环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法

摘要

一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法，用于测定微生物。本发明的试剂盒由一套设计的引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。采用本发明可以定性定量检测刚地弓形虫。本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备。因此具有特异性、敏感性高和检测时间比普通PCR短的特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于测定微生物的试剂盒和检测方法，具体涉及一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法。

背景技术

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii，TOX)是猫科动物的肠道球虫，由法国学者Nicolle及Manceaux在刚地梳趾鼠的脾脏单核细胞内发现，虫体呈弓形，故命名为刚地弓形虫，该虫呈世界性分布，人和许多动物都能感染。传统的检测方法有形态学诊断、免疫学检测等。其中形态学的诊断方法最为可靠，但费时且易漏检；免疫学方法并非直接检测病原体，敏感性较低且特异性不足。以核酸扩增(Polymerase Chain Reaction，PCR)为基础的分子生物学技术的迅速发展，为弓形虫的检测提供了一种快速、灵敏的方法，但普通PCR假阳性太高，不适合临床使用，荧光定量PCR具有灵敏、准确的优点，但采用TaqMan探针法费用较高，采用荧光染料SYBR Green I可能与非特异性双链DNA结合容易产生假阳性。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)不需PCR经过的变性、复性、延伸三个阶段，可在等温条件下1小时内将目的序列扩增10⁹倍以上，因此不需特殊设备，检测时间更短、敏感性更高；同时4条特异性引物识别靶基因的6个特定区域，特异性更高，因此在微生物检测上明显优于PCR(Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，etal.Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res，2000，28：E63.)。

发明内容

本发明目的是提供一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒及方法，解决了普通PCR存在的假阳性高和荧光定量PCR存在的费用高的问题。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其序列为：

外引物1：GGGAATGAAAGAGACGCTAA

外引物2：CTGTGTACCTCTTCTCGTATT

内引物1：TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC

内引物2：ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG

其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1∶6～9。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种环介导等温扩增检测刚地弓形虫的试剂盒，其特征在于：由一套引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成；所述的一套引物是由一对外引物和一对内引物组成，其序列为：

外引物1：GGGAATGAAAGAGACGCTAA

外引物2：CTGTGTACCTCTTCTCGTATT

内引物1：TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC

内引物2：ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG

其中，所述的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比为1∶6～9；所述的DNA聚合酶为具有链置换作用的Bst DNA聚合酶，活力为8个活性单位/微升；所述的阳性对照为含有插入刚地弓形虫一段特异序列的阳性质粒，环介导等温扩增反应扩增区位于该特异序列中，其浓度为10⁷拷贝/μl；所述的阴性对照为灭菌双蒸水；所述的显色剂为20倍SYBR Green I。

1、上述方案中，所述的10倍环介导等温扩增反应液(通常用“10×LAMP反应液”的形式来表示，数字“10”表示的是使用时稀释的倍数)是由200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、40～100mM硫酸镁、4～10M甜菜碱、5～18mM的dNTPs、和1％质量百分浓度的曲拉通X-100组成。

2、上述方案中，所述的阳性质粒的制作方法为采用PCR扩增一段刚地弓形虫基因特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化至DH5α感受态细菌，抽取质粒DNA经序列确定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至10⁷拷贝/μl。

3、上述方案中，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。

4、上述方案中，所述的mM是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数。

5、上述方案中，所述的SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料，SYBR Green I与双链DNA的亲和力非常高。对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。

本发明工作原理是：环介导等温扩增反应过程是先由外引物扩增出内引物扩增所需要的模板即起始反应物模板的合成；紧接着由内引物引导合成靶基因DNA片段，由于内引物扩增的DNA片段含有该引物5，端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构，另外一条内引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到10⁹拷贝，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状条带，也可通过荧光染料来观察扩增结果。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：

1、本发明利用Bst DNA酶的链置换特性，设计4条引物，识别靶序列的6个区域，在等温条件下生成大量重复的茎环状结构，在定性检测时不需任何特殊设备。

2、本发明的特异性、敏感性均高于普通PCR技术。

3、本发明由于不需经过PCR技术的3个温度的重复循环，检测时间比PCR短。

4、本发明的结果判断不需经电泳，比PCR简单，极易推广。对于定量检测，虽然借助了荧光定量PCR仪，但不需合成荧光探针，只需借助荧光染料SYBR Green I，成本大大减低。

