冻干甲型肝炎－水痘减毒联合疫苗及其生产方法

摘要

本发明提供一种冻干甲型肝炎－水痘减毒联合疫苗及其生产方法，联合疫苗具有与其单价疫苗同样良好的安全性和免疫原性，可有效地预防甲型肝炎和水痘。一次免疫接种即可有效地预防两种疾病，可以降低疫苗成本、提高疫苗接种效率、减少多次注射所带来的不良反应，可以减少疫苗接种次数而达到预防多种疾病的目的。

说明书

技术领域

本发明提供一种冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗，本发明还提供了上述联合疫苗的制备方法，以及所说的联合疫苗的保护剂，属于疫苗制备技术领域。

背景技术

预防性疫苗在全球范围内的应用使传染病得到了有效控制，大大降低了许多常见传染病的发病率和死亡率。随着分子生物学、细胞生物学等相关学科的飞速发展，新疫苗不断地被研究和开发。但是，疫苗种类增多必将伴随一系列问题，儿童接种次数增加，疫苗管理也较困难。每个儿童在其学龄前的7年时间中，大约需要去接种疫苗的诊疗所多达20余次。这不仅大大增加了儿童接种疫苗的皮肉之苦和增加了产生疫苗副反应的机会、对医务工作者和儿童的家长带来了不便，而且也相应地增加了疫苗的使用和管理方面的困难，容易造成漏种等，直接影响到预防效果。因此，联合免疫的方法不仅被普遍使用，而且越来越受到重视。联合疫苗为儿童免疫规划的连续、简化和扩大所必需。自1991年由联合国儿童基金会和世界卫生组织等国际组织发起并推广“儿童疫苗计划”(CVI)以来，世界上许多从事疫苗研究与开发的实验室和公司都在致力于联合疫苗的研制。

由于水痘减毒活疫苗是唯一获准用于预防人类疱疹病毒感染的疫苗，且甲型肝炎灭活疫苗与水痘减毒活疫苗存在免疫针次和程序上的冲突，故而进行冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗研究首选采用甲型肝炎减毒活疫苗。目前，获得批准上市的甲型肝炎减毒活疫苗只有中国的L-A-1减毒株和H2减毒株，国外的减毒疫苗仍处于研究阶段。

迄今尚未见使用活的减毒甲型肝炎疫苗病毒生产冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗的报道。

发明内容

本发明提供一种冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗，具有多联多价的、耐热稳定的特点。

本发明还提供一种冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗的制备方法，适用工业化生产。

本发明公开的冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗，含有甲型肝炎减毒活病毒、水痘减毒活病毒和保护剂。

其中所说的甲型肝炎减毒活病毒是甲型肝炎减毒活病毒L-A-1疫苗株，病毒滴度不低于6.5LogCCID₅₀/ml；水痘减毒活病毒是水痘减毒活病毒OKa疫苗株，病毒滴度不低于4000PFU/ml。

用于冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗的保护剂成分及浓度为：海藻糖30-100g/l、右旋糖酐10-60g/l、谷氨酸钠5-10g/l、抗坏血酸1-3g/l、尿素5-20g/l，甘露醇3-10g/l或山梨醇3-15g/l。

还有以下原料：L-精氨酸为0-3g/l。

本发明联合疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)分别提供并混合甲型肝炎减毒活疫苗病毒原液和水痘减毒活疫苗病毒原液，得到甲型肝炎减毒活病毒和水痘减毒活病毒的混合液；

2)在步骤1)中得到的混合液中加入保护剂并混匀，得到甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗混合液；

3)冷冻干燥步骤2)中得到的含有保护剂的联合疫苗混合液，得到冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗。

具体步骤如下：

制备冻干保护剂，首先按所示浓度将下列成分溶解于37℃注射用水中(1000ml)：谷氨酸钠65-130g、抗坏血酸13-40g、尿素65-260g、L-精氨酸0-40g、山梨醇40-130g和(或)甘露醇40-195g，并用0.1NHCL调整PH值至7.0。经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护组分A。

然后称取海藻糖500.0g溶解于温度为37℃左右注射用水补至1000ml，经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组分B。

