抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质及其制备方法和应用

摘要

本发明公开一类医药技术领域的抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质及其制备方法和应用，其中R

说明书

技术领域

本发明涉及一种医药技术领域的化合物及其制备方法和应用，具体是一类抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是当今人类死亡主要病因之一，2005年全世界5800万死亡总数中，癌症占13％(760万)，预计全世界癌症死亡还将继续增加，到2015年将有900万人死于癌症，至2030年死于癌症的人数将达1140万人。由于疗效、多药耐药性、副作用等多重原因，研发新的抗肿瘤药物非常必要。海洋无脊椎生物，特别是海绵丰富的化学多样性为抗肿瘤药物研究提供了良好的途径。

经对现有技术的文献检索发现，Jesse Cohen等在《药学生物学》(Pharmaceutical Biology)2004年第一期59-61页上发表的“6-Hydroxydiscodermindole，A New Discodermindole from the Marine SpongeDiscodermia polydiscus”(海绵Discodermia polydiscus中一种新的底斯考登吲哚，6-羟基底斯考登吲哚)，该文中提出从海绵Discodermia polydiscus中制备抗肿瘤化合物Discodermindole，具体方法为：海绵原料经乙醇提取，正丁醇萃取，C₁₈反相高效液相色谱柱分离制备化合物Discodermindole，并报告该化合物对肿瘤细胞P388，A-549的半数有效浓度IC₅₀。其不足在于：没有针对HT-29(人结肠癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、MM96L(人黑色素瘤细胞)的活性数据，人肺癌细胞A-549的活性数据不具体，仅用IC₅₀＞5mg/mL表示。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质，使其可以作为抗结肠癌、肺癌、黑色素瘤和乳腺癌活性的药物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明所涉及的抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质，其结构式如下式(I)所示：

其中：R¹为卤素，R²、R⁴为氢、羟基或烷氧基，R³为氢或烷基。

本发明所涉及的抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质的制备方法，包括如下步骤：

第一步，提取：将原料海绵Trachycladus sp.(鲜品)浸泡于3-8倍量(重量)的乙醇中，提取20小时以上，重复提取，合并提取液，减压回收乙醇得浸膏，浸膏悬浮于水中，用石油醚脱脂，水相用正丁醇萃取，正丁醇部分减压回收溶剂，得提取物。

所述乙醇，其体积浓度为95％。

所述重复提取，其次数为2-4次。

所述用石油醚脱脂，其次数为2-3次。

第二步，分离：上述提取物，经Sephadex LH₂₀柱色谱初步分离后，各组分直接通过RP-3半制备高效液相色谱分离纯化，二极管阵列紫外检测器(DAD)检测，水∶甲醇(90∶10，V/V)-甲醇梯度洗脱直接制备，或进一步通过氰基半制备高效液相色谱(RP-CN)分离纯化，二极管阵列紫外检测器(DAD)检测，乙睛-水溶剂系统洗脱，得到纯品。

本发明所涉及的抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质的应用，是指应用于制备治疗肿瘤药物。

本发明对通式(I)所示化合物进行了体外抗肿瘤试验，表明其具有明显的抑制肿瘤的效果。试验所用细胞株为国际通用的肿瘤细胞株：

A-549(人肺癌)

HT-29(人结肠癌)

MDA-MB-231(人乳腺癌)

MM96L(人黑色素瘤)

试验方法为国际通用的SRB(磺基罗丹明，sulforhodamine)法：根据细胞生长速率，将处于对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔培养板，贴壁生长24小时，加不同浓度受试化合物，每个浓度设三复孔，并设相应浓度的生理盐水溶媒对照及无细胞凋零孔。肿瘤细胞在37℃、5％CO₂条件下培养72小时，倾去培养液，用TCA固定1小时，用蒸馏水洗涤5次，空气干燥，加入SRB染色15分钟，醋酸洗涤5遍，Tris缓冲液溶解，酶标仪490nm波长下测OD值以估计细胞数目，计算50％生长抑止浓度(GI₅₀)。试验结果，通式(I)所示化合物对A-549、HT-29、MDA-MB-231、MM96L肿瘤细胞株的GI₅₀)分别为1.0-20.0μM，0.5-14.0μM，1.0-15.0μM，2.0-37.0μM。

上述结果表明：通式(I)所示化合物对四种肿瘤细胞生长有明显程度的抑制效果。

本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了一类新的先导化合物，对海洋生物资源海绵Trachycladus sp.的开发利用有重要价值。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

本发明化合物中，当R¹为溴，R²，R⁴为氢或羟基，R³为氢，甲基时，构成的抗肿瘤活性海洋吲哚生物碱类物质为特齐克拉吲哚甲-己(Trachycladindoles A-F)，特齐克拉吲哚甲-己(Trachycladindoles A-F)从海绵Trachycladussp.中获得。如下所示。

