从重组大肠杆菌XM－LU制备内切－β－1,3－1,4－葡聚糖酶的方法

摘要

从重组大肠杆菌XM－LU制备内切－β－1，3－1，4－葡聚糖酶的方法，涉及一种细菌培养基及发酵工艺。提供一种具有较高活性，适于工业化生产的从重组大肠杆菌XM－LU制备内切－β－1，3－1，4－葡聚糖酶的方法。重组大肠杆菌XM－LU是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，发酵培养基甘油8～12g·L－1、玉米浆9～15g·L－1、NaNO3 6～ 10g·L－1、NaCl 10g·L－1、KH2PO4 2.4g·L－1、K2HPO4 12.5g·L－1，卡那霉素0.05g·L－1，余为水；液体发酵条件为通气量0.8～1.5L/(L ·min)，自第10～16h起持续流加甘油原液8～20h。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌培养基及发酵工艺，尤其是涉及一种重组大肠杆菌XM-LU生长与内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶合成的发酵培养基及流加发酵工艺。

背景技术

β-葡聚糖是一类广泛存在于高等植物和真菌细胞壁中的多糖，是自然合成的多糖中含量最多的。如纤维素即为β-1，4-葡聚糖。很长一段时间有关β-葡聚糖酶的研究一直停留在对纤维素酶的研究阶段。20世纪60年代，首次出现源于丝状真菌的可降解非纤维素β-葡聚糖的β-葡聚糖酶，有关非纤维素酶系β-葡聚糖酶的研究才真正开始(Pitson S.M.，Seviour R.J.，McDougall B.M..Noncellulolytic fungalβ-glucanase：Their physiology and regulation.EnzymeMicrob.Technol.，1993，15：178-191.)。

β-葡聚糖酶指可以使β-葡聚糖降解为小分子糖的酶，系酶系家族中的水解酶类，按照其作用方式可分为内切、外切和葡萄糖苷酶，主要包括内-β-1，3-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.39)；内-β-1，4-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)；内β-1，3-1，4-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)；外-β-1，3-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.58)；外-β-1，4-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.74)以及少数内-β-1，6-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.75)和内-β-1，2-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.71)。内切型β-葡聚糖酶主要以随机的方式将β-葡聚糖降解成数段短链，外切酶则是从非还原末端开始作用，将β-葡聚糖切成一个个的葡萄糖，β-葡聚糖的完全降解一般都是两类酶协同作用的结果(Pitson S.M.，Seviour R.J.&Mc Dougall B.M..Noncellulolytic fungalβ-glucanase：Their physiology and regulation[J].Enzyme Microb.Technol.，1993，15：178-191.)。

β-葡聚糖是谷物的重要抗营养因子，在饲料中添加β-葡聚糖酶，特别是内切-β-葡聚糖酶，可迅速降低谷物中β-葡聚糖的粘度，大大提高饲料的生物转化率。1961年，Moscatelli等人首次发现了内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.73)，此酶只能水解β-1，3和β-1，4混合键连接的葡聚糖，对单一含有β-1，3或β-1，4糖苷键的葡聚糖不起作用。由于大麦等谷类作物中都含有大量混合的β-1，3和β-1，4糖苷键，因此内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶是麦类饲料中主要应用的一类β-葡聚糖酶，该酶在作为饲料添加剂改善谷类营养价值和啤酒风味方面发挥着重要的作用。1975年，美国首先正式使用β-葡聚糖酶加入饲料大麦来消除抗营养因子，取得良好效果，随后酶作为饲料添加剂的研究和应用得以推广。随着畜禽业的不断发展，以应用β-葡聚糖酶作为一种新型饲料添加剂已日益为人们所重视，而寻找β-葡聚糖酶的高产菌株也成为科学工作者关注的焦点。

