解植物表皮毛形态建成的分子机制，而且也将会有助于认识黄瓜果刺这个重要品质基因形成的分子机理，为黄瓜品质育种提供理论依据，加快品种育种进程。本发明也对植物花色的改良有重要作用，本发明具有很大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域蛋白编码序列，特别是一种黄瓜TTG1-like基因的蛋白编码序列。

背景技术

表皮毛(Trichomes)是许多陆地植物表面着生的附属物，由表皮细胞发育而来的。它分为单细胞或多细胞，在表皮毛中有的有腺体，可以分泌一些脂类物质或次生代谢物，有的无腺体。植物表皮毛的形态变异很大，有星型、羽状、盾状和头状等等，相同的植物上能产生不同类型的表皮毛。植物表皮毛具有一系列功能：无腺体的表皮毛具有散热、增加对冷害的忍受力、方便种子传播、水分的吸收、保护紫外和一些食草昆虫对植物组织损伤的作用；有腺体的表皮毛可通过分泌化学物质来帮助植物抵抗食草昆虫和病原菌，同时也具有吸引动物或堆积盐分的作用。一些无腺体的表皮毛，比如棉纤维是来自棉花种子表皮毛，对于纺织工业是十分重要的。

黄瓜(Cucumis sativus L.)是葫芦科(Cucurbitaceae)黄瓜属(Cucumis)一年蔓生的草本植物。黄瓜作为世界十大重要的蔬菜作物之一，黄瓜不仅作为重要的蔬菜作物历来备受育种家的重视，而且因其花性型多样，也是遗传研究的一个模式植物。黄瓜植株茎、叶、卷须、花萼、子房表面均覆有短刚毛，果实均有刺，多数子房表面有瘤状突起，瘤上有刺。黄瓜叶片上的刚毛和果实上的果刺均为多细胞无腺体的表皮毛。果实是黄瓜经济性状最重要的部分，随着人们生活水平的提高，品质育种已提到重要位置。外观光滑的黄瓜污染少，清洗方便，食用卫生，受消费者喜爱，是无公害蔬菜的理想品种。经检测表明：无瘤少刺黄瓜果肉农药残留量比有刺黄瓜低27％，果皮农药残留量低18％。

模式植物拟南芥的表皮毛为单细胞无腺体的表皮毛，由于其具有简单的结构和易观察的优点，目前，拟南芥表皮毛的形成已经成为研究细胞形态建成的模式系统。在拟南芥中表皮细胞发育成表皮毛细胞的进程涉及由三个转录因子组成的复合物的正调控和一个抑制因子的负调控。其中两个转录因子的突变都会引起植株表皮毛的缺失，第一个是GLABRA1(GL1)，它是一个R2R3类型的MYB家族的转录因子；第二个是TRANSPARENT TESTA GLABRA1(TTG1)，它编码一个WD40repeat的蛋白，同时还影响着其它几个代谢途径，包括花青素代谢途径、种皮黏液的产生及根毛发育的途径。植物璀璨花色的本质是花瓣中含有特定色素。花青素是一种最重要的类黄酮花色素，是呈现红、粉、紫、蓝等颜色的主体色素。花青素代谢途径主要包括6个结构酶：查耳酮合酶，查耳酮异构酶，黄烷酮-3-羟化酶，二氢黄酮醇还原酶，花青素苷元合酶和尿苷二磷酸-葡萄糖-类黄酮-3-葡糖基转移酶。而TTG1基因调控黄烷酮-3-羟化酶合成。

这两个转录因子与GLABRA3(GL3)互作而形成复合物，GL3的突变表现为植株表皮毛的减少，它是一个BHLH家族的转录因子。近几年，对棉花纤维形成的研究也证实了在棉花中存在着相同的分子机制。但是GL1基因在多细胞表皮毛的烟草中过量表达，却并不影响其表皮毛的形成。此外，玉米的R-like BHLH转录因子能在拟南芥叶和茎中产生额外的表皮毛，但是它也不能影响具有多细胞表皮毛的烟草、矮牵牛和番茄表皮毛的形成。这些证据表明拟南芥、棉花代表的单细胞表皮毛形成的分子机制和多细胞表皮毛形成的分子机制有相似和不同之处。因此，还需要在更多的其它植物种类上研究分析表皮毛形成的机制。