最后再将300.0g右旋糖酐40溶解于温度约为37℃注射用水补至1000ml，经116℃高压蒸汽灭菌40分钟后得到保护剂组分C。

可以通过简单的机械混合方法，制备本发明的甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗混合液。按照1∶(1～2)(V/V)的比例将病毒滴度为大于7.0LogCCID₅₀/ml的甲型肝炎疫苗原液与病毒滴度为大于6000PFU/ml的水痘疫苗原液混合，然后再加入冻干保护剂，轻轻混合均匀。

使用作为疫苗稀释液的199综合培养液稀释至联合疫苗中各组分所需含量或浓度，即得到甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗混合液。

冷冻干燥分装好的上述混合液，其条件是：-30℃至-55℃低温条件预冷冻3至7小时，-30℃至35℃条件下真空干燥8至16小时。

与冻干前相比，冻干后甲型肝炎疫苗病毒滴度虽稍有下降，但下降幅度不大于0.5LogCCID₅₀/ml，水痘下降不大于0.5LogPFU₅₀/ml。

按照世界卫生组织(WHO)及国家药品监督管理局(SDA)有关联合疫苗及冻干制剂制检规程及质量标准要求，对本发明所提供的联合疫苗进行全面检定，其结果各项质量指标均达到或超过世界卫生组织(WHO)及国家药品监督管理局(SDA)所规定的制检规程要求。其中甲型肝炎病毒滴度为不低于6.5LogCCID₅₀/ml，水痘病毒滴度为不低于4000FPU/ml。

联合疫苗中组分间相互干扰作用研究：

将冻干甲型肝炎疫苗复溶液体和冻干水痘疫苗复溶液体混合，感染2BS细胞，检测病毒滴度。将同一批次制得的冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗、冻干甲型肝炎疫苗和冻干水痘疫苗分别感染2BS细胞，检测病毒滴度。目的是检测混合后甲型肝炎和水痘两种活性病毒在同一个环境下有无相互促进、竞争或抑制等作用。甲型肝炎病毒滴度检测方法采用了荧光染色法，水痘病毒滴度检测方法采用了微量细胞病变法。试验结果见表1，联合疫苗中病毒滴度与单价苗一致。表明联合疫苗中活性组分甲型肝炎病毒和水痘病毒无相互促进或抑制现象。

表1水痘、甲型肝炎原液混合后病毒滴度与其单价疫苗原液病毒滴度的比较

同步混合感染HAV和VZV的标本电镜检查显示，HAV感染29天左右，达到增殖最高峰。感染VZV 2天后，细胞内可见到少量无包膜的VZV，增殖高峰期出现在8天。混合感染HAV、VZV与单独感染HAV和VZV的电镜检测结果无明显差异。结果见图1。

联合疫苗稳定性试验

三批联合疫苗及其单价疫苗组分别放置37℃ 3天、7天、9天、13天或7天、9天，取出3-5支样品混合，以37℃放置前的疫苗样品作为实验对照组，滴定甲型肝炎和水痘，方法为上述的荧光染色法和微量细胞病变法。37℃放置3天后的甲型肝炎病毒滴度下降不高于0.5Lg。水痘减毒活病毒37℃放置7天后滴度下降不高于1.0Lg。结果见表2、表3，符合规定要求。

表2冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗甲型肝炎病毒稳定性试验结果

表3冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗水痘病毒稳定性试验结果

联合疫苗的免疫原性试验

雌性BALB/c纯系鼠，4～5周龄。分冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗组、甲型肝炎疫苗对照组、水痘疫苗对照组。每组液体经腹腔免疫，每只小鼠免疫剂量为0.5ml。免后2周、3周、4周、5周采血，测抗体。抗体检测结果表明，联合疫苗组甲型肝炎抗体产生高峰时间与单价甲型肝炎疫苗组一致，而水痘抗体产生高峰时间，联合疫苗组较单价水痘疫苗组延后，但联合疫苗组抗体产生水平与单价疫苗组相当。结果见表4和图2、图3。