20世纪80年代初，国外β-葡聚糖酶制剂产品逐渐进入国内市场。我国于20世纪80年代将该酶的生产及研究列入“六五”和“七五”攻关项目的子专题，在获得工业化生产菌后，又列入国家“火炬计划”，并于20世纪90年代开始生产和推广应用。20世纪末β-葡聚糖酶大规模应用于啤酒工业，效益显著。然而，目前国内对β-葡聚糖酶的研究仍多停留在实验室阶段，实际生产厂家屈指可数，并且这些厂家大都以木霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌和丝状真菌为出发菌株，不仅菌体生长慢、产量低，而且以固体发酵为主，后处理工艺粗糙，导致酶的稳定性差，损失率高，生产成本和使用成本相应提高。因此目前国内对β-葡聚糖酶的需求仍主要通过进口满足，来源窄、价格高。可见，有必要选育新的β-葡聚糖酶高产菌株、改善菌株培养条件与发酵工艺以提高酶产量，使彻底改变我国β-葡聚糖酶主要依靠进口的局面成为可能。

液体深层培养由于操作简单，发酵周期短，后处理容易，在β-葡聚糖酶的生产中被普遍采用。许多研究者对液体发酵β-葡聚糖酶的培养基组成和培养条件进行了优化。贺小贤和姜绪林(贺小贤，姜绪林.黑曲霉β-葡聚糖酶产酶培养基的研究.食品工业科技，2003，24(12)：21-23.)在应用黑曲霉(Aspergillus niger)生产内切-β-1，4-葡聚糖酶时，对产酶培养基进行了优化，最终确定大麦粉为最佳碳源，酵母粉和硫酸铵为最适氮源；最适浓度分别为大麦粉3％，酵母粉2％，硫酸铵0.2％。以此培养基进行发酵产酶，β-葡聚糖酶活达到78U·mL^-1。研究还发现，添加β-葡聚糖和吐温80对β-葡聚糖酶的产生有一定的促进作用。郑毅等(郑毅，陈接锋，马石金，等.黑曲霉FS25产β-葡聚糖酶发酵特性的研究.微生物学通报，，2001，28(4)：47-50.)在研究黑曲霉FS25摇瓶发酵生产β-1，3-1，4-葡聚糖酶时，对碳源、氮源、培养基初始pH、温度、摇瓶装液量、接种量及培养时间进行了优化，确定最佳产酶培养基组成及产酶条件为：大麦粉6g/L、玉米浆2g/L、(NH₄)₂SO₄ 0.4g/L、培养基初始pH 5.0、培养温度32℃、250mL三角瓶装液量50mL、接种量3％(v/v)、培养时间30h；在此条件下发酵β-葡聚糖酶活达80.1U·mL^-1。Beshay等(Beshay Usama，E1-Enshasy Hesham，Ismail I.M.K.β--glucanase production from genetically modified recombinant Escherichia coli：effect of growthsubstrate and development of a culture medium in shake flasks and stirred tank bioreactor.ProcessBiochem.，2003，39：307-313.)分别采用摇瓶和发酵罐培养重组E.coli BL21，用于生产来源于芽孢杆菌的杂合β-1，3-葡聚糖酶。通过摇瓶培养，确定酶合成的最佳碳源为乳糖，浓度7g·L^-1；最佳氮源为酵母粉，浓度24g·L^-1；NaCl浓度为5g·L^-1；在此条件下摇瓶发酵最高酶活达512U·mL^-1。采用3升发酵罐进行分批培养，通气量1.0L/(L·min)，搅拌转速800r/min，接种量10％(v/v)，pH 7.0，培养15h后，酶活达到526U·mL^-1。郝秋娟(郝秋娟，陈颖，李永仙等.温度对淀粉液化芽孢杆菌5582产β-葡聚糖酶的影响，中国酿造，2007，3：1-4)为进一步提高淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacien)BS5582产β-葡聚糖酶的水平，在5L发酵罐上，采用分阶段控温液体发酵工艺，通气量1.0L/(L·min)，搅拌转速500r/min，初始发酵温度36℃，培养27h(稳定期)后，降温至32℃至发酵终了，β-葡聚糖酶酶活达到182.52U/mL，比恒温发酵提高了28％。此外，林宇野(林宇野.丝状真菌产生β-葡聚糖酶的研究I.GCN平板的建立及产酶菌株的选育.福建师范大学学报，1995，11(3)：94-101.)，孙玉英等(孙玉英，王瑞明，关凤梅，等.局限曲霉产β-葡聚糖酶发酵特性的研究[J].酿酒科技，2003，118(4)：36-37)，石家骥和崔福绵(石家骥，崔福绵.产β-葡聚糖酶菌种T199的选育及发酵条件.微生物学报，2001，41(6)：750-752.)，Hong和Meng(Hong T.Y.&Meng M.Biochemicalcharacterization and antifungal activity of an endo-β-1，3-glucanase of Paenibacillus sp.isolatedfrom garden oil.Appl.Microbiol.Biotechnol.，2003，61：472-478.)，Burtseva(Burtseva Yu.V.，Verigina N.S.，Sova V.V.，et al.O-Glycosylhydrolases of marine filamentous fungi：β-1，3-glucanases of Trichoderma aureviride.Appl.Biochem.Microbiol.，2003，39(5)：475-481.)以及Wase(Wase D.A.J.，Vaid A.K.&McDermott C.Increase in endo-1，4-β-D-glucanase titres producedby Aspergillus fumigatus through application of simple statistical methods.Enzyme Microb.Technol.，1985，7：134-138.)等都对间歇发酵生产β-葡聚糖酶进行了研究。

