表达人组织激肽释放酶的转基因莱茵衣藻的构建方法

摘要

本发明为一种表达人组织激肽释放酶的转基因莱茵衣藻的构建方法，首先根据人组织激肽释放酶基因序列和莱茵衣藻偏爱密码子表，设计适合于莱茵衣藻核基因组表达或叶绿体基因组表达或线粒体基因组表达的人组织激肽释放酶基因序列，并通过人工合成的方法合成该基因序列及人工合成含有非编码序列的人组织激肽释放酶基因，然后构建含有上述外源目的基因的莱茵衣藻核表达载体或莱茵衣藻叶绿体表达载体或莱茵衣藻线粒体表达载体，再通过遗传转化方法，转化到莱茵衣藻中，经过筛选，获得能表达人组织激肽释放酶的转基因工程藻株。本发明为利用转人源激肽释放酶基因莱茵衣藻及其加工产品对某些疾病如高血压、肾小球肾炎等进行预防和治疗奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及的是一种表达人组织激肽释放酶的转基因莱茵衣藻的构建方法。

背景技术

随着社会经济的发展，人民生活水平的提高，工作节奏的加快，使城市居民承受的压力越来越大。英国、美国和瑞典等国家最新的一项调查结果显示，2025年，全球将有15.6亿的人口患有高血压。2004年，我国国务院的一项调查报告显示，我国成人高血压的患病率为18.8％，估计全国有1.6亿人患有高血压，且每年新增300万人以上。高血压是一种常见的心血管疾病，是破坏心、脑、肾器官的“无形杀手”，是导致脑卒中和急性冠心病的最重要因素，还会引起严重的中风、肾功能衰竭、左心室肥大、心率失常、动脉硬化、猝死等。高血压已成为全球范围内的重大公共卫生问题。寻找高血压的致病机理，开发治疗高血压疾病的药物具有深远的意义。

人激肽释放酶(human kallikrein 1，hK1)，又称血管舒缓素，是人体内广泛存在的一组丝氨酸蛋白酶，具有降低血压、治疗肾病、糖尿病和心血管疾病、组织重塑等功能(杜汝辉.福建医药杂志.1997；19(2)：128；张蕊敏等.中国老年学杂志.1996；16：10-11；康凤英等.苏州医学院学报.1999；19(6)：661-662；Yuan G et al.Endocrinology.2007；148(5)：2016-2026；Fernando SC et al.Reproduction.2006；132(6)：939-947)。1909年，Abelous和Barder将人尿用在狗身上，发现具有降低血压的作用，从而发现人尿中含有激肽释放酶(彭武建等.国外医学泌尿系统分册.2003；23(5)：589-592)。激肽释放酶由于具有能够将相对低分子量的激肽原裂解成具有生物活性的激肽，因此又称为激肽原酶(姜春华等.中国生物制品学杂志.2006；19(3)：326-327)。人组织激肽释放酶的15个家族成员中，研究发现只有胰/肾激肽释放酶(KLK1基因，或KK基因，编码蛋白hK1)具有激肽原酶活性，能释放具有生物活性的激肽(华惠等.国外医学生物医院工程分册.2004；27(5)：301-305)，从而引发一系列的生理效应，如：降血压，肾病治疗等。

在19世纪30年代，有报道指激肽释放酶的含量变化与糖尿病和肾病有关。报道指患有糖尿病、肾病的患者尿液中激肽释放酶的含量下降，用胰岛素治疗后，激肽释放酶的含量随着血糖的正常而正常(彭武建等.国外医学泌尿系统分册.2003；23(5)：589-592)。随后的临床和动物实验表明，激肽释放酶的含量与肾小球的高滤过有关。在糖尿病大鼠体内，激肽释放酶含量的下降伴随着肾小球的高滤过下降。Katori M等通过对突变的激肽原缺陷小鼠进行研究，发现肾脏的激肽释放酶-激肽系统(KKS)能将机体内的钠排出体外；对患有原发性高血压和遗传性高血压患者，随着激肽释放酶含量释放的减少，伴随着钠排泄量的减少(Katori M et al.Biol Res.1998；31(3)：143-149)。

人组织激肽释放酶是激肽释放酶-激肽系统(KKS)的重要成员，通过KKS发挥各种生理学效应。其作用机理如下所示，hK1作用的底物是内源性的激肽原，能水解低分子量的激肽原，生成具有生物活性的激肽。缓激肽(bradykinin，BK)是生理条件下主要的激肽类物质，它也是目前人们研究比较多的一种。具有生物活性的BK与血管平滑肌细胞膜上的舒缓激肽B2受体结合后，激活磷脂酶C和磷脂酶A2，产生1、3、5-三磷酸肌醇及各种衍生物NO等。血管平滑肌NO增多，进而通过cGMP第二信使途径舒张血管、降低外周血管循环阻力、增加血管通透性以达到降血压的目的(华惠等.国外医学生物医院工程分册.2004；27(5)：301-305；Bhoola KD et al.Phamacol Rev.1992；44：1-80)。

目前，国内已有研究报道，通过提取猪胰腺激肽释放酶应用于临床上，在治疗高血压(杜汝辉.福建医药杂志.1997；19(2)：128)、血管性痴呆(张蕊敏等.中国老年学杂志.1996；16：10-11)、肾病(康凤英等.苏州医学院学报.1999；19(6)：661-662)等疾病中取得了肯定的疗效。但从组织中提取激肽释放酶成本高，有效含量低，难以形成工业化生产，使其应用受限。且由于存在种属的差异，猪源激肽释放酶与人源激肽释放酶在蛋白结构、生物活性、免疫原性以及治疗效果等方面都存在着种属的差异，使用人组织激肽释放酶治疗高血压等疾病必将优于猪胰激肽释放酶。将KK基因通过基因工程的方法进行转基因表达人源激肽释放酶(hK1)已成为一种必然的趋势。