5、本发明的反应温度在60℃～65℃左右，且识别靶基因6个特定区域，引物多聚体及非特异性扩增几率大大降低，定量准确性大大提高。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：一种环介导等温扩增定性检测刚地弓形虫的方法，该方法采用的试剂盒由一套引物、10倍LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。引物的序列为：

外引物1：GGGAATGAAAGAGACGCTAA

外引物2：CTGTGTACCTCTTCTCGTATT

内引物1：TGCACAGATACTCATGAATTTCACTGTTTGCATAGGTTGCAGTC

内引物2：ACTTTGGTGTATTCGCAGATTGGTTCACGATCTTCTTCTCCTG

其中，一对外引物的摩尔数为5pmol，一对内引物的摩尔数为30pmol(摩尔数之比为1∶6)。10×LAMP反应液由200mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCL)、100mM氯化钾(KCL)、100mM硫酸铵((NH₄)₂SO₄)、80mM硫酸镁(MgSO₄)、8M甜菜碱(Betaine)、14mM的dNTPs、和1％的曲拉通X-100(Triton X-100)组成。所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，8个活性单位/微升。阳性对照为含有插入刚地弓形虫一段特异序列的阳性质粒，LAMP反应扩增区位于该特异序列中，浓度为10⁷拷贝/μl。阴性对照为灭菌双蒸水。所述的显色剂为20倍SYBR Green I应用液(20×SYBRGreen I)。

定性检测刚地弓形虫按照下列步骤进行：

(1)、酚-氯仿-异戊醇法提取刚地弓形虫DNA，保存于25μl TE中。

(2)、加样：在0.5ml Eppendorf管中加入以下试剂

10×LAMP反应液(采用实施例一中的试剂盒)        2.5μl

一对外引物                                    5pmol

一对内引物                                    30pmol

提取的刚地弓形虫DNA                           5μl

灭菌双蒸水                                    补至24μl

(3)、反应：于95℃变性5分钟，冷却至室温后加1μlBstDNA酶，水浴锅中60～65恒温反应1小时。

(4)、结果判断：反应结束后加1μl显色剂，于紫外灯下观察，反应液的颜色变为绿色说明检测结果阳性，并与阳性对照和阴性对照进行比较。

本实施例中的一对外引物与一对内引物的摩尔数之比可以选择1∶7、1∶8或1∶9。10×LAMP反应液中的硫酸镁的摩尔浓度可以选择40mM、60mM或者是100mM。甜菜碱的摩尔浓度可以选择4M、7M或者是10M。dNTPs的摩尔浓度可以选择6mM、10mM或者是18mM。

实施例二：一种环介导等温扩增定量检测刚地弓形虫的方法，由一套引物、10×LAMP反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂组成。引物的序列与实施例一相同，一对外引物和一对内引物的摩尔数之比为1∶8。10×LAMP反应液中的硫酸镁(MgSO₄)为85mM 200mM，甜菜碱(Betaine)为7M、dNTPs为16mM，其它药品的摩尔浓度与实施例一相同。DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照和显色剂也与实施例一相同。

定量检测刚地弓形虫按照下列步骤进行：

(1)、酚-氯仿-异戊醇法提取刚地弓形虫DNA，保存于25μlTE中。

(2)、标准曲线制作：取阳性对照质粒，按10倍倍比稀释成10⁷～10³的浓度梯度，在最佳反应条件下用Bio-Rad的iCycler iQTM荧光定量PCR仪同时扩增，以拷贝数的对数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。

(3)、加样：在0.2ml薄壁管中加入以下试剂

10×LAMP反应液                    2.5μl

一对外引物                        5pmol

一对内引物                        40pmol

提取的刚地弓形虫DNA               5μl

显色剂                            0.2μl

灭菌双蒸水                        补至24μl

(4)反应：于95℃变性5分钟，冷却至室温后加1μl BstDNA酶，于Bio-Rad的iCycler iQTM荧光定量PCR仪上60～65℃恒温反应45分钟。

(5)根据样品的Ct值，通过与标准曲线比较，确定样品的起始拷贝数。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。