经对现有技术文献检索中发现：杂志《Plant Cell(植物细胞)》，在1999，11：1337-1349发表了文章“The TRANSPARENT TESTA GLABRA1 Locus，WhichRegulates Trichome Differentiation and Anthocyanin Biosynthesis inArabidopsis，Encodes a WD40 Repeat Protein(拟南芥TTG1位点编码一个WD40重复蛋白，调控表皮毛分化和花青素合成)”该文献虽然对TTG1基因在拟南芥中的重要作用做了说明，但是TTG1基因在黄瓜果刺这种多细胞表皮毛植物中是否存在，并且对黄瓜TTG1基因的研究从未见报道，由于TTG1基因不仅控制表皮毛的形成，而且还控制花青素合成，所以该基因可以利用基因工程技术对黄瓜果刺性状进行改良和对植物花色改良。

发明内容

本发明目的在于在于克服现有技术中的不足，提供一种黄瓜TTG1-like基因的蛋白编码序列。本发明公开了与拟南芥TTG1基因78％同源的黄瓜TTG1-like基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列，也公开了在利用基因工程技术对黄瓜品质改良和花色改良中的应用。利用同源克隆的方法，在黄瓜中克隆与拟南芥决定表皮毛起始的TTG1同源的基因，不仅将有利于理解植物表皮毛形态建成的分子机制，而且也将会有助于认识黄瓜果刺这个重要品质基因形成的分子机理，为黄瓜品质育种提供理论依据，加快品种育种进程。该基因同时调控花青素合成，也可以应用于植物花色的改良。

本发明是通过以下技术方案实现的：在本发明所分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有黄瓜TTG1-like基因的蛋白质活性的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核酸第160-1158位的核苷酸序列有70％的同源性；或者所述核苷酸序列能在45-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第160-1158位的核苷酸序列杂交。

本发明所分离出的黄瓜TTG1-like蛋白编码序列多肽，它包括：具有SEQ IDNO.4氨基酸序列的多肽、或者保守性变异多肽、或者活性片段，或者活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

本发明还提供了一种真核植物表达载体，它包含上述的DNA分子。一种核酸分子，它包含所述地DNA分子中8-100个连续核苷酸。

本发明还提供了一种用上述DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞，在实例中该宿主细胞是拟南芥。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“黄瓜TTG1-like基因蛋白编码序列”指编码具有活性多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第160-1158位的核苷酸序列及其兼并序列。该兼并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第160-1158位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的兼并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的兼并性，所以与SEQ ID NO.3中第160-1158位核苷酸序列同源性低至约70％的兼并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件(55-65℃)下，更佳的在高度严紧条件(65℃以上)下与SEQ IDNO.3中从核苷酸第160-1158位的核苷酸序列杂交地核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第160-1158位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的黄瓜TTG1-like蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)；若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5’或3’添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“黄瓜TTG1-like蛋白或多肽”指具有黄瓜黄瓜TTG1-like蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然黄瓜TTG1-like蛋白相关相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)；若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入或取代，以及在N末端或C末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括黄瓜TTG1-like蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的黄瓜TTG1-like多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然变异体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与黄瓜TTG1-like相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用黄瓜TTG1-like多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“黄瓜TTG1-like保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近地氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                             表1

                         表2

Query：黄瓜TTG1-like蛋白的氨基酸序列

Sbjct：拟南芥TTG1的氨基酸序列(genebank序列号为：NM_122360)

表2为本发明的黄瓜TTG1-like蛋白与拟南芥TTG1蛋白的氨基酸序列的同源性比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

                             表3

Query：黄瓜TTG1-like蛋白的氨基酸序列

Sbjct：棉花TTG1的氨基酸序列(genebank序列号为：AAM95641)

表3为本发明的黄瓜TTG1-like蛋白与棉花TTG1蛋白的氨基酸序列的同源性比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

发明还包括黄瓜TTG1-like蛋白或多肽的类似物。这些类似物与黄瓜TTG1-like蛋白相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生物形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、粘粒等。在生产本发明的黄瓜TTG1-like蛋白时，可以将黄瓜TTG1-like基因的编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成黄瓜TTG1-like基因的表达载体。

如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列地某些部分能够影响同一线性DNA序列其它部分地活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽地分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列地转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用地真核宿主细胞包括酵母细胞、拟南芥、烟草细胞和其它植株细胞。