四川大学华西基础医学院生物医学工程研究室的屈艺等人在CHO细胞中成功表达人激肽释放酶(屈艺等.药物生物技术.2002；9(5)：256-259)。暨南大学医学院第二附属医院及深圳市人民医院的李体远等人于2002年，在哺乳动物细胞中表达KLK1基因(李体远等.中国生物工程杂志.2002；122(6)：65-68)。2003年，在大肠杆菌中高效表达hK1成熟蛋白(李体远等.中国生物化学与分子生物学报.2003；19(3)：312-316)。2004年，利用杆状病毒载体在昆虫细胞中表达hK1(黄瑞芳等.广东医学杂志.2004；25(4)：390-391)。Gao等(2006)利用鸡输卵管特异性瞬时表达系统在鸡蛋胚里表达人组织激肽释放酶基因(hKLK1)，生化研究表明重组的人组织激肽释放酶与来自于人体和猪胰腺组织的天然蛋白相比，具有相似的热稳定性、最佳pH值、降低血压和对不同离子的灵敏度(Gao B et al.Poult Sci.2006；85(7)：1239-1244)。以上结果为日后利用KK基因或利用重组的hK1治疗高血压等疾病奠定了坚实的基础。然而，使用以上表达系统表达hK1虽然有其各自的优势，但也存在着不足。大肠杆菌属于原核生物，缺乏真核生物的糖基化修饰，并且容易产生内毒素等；CHO细胞培养困难，条件难以掌握，且培养成本高，难以进行工业化应用；昆虫细胞则具有较低的糖基化修饰能力；在鸡蛋胚中，hK1仅得到瞬时表达，无法进行稳定的遗传。以上的不足，极大阻碍了这一技术向实际生产的转化。

莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻，在其细胞顶部有两条鞭毛，能游动，可以进行光合作用。莱茵衣藻作为重要的模式生物，其基因组序列已测序完成。其具有生长周期短，生长迅速，光合效率高而被称为“绿色光合酵母”。由于莱茵衣藻具有遗传背景清晰、细胞结构简单等特点，广泛用于光合作用、鞭毛组装、趋光性和生理节律等方面的研究(Charles Hauser et al.Genome Analysis，2003，131：401-408)。莱茵衣藻是目前少数三套基因组(细胞核、叶绿体、线粒体)都能进行遗传转化的植物，三套基因组都能通过遗传转化的方法将外源基因转到基因组中。该技术在衣藻外源基因转化方面都得到了成功的应用(Kindle KL.1990；87(3)：1228-1232；Mayfield SP etal.Proc Natl Acad Sci USA.1990；87(6)：2087-2091；Ladygin VG.Mikrobiologiia.2003；72(5)：658-65)，并且在不断的得到改善。

发明内容

本发明的目的在于针对现有人组织激肽释放酶表达系统存在的上述问题，提供一种成本低且转基因藻能高效表达人组织激肽释放酶的转基因莱茵衣藻的构建方法。

本发明包括如下步骤：

1.转基因受体藻株的选择与培养：

进行莱茵衣藻外源基因转化，可选择莱茵衣藻的不同品系进行转化。例如采用“珠磨法”进行遗传转化，可选择细胞壁缺陷型莱茵衣藻有利于对衣藻进行遗传转化；采用“基因枪”和“电击转化法”进行遗传转化，可选择细胞壁缺陷型或非缺陷型的莱茵衣藻品系。在转基因受体藻株筛选标记选择中，以上不同的遗传转化方法均可选择营养缺陷型藻株或抗生素筛选标记。在本发明的实施案例中，选择细胞壁缺陷型或基因缺陷型莱茵衣藻作为转基因的受体藻株。莱茵衣藻是一种单细胞真核绿藻，有鞭毛，能游动，在光照条件下，能迅速生长。其培养基和培养条件可选择如下：

培养基的配制：选择Tris-acetate-phosphate(TAP)培养基作为莱茵衣藻的培养基。以1L培养基的配制为例，先加入975mlH₂O，然后加入1ml 1M(K)PO₄缓冲液、2.42g Tris、25ml 4×Beijerincksalts、1ml Trace微量元素混合溶液，使用冰醋酸调pH至7.0。

莱茵衣藻的培养：将纯化的莱茵衣藻单藻落从固体TAP平板中，接种于TAP液体培养基中，在连续光照条件下培养至对数中期。

2.人工合成外源目的基因：外源目的基因即为适合于莱茵衣藻表达的人组织激肽释放酶基因。根据人组织激肽释放酶基因序列和莱茵衣藻基因组偏爱密码子表，对人组织激肽释放酶基因进行密码子替换，设计适合于莱茵衣藻表达的人组织激肽释放酶基因，并通过人工合成的方法合成该基因；所述适合于莱茵衣藻表达的人组织激肽释放酶基因为适合于莱茵衣藻核表达的人组织激肽释放酶基因、适合于莱茵衣藻叶绿体表达的人组织激肽释放酶基因或适合于莱茵衣藻线粒体表达的人组织激肽释放酶基因。

(1)设计及人工合成适合于莱茵衣藻核表达的人组织激肽释放酶基因。

根据莱茵衣藻核基因组偏爱密码子表和GeneBank报告的人组织激肽释放酶基因序列，对人组织激肽释放酶基因进行密码子替换，设计适合于莱茵衣藻核表达的人组织激肽释放酶基因。该基因包括经莱茵衣藻核优先密码子替换并人工合成的人组织激肽释放酶基因，也包括将非编码序列插入到经优先密码子替换的人组织激肽释放酶基因中，并通过人工合成的方法合成的含有非编码序列的人组织激肽释放酶基因。在改造的基因中整合非编码序列以期提高外源基因的转化效率和表达水平。在本发明的一个实施方案中，经莱茵衣藻核偏爱密码子替换人工合成的外源目的基因为cKKn基因，cKKn基因具有SEQ IDNO.1所述的核苷酸序列。非编码序列为RBCS2内含子1，含有RBCS2内含子1的外源目的基因为人工合成的cKKit1基因，cKKit1基因具有SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列。cKKn基因、cKKit1基因分别克隆到合适的克隆载体上，获得含有外源目的基因的质粒。人工合成的cKKn基因或cKKit1基因在其3’末端均带有6个组氨酸的亲和标记，以利于对重组的人组织激肽释放酶进行亲和层析纯化。本发明获得的cKKn基因和cKKit1基因分别与合适的真核表达载体重组后，可以在合适的宿主细胞中表达hK1。在真核表达过程中，可依赖于宿主细胞的特性将RBCS2内含子1剪切，指导成熟mRNA的合成。