表4联合疫苗免疫后抗体阳转结果

联合疫苗的安全性试验

免疫豚鼠和BALB/c纯系小鼠，设常规剂量组和3倍剂量组，腹腔免疫。免后观察存活和健康情况，一周后称量体重，解剖作病理检查。

实验结果，豚鼠和小鼠免后无不良反应，全部存活，体重增加，解剖无病理改变。

本发明联合疫苗的积极效果在于：具有与其单价疫苗同样良好的安全性与免疫原性，可有效地预防甲型肝炎和水痘，不会因两种病毒的混合造成彼此干扰，亦不会导致任何免疫反应抑制作用或其他的不良反应。

本发明的冻干保护剂能够完全保证液态联合疫苗制品，在冷冻干燥过程中，以及冻干后的运输、储存和使用过程中，联合疫苗病毒滴度没有明显下降。与冻干前相比，冻干后甲型肝炎疫苗病毒滴度和水痘疫苗病毒滴度虽稍有下降，但下降幅度不大于0.5LogCCID₅₀/ml。

降低了联合疫苗的生产成本和市场价格，能以最简单的接种途径，一次接种后就能产生免疫，并且无毒副反应，提高疫苗接种效率，减少多次注射所带来的不良反应，从而有利于推广和普遍使用。

附图说明

图1、2BS细胞内典型HAV和VZV病毒形态(X80 000)：长箭头为HAV，短箭头为VZV。

图2、免后不同时间联合疫苗组与单价甲肝疫苗组各组甲肝抗体水平趋势图；

图3联合疫苗组与单价水痘疫苗组不同时间水痘抗体水平比较。

具体实施方式

实施例1：

冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗的制备

将1.2L甲型肝炎疫苗病毒的原液(L-A-1毒株，病毒滴度为8.0LogCCID₅₀/ml)与2.4L水痘疫苗病毒的原液(6000PFU)混合，然后加入如下制备的保护剂原液：保护剂组分A550ml、保护剂组分B600ml和保护剂组分C450ml。然后，再向如此得到的混合液中加入适当量作为病毒疫苗基质液的199综合液，使液态联合疫苗的总体积达到7200ml，使其中甲型肝炎疫苗病毒滴度不小于6.5LogCCID₅₀/ml，水痘疫苗病毒滴度不小于4000PFU/ml。如此稀释的结果也导致疫苗液中所加保护剂各组分的浓度(w/v)分别达到：海藻糖42g/l、右旋糖酐18.75g/l、谷氨酸钠7.64g/l、抗坏血酸1.53g/l、尿素6.1g/l、山梨醇6.1g/l、甘露醇6.1g/l。

为了制备冻干保护剂原液，可以首先按所示浓度将下列成分溶解于注射用水(1000ml)中：谷氨酸钠100.0g、抗坏血酸20.0g、尿素80.0g、山梨醇80.0g和甘露醇80.0g，并用0.1NHCL调整PH值至7.0。经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护组分A。然后称取海藻糖500.0g溶解于温度为37℃左右注射用水补至1000ml，经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组分B。最后再将300.0g右旋糖酐40溶解于温度约为37℃注射用水补至1000ml，经116℃高压蒸汽灭菌40分钟后得到保护剂组分C。

按照每西林瓶(或安瓿)1ml的体积分装上述联合疫苗液，然后将西林瓶(或安瓿)置于密闭的真空冷冻干燥器(FS150-SS20C型，Hull Co.，USA)内，按下述条件冷冻干燥：-30℃至-55℃低温条件预冷冻3至7小时，-30℃至35℃条件下真空干燥8至16小时，从而得到所需的冷冻干燥的甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗(20070626)。

实施例2：

冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗的制备

将1.2L甲型肝炎疫苗病毒的原液(L-A-1毒株，病毒滴度为8.0LogCCID₅₀/ml)与2.4L水痘疫苗病毒的原液(6000PFU/ml)混合，然后加入如下制备的保护剂原液：保护剂组分A550ml、保护剂组分B900ml和保护剂组分C900ml。然后，再向如此得到的混合液中加入适当量作为病毒疫苗基质液的199综合液，使液态联合疫苗的总体积达到7200ml，使其中甲型肝炎疫苗病毒滴度不小于6.5LogCCID₅₀/ml，水痘疫苗病毒滴度不小于4000PFU/ml。如此稀释的结果也导致疫苗液中所加保护剂各组分的浓度(w/v)分别达到：海藻糖62.5g/l、右旋糖酐37.5g/l、谷氨酸钠7.64g/l、抗坏血酸1.53g/l、尿素6.1g/l、山梨醇6.1g/l、L-精氨酸为1.53g/l。