可用半定量RT-PCR技术分析黄瓜TTG1-like基因产物地表达，即分析黄瓜TTG1-like基因的RNA转录产物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有黄瓜TTG1-like核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码黄瓜TTG1-like基因相关地核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在黄瓜TTG1-like基因相关核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于黄瓜TTG1-like基因相关核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为18-30个核苷酸。

此外，根据本发明的黄瓜TTG1-like基因核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选黄瓜TTG1-like基因相关同源基因或同源蛋白。

为了得到与黄瓜TTG1-like基因相关基因的黄瓜cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选黄瓜cDNA文库，这些探针是在低严谨条件(45-55℃)下，用³²P对黄瓜TTG1-like基因相关的全部或部分序列做放射性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自黄瓜的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库可以购买到，例如可购于Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.公司。这种筛选方法可以识别与黄瓜TTG1-like基因相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的黄瓜TTG1-like基因相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法、人工合成的方法获得。对于PCR扩增，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA文库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后地宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的黄瓜TTG1-like基因的蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与黄瓜TTG1-like基因发生相互作用的物质，或者受体、抑制或拮抗剂等。本发明在黄瓜品质改良中具有重要作用，同时，由于该基因是花青素合成途径的关键酶，对花色的改良也具有一定的应用价值。

附图说明

图1为用Bar基因对转基因植株的PCR检测。

其中：M为100bp的DNA marker，1为阴性对照，2为拟南芥Ler野生型的DNA，3为拟南芥ttg1突变体的DNA，4和5为转基因植株的DNA，6为阳性对照。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、黄瓜TTG1-like基因的克隆

一、组织分离

普通黄瓜品种申绿64(市售产品)，该品种属于欧洲温室类型的黄瓜，其表现为全雌、有果刺、无果瘤。将黄瓜种子播与温室的穴盘中，待植株长到两叶一心时，准备抽取DNA或RNA。

二、RNA的分离

取部分组织，用液氮研磨后装入1.5ml离心管中，加入Trizol后，充分振荡，用RNA提取试剂盒(上海生工UNIQ-10柱式总RNA抽取试剂盒，产品号：Cat.No.SK1361)抽取总RNA，抽取步骤及试剂详见试剂盒说明。用甲醛变性凝胶电泳检测总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

三、基因的全长克隆

根据拟南芥AtTTG1基因和棉花GhTTG1基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法进行cDNA全长克隆，分三步进行：

1、RT-PCR

以黄瓜总RNA为模板，采用Smart Race cDNA扩增试剂盒(SMART^TM RACE cDNAAmplification Kit，购于CLONTECH公司)进行反转录cDNA第一链，反转录步骤参照该试剂盒的用户手册。在反转录反应中，同时包含SMART primer和5’、3’-RACE CDS的引物，反转录合成完整的cDNA第一链，即一个RT反应可分别用于5’和3’-RACE。反转录产物10μl加入40μlTE混匀，保存于-20℃备用。用兼并引物CsWD1-F(SEQ ID NO.1)和CsWD1-R(SEQ ID NO.2)对黄瓜S06的cDNA进行PCR得到606bp的序列，回收连接到pUCm-T载体(购于上海申能博采公司)上，电击转化E.coli DH5α的感受态细胞(购于大连宝生物工程有限公司)，具体方法如下：吸取1ml SOB培养基置于灭菌的1.5ml的eppendorf管；取50μl感受态细胞，放入灭菌的100μl eppendorf管；取1μl连接产物加入盛装感受态细胞的eppendorf管，混匀；将加有连接产物的感受态细胞加入电击杯(规格为：2mm)，2500v电击转化；电击后将菌液洗到1ml SOB培养基中，37℃，250r/min培养1h。将菌液均匀涂布于LB固体培养基的平板上，该培养基含：氨苄100mg/ml，IPTG和x-gal。涂好的平板倒置于37℃培养箱培养过夜。用灭过菌的牙签将平板上显示为白色的菌落挑到2ml含氨苄(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃，250r/min培养2h后进行菌液PCR，剩余菌液继续在37℃，250rmp/min培养过夜。菌液PCR的反应体系为：M13引物0.1μmol/L，dNTPs200μmol/L，1×Taq Buffer，2.0mmol/L MgCl₂，0.5U Taq DNA聚合酶(上海Promega公司产品)，菌液1μl，总反应体系为10μl。菌液PCR的反应程序为：94℃2min；25cycles，94℃30s；50℃30s，72℃45s；72℃5min。反应产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，将扩增出预期大小片段的菌液送由上海生工进行测序。测序结果用BLAST程序在NCBI数据库上进行比对，得到其与拟南芥TTG1基因和棉花GhTTG1基因同源性分别为78％和79％，故初步认为它是一个控制植物表皮毛起始的基因。