(2)设计及人工合成适合于莱茵衣藻叶绿体表达的人组织激肽释放酶基因。

根据莱茵衣藻叶绿体基因组偏爱密码子表和GeneBank报告的人组织激肽释放酶基因序列，对人组织激肽释放酶基因进行密码子替换，设计并人工合成适合于莱茵衣藻叶绿体表达的人组织激肽释放酶基因，例如实施例中的cKKch1基因，它具有SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。

(3)设计及人工合成适合于莱茵衣藻线粒体表达的人组织激肽释放酶基因。

根据莱茵衣藻线粒体基因组偏爱密码子表和GeneBank报告的人组织激肽释放酶基因序列，对人组织激肽释放酶基因进行密码子替换，设计并人工合成适合于莱茵衣藻线粒体表达的人组织激肽释放酶基因，例如本实施例中的cKKmt基因，它具有SEQ ID NO.4所述的核苷酸序列。

3.构建含有第2步所述外源目的基因的人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻表达载体：所述人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻表达载体为人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻核表达载体、人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻叶绿体表达载体或人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻线粒体表达载体。

在本发明的实施例中，含有外源目的基因cKKn基因的人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻核表达载体为pH105cKKn124，含有外源目的基因cKKit1基因的人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻核表达载体为pH105cKKit1124，其构建过程如下：从含有目的外源基因的质粒中获得cKKn基因(807bp)和cKKit1基因(952bp)，分别插入pH105的XbaI和Pmac I位点，获得pH105cKKn和pH105cKKit1，然后将cKKn基因的表达框架(HSP70A-RBCS2::cKKn::RBCS2)和cKKit1基因的表达框架(HSP70A-RBCS2::cKKit1::RBCS2)，分别插入pSP124的EcoRI位点，获得cKKn基因基因莱茵衣藻核表达载体pH105cKKn124(见图1)和cKKit1基因莱茵衣藻核表达载体pH105cKKi11t24(见图2)。

含有外源目的基因cKKch1基因的人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻叶绿体表达载体为pcKKch1，其构建过程如下：通过已知序列设计引物，从野生型莱茵衣藻DNA中，扩增5’chlB基因作为叶绿体转化载体的右端同源片段；扩增3’chlB基因作为叶绿体转化载体的左端同源片段。将左右两端同源片段分别与p423质粒连接，构建得到p423ch1质粒(见图3)。

通过酶切将质粒p423的aadA基因替换成人工合成的cKKch1基因(807bp)，并通过EcoR V和Sma I双酶切，获得cKKch1基因表达盒，与经过EcoR V酶切的p423ch1质粒连接。通过酶切筛选出正向连接的重组质粒，获得以aadA基因作为筛选标记，含有cKKch1基因表达盒的莱茵衣藻叶绿体表达载体pcKKch1(见图4)。

含有外源目的基因cKKmt基因的人组织激肽释放酶基因莱茵衣藻线粒体表达载体为pNCFcKKmt，其构建过程如下：通过已知序列设计引物，从野生型莱茵衣藻DNA中，扩增ND4和Cob基因的全长序列(简称NC)作为线粒体转化载体的右端同源片段；扩增左端重复序列(简称Left)作为线粒体转化载体的左端同源片段。根据实际需要，在引物中同时引入多克隆位点。将右端同源片段和左端同源片段分别与pBluescript SK载体连接，构建莱茵衣藻线粒体表达载体pNCF(见图5)。

将cKKmt基因片段(807bp)插入pNCF的Pst I和Xho I位点，获得cKKmt基因莱茵衣藻线粒体表达载体pNCFcKKmt(见图6)。

4.人组织激肽释放酶基因表达载体的遗传转化。

遗传转化方法可采用珠磨法、基因枪法或电击转化法。

例如，可通过“珠磨法”遗传转化方法将cKKn基因和cKKit1基因的莱茵衣藻核表达载体导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻(购自美国Duke大学衣藻遗传中心)受体藻株中。

可通过“基因枪转化法”或“电击转化法”，将cKKch1基因莱茵衣藻叶绿体表达载体导入细胞壁缺陷型莱茵衣藻受体藻株中。

可通过“基因枪转化法”，将cKKmt基因莱茵衣藻线粒体表达载体导入细胞色素b缺陷型(购自美国Duke大学衣藻遗传中心)莱茵衣藻受体藻株中。

5.转基因莱茵衣藻的筛选。

经过遗传转化的转基因衣藻在含有筛选抗生素的TAP固体培养基平板或营养缺陷筛选标记进行培养和筛选，经过3周左右的光照或黑暗培养，直至长出绿色的单克隆藻落。然后，通过抗性基因和分子检测手段筛选获得转基因衣藻。分子检测手段包括PCR-Southernblot检测、RT-PCR-Southern blot检测、Western blot检测和组织激肽释放酶活性检测。

本发明采用莱茵衣藻作为外源基因表达的宿主细胞表达hK1，在实际生产方面，莱茵衣藻能利用光能作为能源，易于培养，解决了底物成本高的问题；可以进行真核基因表达产物的糖基化修饰，不会产生内毒素。因此，选用衣藻作为外源基因表达系统集中了细菌、高等植物表达外源基因的优势，具有广阔的应用前景。莱茵衣藻营养物质丰富，结构合理，本发明构建的可表达人组织激肽释放酶的转基因衣藻可开发成为可食性治疗性药物。