为了制备冻干保护剂原液，可以首先按所示浓度将下列成分溶解于注射用水(1000ml)中：谷氨酸钠100.0g、抗坏血酸20.0g、尿素80.0g、山梨醇80.0g和L-精氨酸20.0g，并用0.1NHCL调整PH值至7.0。经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护组分A。然后称取海藻糖500.0g溶解于温度为37℃左右注射用水补至1000ml，经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组分B。最后再将300.0g右旋糖酐40溶解于温度约为37℃注射用水补至1000ml，经116℃高压蒸汽灭菌40分钟后得到保护剂组分C。

按照每西林瓶(或安瓿)1ml的体积分装上述联合疫苗液，然后将西林瓶(或安瓿)置于密闭的真空冷冻干燥器(FS150-SS20C型，Hull Co.，USA)内，按下述条件冷冻干燥：-30℃至-55℃低温条件预冷冻3至7小时，-30℃至35℃条件下真空干燥8至16小时，从而得到所需的冷冻干燥的甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗(20070821)。

实施例3：

冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗的制备

将2.4L甲型肝炎疫苗病毒的原液(L-A-1毒株，病毒滴度为8.0LogCCID₅₀/ml)与2.4L水痘疫苗病毒的原液(6000PFU/ml)混合，然后加入如下制备的保护剂原液：保护剂组分A550ml、保护剂组分B900ml和保护剂组分C900ml。然后，再向如此得到的混合液中加入适当量作为病毒疫苗基质液的199综合液，使液态联合疫苗的总体积达到7200ml，使其中甲型肝炎疫苗病毒滴度不小于6.5LogCCID₅₀/ml，水痘疫苗病毒滴度不小于4000PFU/ml。如此稀释的结果也导致疫苗液中所加保护剂各组分的浓度(w/v)分别达到：海藻糖62.5g/l、右旋糖酐37.5g/l、谷氨酸钠7.64g/l、抗坏血酸1.53g/l、尿素6.1g/l、甘露醇6.1g/l、L-精氨酸为1.53g/l。

为了制备冻干保护剂原液，可以首先按所示浓度将下列成分溶解于注射用水(1000ml)中：谷氨酸钠100.0g、抗坏血酸20.0g、尿素80.0g、甘露醇80.0g和L-精氨酸20.0g，并用0.1NHCL调整PH值至7.0。经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护组分A。然后称取海藻糖500.0g溶解于温度为37℃左右注射用水补至1000ml，经0.22μm滤膜过滤除菌后得到保护剂组分B。最后再将300.0g右旋糖酐40溶解于温度约为37℃注射用水补至1000ml，经116℃高压蒸汽灭菌40分钟后得到保护剂组分C。

按照每西林瓶(或安瓿)1ml的体积分装上述联合疫苗液，然后将西林瓶(或安瓿)置于密闭的真空冷冻干燥器(FS150-SS20C型，Hull Co.，USA)内，按下述条件冷冻干燥：-30℃至-55℃低温条件预冷冻3至7小时，-30℃至35℃条件下真空干燥8至16小时，从而得到所需的冷冻干燥的甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗(20070920)。

实施例4：

按照世界卫生组织(WHO)及国家药品监督管理局(SDA)有关联合疫苗及冻干制剂制检规程及质量标准要求，对本发明所提供的联合疫苗进行全面检定，其结果各项质量指标均达到或超过世界卫生组织(WHO)及国家药品监督管理局(SDA)所规定的制检规程要求。其中甲型肝炎病毒滴度为不低于6.5L0gCCID₅₀/ml，水痘病毒滴度为不低于4000FPU/ml。

按实施例1-3生产的冻干甲型肝炎-水痘减毒联合疫苗的各项检定结果如下表5所示。

表5、三批联合疫苗各项检定结果