1R¹＝Br R²＝R³＝R⁴＝H

2R¹＝Br R²＝R⁴＝H R³＝Me

3R¹＝Br R²＝OH R³＝R⁴＝H

4R¹＝Br R²＝OH R³＝Me R⁴＝H

5R¹＝Br R²＝H R³＝Me R⁴＝OH

6R¹＝Br R²＝R⁴＝OH R³＝Me

实施例1

Trachycladindole A(1)

海绵Trachycladus sp.1.0kg，加4.0kg乙醇浸泡96小时，重复提取2次，过滤，合并提取液，减压浓缩得浸膏(1.8g)。全部浸膏用水悬浮，加石油醚脱脂2次后，水相加正丁醇(1∶1，V/V)萃取，正丁醇萃取液减压蒸干得提取物300mg，经Sephadex LH₂₀柱色谱分离，得到A(60mg)，B(150mg)，C(50mg)，D(30mg)，E(10mg)五个组分。

其中，组分A经RP-3半制备反相高效液相色谱分离纯化，二极管阵列紫外检测器检测，甲醇-水(10-100％甲醇)梯度洗脱，得到Trachycladindole A(即以上的化合物1)，淡黄色粉末(8mg)，通过高分辨质谱、核磁共振等光谱鉴定结构，其光谱数据：

[α]_D²⁰+5.9(c 0.95，MeOH)；UV(MeOH)λ_maxnm(logε)225(2.92)，296(3.39).HRESI(+)MS m/z 337.0309([M+H]⁺，C₁₃H₁₄BrN₄O₂⁺requires 337.0295)，339.0293(C₁₃H₁₄⁸¹BrN₄O₂⁺)。¹Hnmr(CDCl₃，600MHz)δppm 2.73(3H，s)，3.69，4.06(各1H，dd，J＝8.0，8.0Hz)，6.38(1H，brs)，7.31(1H，dd，J＝9.0，2.0Hz)，7.40(1H，d，J＝9.0Hz)，7.60(1H，s)。¹³Cnmr(CDCl₃，150MHz)δppm 29.8(q)，48.5(t)，58.9(d)，112.6(s)，114.2(s)，115.6(d)，122.9(d)，127.5(d)，127.9(s)，135.6(s)，137.2(s)，160.4(s)，168.6(s)。

实施例2

Trachycladindole B(2)

实施例1中组分B经RP-3半制备反相高效液相色谱分离，甲醇-水(10-100％甲醇)梯度洗脱得到组分B-1，B-2，B-3。其中，B-1进一步用RP-CN半制备反相高效液相色谱，二极管阵列紫外检测器检测，乙腈-水溶剂系统分离得到Trachycladindole B(即以上的化合物2)，浅黄色粉末(4mg)，通过高分辨质谱、核磁共振等光谱鉴定结构，其光谱数据：

[α]_D²⁰+8.9(c 0.94，MeOH)；UV(MeOH)λ_maxnm(logε)225(3.1)，296(2.6).HRESI(+)MS m/z 373.0268([M+Na]⁺，C₁₄H₁₄NaBrN₄O₂⁺requires 373.0271)，375.0262(C₁₄H₁₄Na₈₁BrN₄O₂⁺)。¹Hnmr(CDCl₃，600MHz)δppm 2.75(3H，s)，3.10(3H，s)，3.70，4.06(各1H，dd，J＝8.0，8.0Hz)，6.30(1H，brs)，7.30(1H，dd，J＝9.0，2.0Hz)，7.39(1H，d，J＝9.0Hz)，7.56(1H，s)。¹³Cnmr(CDCl₃，150MHz)δppm 30.6(q)，32.5(q)，56.0(t)，57.2(d)，112.0(s)，114.2(s)，115.5(d)，122.9(d)，127.4(d)，127.9(s)，137.1(s)，159.8(s)，168.5(s)。

实施例3

Trachycladindole C(3)

实施例2中得到的组分B-2，进一步用RP-CN半制备反相高效液相色谱，乙腈-水溶剂系统分离得到Trachycladindole C(即以上的化合物3)，浅黄色粉末(7mg)，通过高分辨质谱、核磁共振等光谱鉴定结构，其光谱数据：