本发明通过莱茵衣藻核偏爱密码子表、叶绿体偏爱密码子表和线粒体偏爱密码子表替换及人工合成的方法，可分别合成适合于莱茵衣藻核表达的人组织激肽释放酶基因和含有非编码序列的人组织激肽释放酶基因、适合于莱茵衣藻叶绿体表达的人组织激肽释放酶基因，以及适合于莱茵衣藻线粒体表达的人组织激肽释放酶基因，并进一步构建了携带有上述外源目的基因的莱茵衣藻核表达载体、莱茵衣藻叶绿体表达载体和莱茵衣藻线粒体表达载体，进而获得了由本发明相应载体转化的核转基因莱茵衣藻、叶绿体转基因莱茵衣藻和线粒体转基因莱茵衣藻。本发明获得的hK1转基因藻，分别经过KLK1单克隆抗体和组织激肽释放酶专一性底物的活性检测，能表达得到具有生物学活性的hK1。可以进一步用于高血压动物模型、糖尿病动物模型以及肾病动物模型的研究，且可进一步用于治疗高血压等疾病的临床前研究。

附图说明

图1为本发明实施例中cKKn基因莱茵衣藻核表达载体pH105cKK124构建示意图。

图2为本发明实施例中cKKit1基因莱茵衣藻核表达载体pH105cKKit1124构建示意图。

图3为本发明实施例中莱茵衣藻叶绿体表达载体p423ch1构建示意图。

图4为本发明实施例中cKKch1基因莱茵衣藻叶绿体表达载体pcKKch1构建示意图。

图5为本发明实施例中莱茵衣藻线粒体表达载体pNCF构建示意图。

图6为本发明实施例中cKKmt基因莱茵衣藻线粒体表达载体pNCFcKKmt构建示意图。

图7和图8为本发明实施例中hK1转基因莱茵衣藻PCR-Southern杂交分析结果。图7共有5条泳道，其中M示DL 2000marker；1示阴性对照(cc-849基因组PCR产物与cKKn探针杂交)；2示阳性对照(pckk18质粒PCR产物与cKKn探针杂交)；3-4示转cKKn基因莱茵衣藻的PCR产物与cKKn探针杂交。图8共有6条泳道，其中M示DL2000 marker；1-3示转cKKit1基因莱茵衣藻的PCR产物与cKKit1探针杂交；4示阳性对照(质粒pckkit118的PCR产物与cKKit1探针杂交)；5示阴性对照(cc-849基因组PCR产物与cKKit1探针杂交)。

图9和图10为本发明实施例中hK1转基因莱茵衣藻RT-PCR-Southern杂交分析结果。图9共有6条泳道，其中M示DL 2000marker；1示阴性对照(cc-849基因组RT-PCR产物与cKKn探针杂交)；2示阳性对照(质粒pcKKn18的RT-PCR产物与cKKn探针杂交)；3-4示转cKKn基因莱茵衣藻的RT-PCR产物与cKKn探针杂交。图10共有7条泳道，其中M1示DL 2000 marker；1-3示转cKKit1基因莱茵衣藻的RT-PCR产物与cKKn探针杂交；4示阳性对照(质粒pckkit118的PCR产物与cKKn探针杂交)；5示阴性对照(cc-849的RT-PCR产物与cKKn探针杂交)；M2示DNA Molecular Weight MarkerIII，Digoxigenin-labeled；

图11为本发明实施例中hK1转基因莱茵衣藻Western杂交分析结果。图11共有8条泳道，其中M示protein marker(PageRulerTMPrestained Protein Ladder)；n示阴性对照(cc-849的总蛋白)；1-3示转cKKn基因莱茵衣藻的总蛋白；4-7示转cKKit1基因莱茵衣藻的总蛋白。

具体实施方式

实施例一：转基因受体藻株的选择与培养

选择细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii，cc-849，购自美国Duck大学衣藻遗传中心)和细胞色素b缺陷型莱茵衣藻(cc-2654，购自美国Duck大学衣藻遗传中心)作为转基因的受体藻株。使用TAP培养基作为莱茵衣藻的培养基，其配方及成分如下所示：2.42g Tris，25mL 4×Beijerinck salts(16g NH₄Cl，2gCaCl₂.2H₂O，4g MgSO₄.7 H₂O溶于水中，定容至1L)，1mL 1M(K)PO₄，1mL Trace微量元素混合液(11.4g H₃BO₃，5.6g MnCl₂.4 H₂O，22gZnSO₄.7 H₂O，4.99g FeSO₄.7 H₂O，1.61g CoCl₂ .6 H₂O，1.57g CuSO₄.5H₂O，1.1g(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4 H₂O，50g Na₂EDTA，溶于水中，20％KOH调pH6.5-6.8，定容至1L)，溶解到975mL水中，使用冰醋酸调pH6.95-7.05，定容至1L。

莱茵衣藻的培养条件：在22-25℃，90μE/m²/s光照条件下连续培养至对数中期，藻细胞对数生长期浓度为1-2×10⁶cells/mL。

实施例二：中国人组织激肽释放酶基因的改造

根据已知的中国人组织激肽释放酶基因(GenBank登陆号：AY703451)和莱茵衣藻偏爱密码子表(http://www.chlamy.org/)，分别设计及人工合成适合于莱茵衣藻核表达的cKKn基因、适合于莱茵衣藻叶绿体表达的cKKch1基因和适合于莱茵衣藻线粒体表达的cKKmt基因。同时，将RBCS2内含子1(GneBank登陆号：XO4472)插入到经优先密码子替换的cKKn基因中，通过人工合成的方法合成含有RBCS2内含子1的cKKit1基因。cKKn基因序列如SEQ ID NO.1所示，cKKit1基因序列如SEQ ID NO.2所示，cKKch1基因序列如SEQID NO.3所示，cKKmt基因序列如SEQ ID NO.4所示。