2、3’-RACE

根据已获得的RT-PCR产物，设计并合成了两个3’-RACE的基因特异引物，分别为CsWD2-F(5’-GTG TGG TGG AAA CCC AGT TCA TAG C-3’)和nCsWD2-F(5’-TTG CTT CTG TTT CCG CTG ATG GGT C-3’)，用于扩增上一步得到片段的3’末端序列。

利用为CsWD2-F为正向引物与SMART试剂盒提供的5’-&3’-RACE通用引物UPM(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)为反向引物相组合，以cDNA为模板进行3’端扩增，混匀后，3’-RACE PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃90s，30个循环，；72℃8min。反应结束后，以此PCR反应液为模板进行巢式PCR扩增，用nCsWD2-F做正向引物，SMART试剂盒提供的5’-&3’-RACE的NUP(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)作为反向引物。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃90s，35个循环；72℃8min。将所得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收。最后得到一个751bp的片段，将片段连接到pUCm-T载体上，电击转化E.coli DH5α的感受态细胞(购于大连宝生物工程有限公司)，经PCR鉴定后测序。测序结果在NCBI数据库上用BLAST程序进行比对，得到其与拟南芥TTG1基因和棉花GhTTG1基因同源性很高，因此，它是一个控制植物表皮毛起始的TTG1类似基因。

3、5’-RACE

根据已获得的RT-PCR产物和3’-RACE产物，设计并合成了2个5’-RACE基因特异引物CsWD2-R(5’-ATG CCA GTC TGA GCA AAG GGG TAT C-3’)和nCsWD2-R(5’-CGA AAA TCC TTA CCG ACC CAT CAG C-3’)作为5’-RACE的反向引物。正向引物为试剂盒中提供的5’-&3’-RACE的UMP和NUP(引物序列见前面所述)。以cDNA为模板，反向特异引物CsWD2-R并和试剂盒提供的通用引物UPM配对，进行目的基因的5’端扩增。5’-RACE PCR反应条件如下：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃90s，30个循环；72℃8min。反应结束后，以此PCR反应液为模板进行巢式PCR扩增，用nCsWD2-R做反向引物，NUP作为正向引物。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃90s，35个循环；72℃8min。将所得的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后回收，得到一个779bp的片段。将片段连接到pUCm-T载体上，电击转化E.coli DH5α的感受态细胞(购于大连宝生物工程有限公司)，经菌液PCR鉴定后测序。

将3’和5’-RACE测序得到的序列，用Vector NTI 8.0软件进行序列拼接获得cDNA全长序列，BLAST的结果证明这个从黄瓜中得到的新基因为一个与拟南芥AtTTG1基因同源的基因。通过上述三个步骤，获得了候选的黄瓜TTG1-like基因全长cDNA序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2、黄瓜TTG1-like基因的序列信息与同源性分析

本发明得到的黄瓜TTG1-like基因是一个新的基因，cDNA全长为1414bp，序列见SEQ ID NO.3，其中开放阅读框位于160-1158位核苷酸共999个核苷酸。根据全长的cDNA序列推导出黄瓜TTG1-like基因的氨基酸编码序列，共333个氨基酸，分子量为37192.27道尔顿，等电点为4.95。详细序列见SEQ ID NO.4。

将黄瓜TTG1-like基因编码的蛋白质序列用BLAST程序在NCBI进行蛋白质同源性比对，发现它与拟南芥基因AtTTG1基因在蛋白质水平上具有78％的同源性(附表2)，和棉花GhTTG1基因也为78％的同源性(附表3)，这两个基因都已被证明具有控制表皮毛起始的功能，证明黄瓜TTG1-like基因在表皮毛形成方面也具有相似的功能。