[α]_D²⁰+2.9(c 1.31，MeOH)；UV(MeOH)λ_maxnm(log)225(3.24)，245(3.04)，313(3.12)，320(3.10).HRESI(+)MS m/z 353.0253([M+H]⁺，C₁₃H₁₄BrN₄O₃⁺requires 357.0244)，355.0230(C₁₃H₁₄⁸¹BrN₄O₃⁺)。¹Hnmr(CDCl₃，600MHz)δppm 2.70(3H，s)，3.68，4.04(各1H，dd，J＝8.0，8.0Hz)，6.36(1H，brs)，7.00(1H，s)，7.55(1H，brs)。¹³Cnmr(CDCl₃，150MHz)δppm 29.7(q)，48.3(t)，58.9(d)，99.2(d)，106.0(s)，113.0(s)，121.2(s)，124.2(d)，135.4(s)，137.6(s)，152.3(s)，160.3(s)，169.2(s)。

实施例4

Trachycladindole D(4)

实施例2中得到的组分B-3，进一步用RP-CN半制备反相高效液相色谱，乙腈-水溶剂系统分离得到Trachycladindole D(即以上的化合物4)，浅黄色粉末(5mg)，通过高分辨质谱、核磁共振等光谱鉴定结构，其光谱数据：

[α]_D²⁰+7.5(c 1.02，MeOH)；UV(MeOH)λ_maxnm(logε)225(3.29)，245(2.85)，313(2.90)，320(2.88).HRESI(+)MS m/z 367.0398([M+H]⁺，C₁₄H₁₆BrN₄O₃⁺requires 367.0295)，369.0379(C₁₄H₁₆⁸¹BrN₄O₃⁺)。¹Hnmr(CDCl₃，600MHz)δppm 2.74(3H，s)，3.10(3H，s)，3.68，4.03(各1H，dd，J＝8.0，8.0Hz)，6.24(1H，brs)，6.98(1H，s)，7.49(1H，brs)。¹³Cnmr(CDCl₃，150MHz)δppm 30.5(q)，32.5(q)，55.9(t)，57.2(d)，99.4(d)，106.3(s)，112.2(s)，121.3(s)，124.1(d)，135.6(s)，152.5(s)，159.7(s)，169.0(s)。

实施例5

Trachycladindole E(5)

实施例1中组分C经RP-3半制备反相高效液相色谱，甲醇-水(10-100％甲醇)梯度洗脱得后，进一步用RP-CN半制备反相高效液相色谱分离，乙腈-水溶剂系统分离得到Trachycladindole E(即以上的化合物5)，浅黄色粉末(3mg)，通过高分辨质谱、核磁共振等光谱鉴定结构，其光谱数据：

[α]_D²⁰+11.6(c 0.48，MeOH)；UV(MeOH)λ_maxnm(logε)225(3.35)，296(2.90).HRESI(+)MS m/z 367.0408([M+H]⁺，C₁₄H₁₆BrN₄O₃⁺requires 367.0400)，369.039(C₁₄H₁₆⁸¹BrN₄O₃⁺)。¹Hnmr(CDCl₃，600MHz)δppm 2.79(3H，s)，3.12(3H，s)，5.26(1H，brs)，7.30(1H，dd，J＝9.0，2.0Hz)，7.39(1H，d，J＝9.0Hz)。¹³Cnmr(CDCl₃，150MHz)δppm 29.2(q)，30.1(q)，65.3(d)，86.5(d)，110.6(s)，114.3(s)，115.5(d)，122.4(d)，127.4(s)，127.7(d)，135.6(s)，137.5(s)，158.2(s)，168.2(s)。

实施例6

Trachycladindole F(6)

实施例1中组分D经RP-3半制备反相高效液相色谱分离，甲醇-水(10-100％甲醇)梯度洗脱，进一步用RP-CN半制备反相高效液相色谱分离，乙腈-水溶剂系统分离得到Trachycladindole F(即以上的化合物6)，浅黄色粉末(6mg)，通过高分辨质谱、核磁共振等光谱鉴定结构，其光谱数据：

[α]_D²⁰-4.8(c 0.94，MeOH)；UV(MeOH)λ_maxnm(logε)225(3.36)，245(3.13)，313(3.21)，320(3.18).HRESI(+)MS m/z 383.0349([M+H]⁺，C₁₄H₁₆BrN₄O₄⁺requires 383.0355)，385.0324(C₁₄H₁₆⁸¹BrN₄O₄⁺)。¹Hnmr(CDCl₃，600MHz)δppm 2.80(3H，s)，3.10(3H，s)，5.28(1H，brs)，6.94(1H，s)。¹³Cnmr(CDCl₃，150MHz)δppm 29.3(q)，30.2(q)，65.6(d)，89.8(d)，110.9(s)，106.4(s)，99.4(d)，123.6(d)，152.5(s)，135.6(s)，137.5(s)，158.0(s)，168.9(s)。

实施例化合物的抑制肿瘤细胞生长活性数据见表1.

表1.Trachycladindoles A-F对肿瘤细胞的抑制作用

GI₅₀：50％肿瘤生长抑制所需要受试化合物浓度。