分别将基因cKKn、cKKit1、cKKch1和cKKmt使用DNA磷酸化试剂盒(DNA kination Kit)进行加磷酸化处理后，与pSimple-18 EcoRV/BAP vector连接，构建得到质粒pcKKn18(含有cKKn基因)、质粒pcKKit118(含有cKKit1基因)、质粒pcKKch118(含有cKKch1基因)和质粒pcKKmt18(含有pcKKmt基因)。以上基因分别在莱茵衣藻中表达的产物，其N末端均带有His tag亲和标记，可以通过亲和层析的方法进行产物纯化。

实施例三：hK1表达基因衣藻表达载体的构建

(1)hk1表达基因莱茵衣藻核表达载体的构建

质粒pckkn18含有cKKn基因，可以通过Nhe I和Pmac I双酶切获得cKKn基因。质粒pckkit118含有cKKit1基因，可以通过NheI和Pmac I双酶切获得cKKit1基因。载体pH105(Wu JX et al.Efficient expression of green fluorescent protein(GFP)mediated by a chimeric promoter in Chlamydomonas reinhardtii.Chinese Journal of Oceanology and Limnology.Accepted)克隆有HSP70A-RBCS2启动子序列和RBCS2终止子序列，中间携带有PmacI、Nhe I、Xba I和Sal I等多克隆酶切位点，可以插入外源基因并在莱茵衣藻核基因组中表达。载体pSP124(Lambreras v，StevensDR，Purton S.Efficient foreign gene expression inChlamydomonas reinhardtii mediated by an endogenous intron.Plant J.1998；14(4)：441-447)含有表达盒RBCS2::ble::RBCS2，可使转化的宿主细胞获得腐草霉素和Zeomycin抗性，在本发明中作为莱茵衣藻转化的筛选标记。

使用限制性内切酶Pmac I和Nhe I消化质粒pckkn18，将获得的cKKn基因(807bp)插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得pH105cKKn。经EcoR I酶切pH105cKKn，获得的cKKn基因表达框架(HSP70A-RBCS2::cKKn::RBCS2)插入pSP124的EcoR I位点，获得cKKn基因莱茵衣藻表达载体pH105cKKn124(见图1)。

使用限制性内切酶Pmac I和Nhe I消化质粒pckkit118，将获得的cKKit1基因(952bp)插入经Pmac I和Nhe I消化的pH105载体，获得pH105cKKit1。经EcoR I酶切pH105cKKit1，获得的cKKit1基因表达框架(HSP70A-RBCS2::cKKit1::RBCS2)插入pSP124的EcoRI位点，获得cKKit1基因莱茵衣藻表达载体pH105cKKit1124(见图2)。

(2)hk1表达基因莱茵衣藻叶绿体表达载体的构建

质粒p423(购自美国Duck大学衣藻中心)上携带有aadA基因表达盒(5’atpA::aadA::3’rbcL)，aadA基因作为衣藻遗传转化的筛选标记，赋予宿主细胞壮观霉素抗性。以莱茵衣藻cc-124(购自美国Duck大学衣藻遗传中心)基因组DNA为模板，设计引物Prch1和Prch2扩增5’chlB基因(490bp)，作为衣藻遗传转化的右端同源序列。设计引物Prch3和Prch4扩增3’chlB基因(630bp)，作为衣藻遗传转化的左端同源序列。

扩增5’chlB基因的引物为：

Prch 1：5’-CCTGAATTCCTGCCATTGGTGTCCATTGC-3’

               EcoR I

Prch 2：5’-GGAGATATCCATTTCCAGGCTGATAGTG-3’

               EcoR I

PCR程序：94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环。

扩增3’chlB基因的引物为：

Prch3：5’-GCGGTACCGCCATTGTATGGTCTCCAG-3’

             Kpn I

Prch4：5’-CGCTGCAGCGGGTACATTAGTAGCGGTG-3’

             Pst I

PCR程序：94℃变性1min，56℃复性1min，72℃延伸1min，30个循环。

分别使用EcoR I酶切扩增获得的5’chlB基因和p423质粒，连接并构建得到p423c质粒。分别使用Kpn I和Pst I酶切扩增获得的3’chlB基因和p423c质粒，连接并构建得到衣藻叶绿体表达载体p423chl(见图3)。

通过Nco I和Pst I双酶切p423质粒可以切下aadA基因，并插入外源目的基因cKKchl(807bp)，构建得到cKKchl基因表达盒(5’atpA::cKKchl::3’rbcL)。使用EcoR V和Sma I双酶切，获得cKKchl基因表达盒，并与经EcoR V酶切的p423chl质粒连接，通过Xho I酶切筛选正向连接的质粒，构建得到含有aadA基因表达盒和cKKchl基因表达盒的pcKKchl质粒(见图4)。莱茵衣藻叶绿体表达载体pcKKchl上携带有chlB基因外显子5’和3’端序列，在衣藻遗传转化过程中，作为同源转化片段，可使cKKchl基因定点整合入叶绿体DNA的chlB基因的5’和3’端序列之间的位置。

(3)hk1表达基因莱茵衣藻线粒体表达载体的构建

莱茵衣藻cc-124为野生型衣藻，在以硝酸盐和其它氮源共同存在的情况下，光照或黑暗培养生长。莱茵衣藻cc-2654(购自美国Duck大学衣藻遗传中心)为dum-1突变株的亚克隆，属于线粒体基因组细胞色素b缺陷型突变株，在光照下可培养生长，黑暗条件下则无法培养生长。cc-2654通过基因修复后，可在黑暗条件下培养生长。

以莱茵衣藻cc-124 DNA作为模板，设计引物PrNC1和PrNC2，扩增ND4和Cob基因的全长序列(简称NC基因，2503bp)；设计引物PrL1和PrL2，扩增左端重复序列(简称Left基因，544bp)。ND4和Cob基因的全长序列，作为遗传转化载体的右端同源片段；左端重复序列作为遗传转化载体的左端同源片段。