实施例3、黄瓜TTG1-like基因的蛋白在拟南芥ttg1突变体中进行真核细胞表达及转基因植株功能验证

一、含黄瓜TTG1-like基因的植物表达载体的构建

根据黄瓜TTG1-like基因的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整的编码框引物，并结合表达载体的多克隆位点，在上游和下游引物上分别加入HindIII和BamH I两个限制性内切酶位点(上游引物eCsTTG1-F序列为5’-CTTCAAGCTTGGAATCGAACACGCAGC-3’；下游引物eCsTTG1-R序列为5’-CTCGGATCCCAAACTTAAAGCTGCATT-3’)，以方便构建表达载体。以实施例1中获得的cDNA为模板，经PCR扩增后，用1％琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒(上海生工UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，产品号：Cat.No.SK1132)回收，在37℃用HindIII和BamH I酶切过夜。同时将植物表达载体pEZT-NL质粒进行相同的酶切反应，按照载体和目的片段3∶1(摩尔浓度比)的比例用T4连接酶16℃进行连接过夜。

二、构建好的表达载体转化拟南芥ttg1突变体

在保证阅读框正确的前提下鉴定好的表达载体，将其电击转化入农杆菌(Agrobacterium)GV3101的感受态细胞(购于大连宝生物工程有限公司)中，利用花浸润方法转化拟南芥ttg1突变体，转化方法及农杆菌的使用参照文献《植物杂志》1998年发表的文章“花浸润：一种简单的农杆菌介导的转化拟南芥的方法”(Steven J.Clough and Andrew F.Bent Floral dip：a simplified methodfor Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.ThePlant Journal，1998，16：735-743)该突变体由美国拟南芥研究中心(ABRC)提供，编号为CS89。

1、植物生长

拟南芥植株生长在培养室中，保持恒温在23℃，光周期为白天18h，黑暗6h。在直径7厘米的培养杯里种5处，每处种3棵，先将培养杯放入4℃冰箱中春化48h，然后置于培养室中。种子出苗一周后，每处只留下一棵最好的苗。将植物培养至茎高约3厘米时，去除其顶生花序。注意要避免伤及叶生花序。去除顶生花序将刺激叶生花序的生长。转化必须在去除顶生花序4天后进行。转化前，将已授粉花以及果荚去除掉，并使土壤吸足水。

2、转化操作

将鉴定好的连接黄瓜TTG1-like基因的植物表达载体，电击转化入农杆菌，并制备相应菌液10ml，在转化前一天，将菌液转入含有200ml LB液体培养基(配方100ml：蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，Nacl1g)的三角瓶中，置于28℃培养过夜，第二天使用时，农杆菌液OD₆₀₀＝1.2～1.6。室温5000rpm离心15分钟，弃上清。将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使OD₆₀₀＝0.8左右。渗透培养基(1L)配方为：1/2倍的MS培养基；5％蔗糖；0.5克MES；用KOH调至pH5.7，再加入10微升的6-BA溶液(1mg/ml)，200微升Silwet L-77。将植株倒置，让花序浸入渗透培养基中5s后取出，用草纸吸干多余的液体，暗培养一天。培养3到4周后，收种子并放在干燥环境存放2周。

3、转化植株筛选

将转化后的种子春化48h后，均匀撒播在培养盒中，等到出苗后一周，用小喷壶喷洒除草剂Basta(1∶1000稀释)，让每个植株都能沾上除草剂。两天后再喷洒一次，共三次。因为pEZT-NL质粒带有Bar基因，所以转化成功的植株就带有除草剂的抗性，而未转化成功的植株就被除草剂杀死。最后获得转基因植株，因为ttg1突变体没有表皮毛，所以转基因植株表现表皮毛表型的恢复。

4、转基因植株的鉴定

拟南芥的TTG1基因已被证明影响植株表皮毛的起始，还影响着其它几个代谢途径，包括花青素代谢途径、种皮黏液的产生及根毛发育的途径。黄瓜的TTG1-like基因在蛋白质水平与拟南芥的TTG1基因具有较高的同源性，可进一步从表型对转基因植株进行鉴定。转基因植株后代表现为具有表皮毛，并且种皮颜色恢复为褐色(突变体为黄色)。