扩增NC基因的引物为：

PrNC1

5’-TTGCGGCCGCCGGAATTCCATATGTTTATTTCTGTTTTGTTG-3’

      Not I     EcoR I

PrNC2：

5’-AACTGCAGCCCCGGGCGCGGATCCTTAGTTGGTTTGAGTACCGTGG-3’

      Pst I  Sma I    BamH I

PCR程序：94℃变性30sec，53℃复性30sec，72℃延伸150sec，30个循环。

扩增Left基因的引物为：

PrL 1：5’-AACTGCAGCCTCGAGGGATATCTATTTTGCATTGACACAC-3’

             Pst I  Xho I EcoR V

PrL2：5’-GGGGTACCCGGAATTCACTACGCATGCCTAAG-3’

             Kpn I  EcoR I

PCR程序：94℃变性30sec，53℃复性30sec，72℃延伸60sec，30个循环。

分别用Not I和Pst I酶切PCR扩增获得的NC基因和pBluescript SK载体，连接并构建得到pNC质粒。利用Pst I和KpnI位点，将pNC质粒线性化。同时，使用Pst I和Kpn I酶切扩增获得的Left基因，并与线性化的pNC质粒连接，构建得到莱茵衣藻线粒体遗传转化载体pNCF(图5)。

通过Pst I和Xho I双酶切pcKKmt 18质粒，将cKKmt基因片段插入pNCF的Pst I和Xho I位点，获得衣藻线粒体表达载体pNCFcKKmt(图6)。cKKmt基因转入衣藻后，在衣藻线粒体基因组自身启动子的带动下进行转录。

实施例四：莱茵衣藻的遗传转化

(1)“珠磨法”遗传转化

采用质粒纯化试剂盒(QIAGENPlasmid Purification Kit)分别提取重组质粒pH105cKKn124和pH105cKKit1124。“珠磨法”具体步骤如下：(1)将细胞壁缺陷型莱茵衣藻cc-849在连续光照和TAP培养液中培养至对数期，细胞数约为1-2×10⁶cells/ml。5000rmp室温离心5min，收集藻细胞；弃上清；(2)用灭过菌的新鲜TAP培养液重悬藻细胞沉淀，调整细胞浓度至2×10⁸cells/ml；(3)吸取270μl藻细胞悬浮液到1.5ml EP管里(里面有灭过菌的合金锡珠)，分别加入1μg酶切成线状的pH105k124和pH105ckk124以及30μl 50％PEG6000到EP管中；同时建立一个不添加PEG6000的样品组；此外，还建立一个不添加DNA的对照组；(4)把衣藻细胞/合金锡珠/外源DNA混合物在振荡器上以最高速振荡25s；(5)把混合液转移到含有10ml新鲜TAP培养基的离心管中，在100rpm摇床弱光下过夜培养(22-25℃)，使细胞恢复；(6)3000rmp室温离心5min，收集细胞，弃上清；用500μl新鲜TAP培养液小心重悬细胞，加入3.5ml 0.5％TAP培养基，混匀后倒在含有10μg/ml的Zeomycin TAP固体平板上，置于22-25℃光照培养箱里倒置培养约3周，待平板上长出绿色的单克隆。

(2)“基因枪法”遗传转化

“基因枪”遗传转化在无菌超净工作台中使用基因枪(Bio-Rad)进行。具体步骤如下：(1)莱茵衣藻cc-2654在TAP培养液中培养至对数生长期(1-2×10⁶cells/ml)，5000rmp室温离心5min，收集藻细胞；弃上清；用灭过菌的新鲜TAP培养液重悬藻细胞沉淀，调整细胞浓度至2×10⁸cells/ml；吸取300μl藻细胞悬浮液涂布于TAP固体平板中央(直径～3cm)；22-25℃光照培养(～90μE/m²/s)24h，待平板表面形成一层细胞层。(2)取100ul金粉悬浮液(60mg/mL)，依次加入5μg质粒(pcKKchl或pNCFcKKmt)(100μg/μl)、100μl2.5M CaCl₂和40μl 0.1M亚精胺，通过漩涡振荡器振荡2-3分钟，静置1分钟，8,000rpm室温离心2秒，弃上清；加入280ul 70％乙醇清洗，弃上清；加入280ul无水乙醇清洗，弃上清；加入100ul无水乙醇，轻轻重悬。(3)取10ul DNA金粉包被液用于轰击；轰击参数如下所示：可裂膜氦气压力1100psi，真空度25inches·Hg，轰击距离9cm，金粉颗粒直径100nm；(4)把轰击后的平板放置于22-25℃光照培养箱中，光照培养8h。用1mL新鲜TAP培养液将衣藻细胞洗下，涂布于抗生素筛选平板(转pcKKchl质粒)或黑暗条件(转pNCFcKKmt质粒)培养约3周，待平板上长出绿色单克隆。

(3)“电击转化法”遗传转化

莱茵衣藻cc-849在TAP培养液中培养至对数生长期(1-2×10⁶cells/ml)，在冰上预冷后，加入10％Tween-20(1/2000v/v)，5000rmp，4℃，离心5min，收集藻细胞；弃上清；用含有40mM蔗糖的TAP培养液重悬藻细胞沉淀，调整细胞浓度至2×10⁸cells/ml；取100ul藻细胞悬浮液到1mm电击转化杯中，加入终浓度为10ug/mL的pcKKchl质粒及25ug/mL的鲑精DNA，重悬混匀；使用电转仪(Eppendorf)进行电击转化，在10℃下，以电压为2KV/cm进行转化；将电击转化杯置于25℃水浴5min，把悬浮液转移到含有10ml新鲜TAP培养基的离心管中，22℃弱光下培养复苏8h；3000rmp室温离心5min，收集细胞，弃上清；用500μl新鲜TAP培养液小心重悬细胞，加入3.5ml 0.5％TAP培养基，混匀后倒在含有150μg/ml的壮观霉素TAP固体平板上，置于22-25℃光照培养箱里倒置培养1-2周，待平板上长出绿色的单克隆。

实施例五：转基因莱茵衣藻的筛选与鉴定

hK1转基因莱茵衣藻由于整合入ble基因(获得Zeomycin抗性)或aadA基因(获得壮观霉素抗性)，经过抗生素平板初步筛选获得的转化子，可在含有10ug/ml的Zeomycin抗性平板或150ug/ml的壮观霉素抗性平板上进行继代培养。莱茵衣藻cc-2654经pNCFcKKmt质粒遗传转化后，其线粒体基因组缺失的Left基因序列得以修复，可在光照和黑暗条件下进行继代培养。

初步筛选获得的hK1转基因莱茵衣藻进行如下的分子检测：基因组DNA的PCR-Southern杂交、RT-PCR-Southern杂交、Western杂交以及特异性底物酶活性检测。具体步骤如下所示：

(1)转基因莱茵衣藻总DNA的提取

将获得的转基因莱茵衣藻接种于新鲜的TAP培养基中培养，在光照条件下培养至对数中后期，提取其总DNA(参照http://www.chlamy.org/methods/dna.html)。具体方法如下：(1)取10ml莱茵衣藻细胞培养液，4℃，10000rpm离心3min，弃上清收集藻细胞；(2)加入500μl TEN Buffer(10mM Tris-HCl，10mM EDTA，150mM NaCl)重悬藻细胞，剧烈震荡，充分混匀；12,000rpm离心10s，弃上清；(3)在冰上加入150μl去离子水，充分重悬藻细胞；加入300μl SDS-EB Buffer(2％SDS，400mM NaCl，40mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 8.0)，轻轻的混匀，冰上放置10min，轻轻的敲散形成的团状物；(4)加入450μl的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，震荡混匀；4℃，12,000rpm离心5min，小心的吸取上层水相到另一新的1.5ml EP管中；(5)加入与上清等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25 ∶ 24∶1)抽提直至上清澄清为止；(6)上清中加入1/10体积3M的醋酸钠；(7)加入2倍体积预冷的无水乙醇到上述混合液中，混匀后置于-20℃放置20min；4℃，12,000rpm离心5min，小心的弃上清；(8)加入500μl 70％乙醇洗涤DNA，4℃，12,000rpm离心5min，小心的弃上清；(9)空气中干燥后，溶于20μl TE Buffer(含RNase)或者去离子水(含RNase)中。

(2)转基因莱茵衣藻PCR-Southern杂交

以提取得到的莱茵衣藻cc-849、cc-2654和转基因莱茵衣藻基因组DNA作为模板，进行PCR扩增检测。根据各基因序列设计特异性引物分别扩增cKKn、cKKit1、cKKchl和cKKmt目的条带。

各取50ng PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳后，参照Model 785Vacuum Blotter(Bio-Rad)仪器说明书进行真空转膜，使凝胶在5inches·Hg气压和10×SSC缓冲液中进行转移60min，从而将琼脂糖凝胶中的DNA转移到带正电荷的阳性尼农膜上。与地高辛标记的cKKn基因(使用引物Prckk1和Prckk2对pckkn18进行PCR扩增的产物)、cKKchl基因(通过Nco I和Pst I双酶切pcKKchl18质粒获得)和cKKmt基因(通过Pst I和Xho I双酶切pcKKmt18质粒获得)探针杂交，探针的制备以及杂交过程参照DIG High Prime DNA Labelingand Detection Starter Kit I(Roche生物公司)说明书。结果显示，PCR产物转移到带正电荷的阳性尼农膜(Amersham公司)后，使用地高辛标记的DNA探针杂交，结果显示均能得到与阳性对照一致的信号带，而阴性对照则没有任何条带显示(参见图7，图8)。这表明cKKn、cKKit1、cKKchl和cKKmt基因整合到莱茵衣藻基因组中。

(3)转基因莱茵衣藻总RNA的提取

莱茵衣藻cc-849、cc-2654和转基因莱茵衣藻在光照条件下培养至对数中后期，进行热激诱导。40℃光照下培养20min后，置于22℃光照培养箱中连续培养90min。采用RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)提取其总RNA。

(4)转基因莱茵衣藻RT-PCR-Southern杂交分析

以提取的莱茵衣藻cc-849、cc-2654和转基因莱茵衣藻RNA作为模板，采用RNA反转录PCR试剂盒(RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0，TaKaRa公司)进行RT-PCR。使用Oligo dT-Adaptor primer进行cDNA第一链的合成(50℃，30min；99℃，5min；5℃，5min；)。分别以反转录的莱茵衣藻cc-849和转基因莱茵衣藻cDNA作为模板，使用各基因片段的特异性引物进行cDNA第二链的合成和目的片段的PCR扩增。RT-PCR扩增产物与地高辛标记的cKKn、cKKchl和cKKmt探针杂交。杂交结果显示均能得到与阳性对照一致的杂交信号(参见图9，图10)。这表明转入的目的基因在莱茵衣藻中均具有转录活性，而且cKKit1基因中的RBCS2内含子1得到正确的剪接。

(5)转基因莱茵衣藻Western杂交分析

提取hK1转基因莱茵衣藻的总蛋白，取藻细胞的总蛋白行12％SDS-PAGE电泳分离，使用KLK1单克隆抗体(Abnova公司)作为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠IgG(KPL公司)作为二抗，进行免疫印记，检测转基因莱茵衣藻中目的蛋白hK1的表达。具体方法参照台湾Abnova公司的Western印记方法。Western杂交结果显示，与对照组(cc-849总蛋白)相比，hK1转基因莱茵衣藻在40kD附近有一杂交信号带，推测表达的蛋白即为hK1(参见图11)。