利用载体上Bar基因的序列设计了一对引物检测转基因植株，将转基因植株和ler野生型、ttg1突变体用CTAB法提取基因组DNA，用Bar基因引物扩增，PCR产物为161bp。用2.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果为转基因植株有预期大小的扩增产物，而对照ler野生型和ttg1突变体都没有扩增条带(如图1所示)。证明转基因植株表型的恢复是黄瓜TTG1-like基因表达引起的。证明黄瓜TTG1-like基因具有与拟南芥TTG1基因相同的功能。

实施例4、黄瓜TTG1-like基因在黄瓜中的拷贝数分析

采用CTAB方法(Clark M S.Plant molecular Biology-A Laboratory Manual.Heidelberg：Springer-Verlag Berlin，1997.4～6)从黄瓜叶片中提取基因组DNA，用HindIII 37℃酶切10μg基因组DNA过夜，向植物DNA酶解液中加入5μl溴酚蓝混匀，取标准分子量DNA样品2μl，上样，用1％的琼脂糖凝胶分离，25V电泳16小时(1V/cm)。电泳后的凝胶在转膜印迹前进行以下几个步骤：脱嘌呤，将凝胶放入250mM HCl，室温搅动10min；变性，将凝胶放入变性溶液(1.5M NaCl，0.5MNaOH)中，室温搅动25min；中和，将凝胶放入中和溶液(1.5M NaCl，0.5MTris-Cl，pH＝7.5)中，室温搅动30min。在每一处理中间均要用蒸馏水进行漂洗。随后的转膜印迹的方法参考《分子克隆实验指南第二版》(J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南第二版.北京：科学出版社，1999，474-490)。将DNA转移至尼龙膜上后，使用安法玛西亚(Amersham Pharmacia)公司的Gene Images^TM Contents CDP-Star^TM labelling module试剂盒(产品号为PRN3540)，将黄瓜TTG1-like基因编码区标记为探针，然后进行杂交(60℃杂交16h)，取出膜，置于洗膜液I(1×SSC，1％SDS)中，60℃漂洗3次，每次15min。转入洗膜液II(0.1×SSC，1％SDS)中，60℃漂洗3次，每次15min。用X光片压片90min，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。Southern blot结果发现在杂交膜上出现两条带，说明该基因在黄瓜中拷贝数为2。

实施例5、黄瓜TTG1-like基因在黄瓜中的组织表达

1、RNA的提取：将生长了3～5片叶的黄瓜幼苗的花芽、顶芽、根、茎、叶取下，按照上面提到的方法提取RNA，并用RNase-free DNase酶进行处理，除去RNA中的基因组DNA，然后进行定量。

2、反转录cDNA第一链：以黄瓜各组织的RNA为模板，(T)₂₅(A/C/G)(A/C/G/T)为引物进行，其余过程同上，反转录产物10μl加入40μlTE混匀，保存与-20℃备用。

3、半定量RT-PCR分析：在黄瓜TTG1-like基因的编码区设计一对特异引物，采用2×Hotstart Taq PCR MasterMix(购于TIANGEN公司)进行RT-PCR分析。PCR体系：1μl反转录产物，0.25μml/L正反向引物，1×Hotstart TaqPCR MasterMix，总体系为20μl。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃1min，30个循环；72℃5min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。以Actin为内参，在凝胶成像系统上观察条带的亮度。

4、半定量RT-PCR结果显示，黄瓜TTG1-like基因在黄瓜的各个组织中均有表达，且差异不明显。

本发明涉及的序列及记号分别如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：19bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.1

A(C/T)AA(C/T)AG(C/T)AA(A/G)AC(G/C/T)AGCGA

(2)SEQ ID NO.2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：18bp

(B)类型：核苷酸

(C)链性：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸

(iii)序列描述：SEQ ID NO.2

CA(G/C)G(C/T)TG(C/T/A)G(A/C)AG(A/C)AGACC

(3)SEQ ID NO.3的信息

<110>上海交通大学

<120>黄瓜TTG1-like基因的蛋白编码序列

<160>2

<210>1

<211>1414

<212>DNA

<213>黄瓜(Cucumis sativus L.)

<221>CDS

<222>(160)…(1158)

<400>1

(4)SEQ ID NO.4的信息

<210>2

<211>333

<212>PRT

<213>黄瓜(Cucumis sativus L.)

<400>2