实施例六：转基因莱茵衣藻的酶活性分析

提取hK1转基因莱茵衣藻的总蛋白，使用考马斯亮蓝染色法测定提取的莱茵衣藻总蛋白含量后，使用组织激肽释放酶专一性化学发光底物H-D-Val-Leu-Arg-Pna(S-2266^TM)(Chromogenix公司)，检测莱茵衣藻总蛋白中组织激肽释放酶的相对活性。反应过程参照S-2266^TM使用说明书。利用说明书提供的公示，计算每升溶液中酶的活性值(U/L)。

依据下列公式算出各转基因莱茵衣藻每毫克总蛋白中人组织激肽释放酶的相对活性，以衡量转基因莱茵衣藻中人组织激肽释放酶基因表达水平的相对标准：

样品的酶活性值＝U/L/C

相对酶活性值＝供试样品的酶活性值-对照样品的酶活性值

C-样品的总蛋白浓度(mg/L)

检测结果显示，hK1转基因莱茵衣藻的酶活性值均高于未转基因衣藻。表明所获得的hK1转基因莱茵衣藻能表达得到具有生物学活性的hK1。

序列表

<110>深圳大学

<120>表达人组织激肽释放酶的转基因莱茵衣藻的构建方法

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>807

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

atgtggttcc tggtgctgtg cctggccctg tccctgggcg gcaccggcgc cgcgcccccg  60

atccagtccc gcatcgtggg cggctgggag tgcgagcagc actcccagcc ctggcaggcg  120

gccctgtacc acttcagcac cttccagtgc ggcggcatcc tggtgcaccg ccagtgggtg  180

ctgaccgccg cccactgcat cagcgacaac taccagctgt ggctgggccg ccacaacttg  240

ttcgacgacg agaacaccgc ccagttcgtg cacgtgagcg agagcttccc ccaccccggc  300

ttcaacatga gcctgctgga gaaccacacc cgccaggccg acgaggacta cagccacgac  360

ctgatgctgc tgcgcctgac cgagcccgcc gacaccatca ccgacgccgt gaaggtggtg  420

gagttgccca cccaggagcc cgaggtgggc agcacctgct tggcgtccgg ctggggcagc  480

atcgagcccg agaacttctc cttccccgac gacctgcagt gcgtggacct gaagatcctg  540

cccaacgacg actgcgagaa ggcccacgtg cagaaggtga ccgacttcat gctgtgcgtg  600

ggccacctgg agggcggcaa ggacacctgc gtgggcgact ccggcggccc gctgatgtgc  660

gacggcgtgc tgcagggcgt gacctcctgg ggctacgtgc cctgcggcac ccccaacaag  720

ccctccgtgg ccgtgagggt gctgtcctac gtgaagtgga tcgaggacac catcgcggag  780

aactcccacc accaccacca ccactga                                      807

<210>2

<211>952

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

atgtggttcc tggtgctgtg cctggccctg tccctgggcg gcaccggtga gtcgacgagc  60

aagcccggcg gatcaggcag cgtgcttgca gatttgactt gcaacgcccg cattgtgtcg  120

acgaaggctt ttggctcctc tgtcgctgtc tcaagcagca tctaaccctg cgtcgccgtt  180

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catcaccgac gccgtgaagg tggtggagtt gcccacccag gagcccgagg tgggcagcac  600

ctgcttggcg tccggctggg gcagcatcga gcccgagaac ttctccttcc ccgacgacct  660

gcagtgcgtg gacctgaaga tcctgcccaa cgacgagtgc gagaaggccc acgtgcagaa  720

ggtgaccgac ttcatgctgt gcgtgggcca cctggagggc ggcaaggaca cctgcgtggg  780

cgactccggc ggcccgctga tgtgcgacgg cgtgctgcag ggcgtgacct cctggggcta  840

cgtgccctgc ggcaccccca acaagccctc cgtggccgtg agggtgctgt cctacgtgaa  900

gtggatcgag gacaccatcg cggagaactc ccaccaccac caccaccact ga          952

<210>3

<211>807

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgtggtttc ttgttctttg tcttgctctt tcacttggtg gtacaggtgc tgctccacca    60

attcaatcac gtattgttgg tggttgggaa tgtgaacaac attcacaacc atggcaagct    120

gctctttatc attttagtac atttcaatgt ggtggtattc ttgttcatcg tcaatggcta    180

cttacagctg ctcattgtat tagtgataat tatcaacttt ggcttggtcg tcataattta    240

tttgatgatg aaaatacagc tcaatttgtt catgttagtg aaagttttcc acatccaggt    300

tttaatatga gtcttcttga aaatcataca ggtcaagctg atgaagatta tagtcatgat    360

cttatgcttc ttcgtcttac agaaccagct gatacaatta cagatgctct taaagttgtt    420

gaattaccaa cacaagaacc agaagttggt agtacatgtt tagcttcagg ttggggtagt    480

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aattcacacc accaccacca ccactga                                        807

<210>4

<211>807

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

atgtggttcc tagtactatg cctagctcta tctctaggtg gtactggtgc tgctccacca    60

attcaatctc gtattgtagg tggttgggag tgcgagcaac actctcaacc atggcaagct    120

gctctatacc acttcagtac tttccaatgc ggtggtattc tagtacaccg tcaatgggta    180

ctaactgctg ctcactgcat tagtgacaac taccacctat ggctaggtcg tcacaacttg    240

ttcgacgacg agaacactgc tcacttcgta cacgtcagtg agagtttccc acacccaggt    300

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ctaatgctac tacgtctgac tgagccagct gacactatta ctgacgctgt aaaagtagta    420

gagttgccaa ctcaagagcc agaggtaggt agtacttgct tggcttctgg ttggggtagt    480

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gatggtgtac tacaaggtgt aacttcttgg ggttacgtac catgcggtac tccaaacaaa    720

ccatctgtag ctgtaagggt actatcttag gtaaaatgga ttgaggacac tattgctgag    780

aactctcacc accaccacca ccactga                                        807