然而间歇发酵过程也有明显的局限性：首先，要达到比较高的培养密度或较高产物量，就必须加入较高浓度的营养物质，但高浓度的营养物又会对微生物的生长产生抑制；其次，营养物质的不断消耗与副产物的积累同样限制细胞的持续生长和蛋白表达。而液体流加发酵则可以在一定程度上改善间歇发酵的弊端，如可通过流加底物使发酵体系中始终维持很低的基质浓度，这样不仅能解除底物抑制，而且通过维持底物浓度在一定的水平保证菌株的持续生长和产物的连续合成。流加发酵技术虽然已经成功用于维生素、氨基酸以及各种酶的生产，但在β-葡聚糖酶的发酵生产中却鲜有报道。

随着生物技术的高速发展，β-葡聚糖酶的研究取得极大进展，在各应用领域的重要性已充分显现，如何得到活性高且应用效果好的β-葡聚糖酶已成为亟待解决的问题。利用克隆重组技术构建高通量表达β-葡聚糖酶的菌株，并进行产酶条件的研究，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于针对β-葡聚糖酶的生产中存在的问题，提供一种具有较高活性，适于工业化生产的从重组大肠杆菌XM-LU制备内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶的方法。

本发明所述的重组大肠杆菌XM-LU是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，已于2007年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.2246。

本发明的具体操作步骤如下：

1)液体发酵培养基组成：

甘油8～12g·L^-1、玉米浆9～15g·L^-1、NaNO₃ 6～10g·L^-1、NaCl 10g·L^-1、KH₂PO₄ 2.4g·L^-1、K₂HPO₄ 12.5g·L^-1，卡那霉素0.05g·L^-1，其余为水；

2)流加发酵工艺：

液体发酵条件为通气量0.8～1.5L/(L·min)，搅拌速率350～450r/min，发酵温度37℃，自第10～16h起开始匀速持续流加甘油原液8～20h。

以8～12g·L^-1甘油为碳源时能合成具有较高活性的内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶。按质量比，将玉米浆和硝酸钠以3∶2复配作为液体发酵培养基的氮源时能合成具有较高活性的内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶。

流加发酵工艺的发酵罐可采用10L发酵罐，液体发酵培养基最好为6L。通气量最好为1L/(L·min)，搅拌速率最好为400r/min，流加甘油原液的速率可为1.04～2.00mL/min。

本发明的发酵培养基和液体发酵工艺能有效提高重组大肠杆菌XM-LU(大肠埃希氏菌Escherichia coli)的生物量和内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性，适合于重组基因高效稳定地表达。用本发明所述的培养基和发酵工艺进行发酵，重组大肠杆菌XM-LU菌体浓度可达3.84g/L，内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶活性达到679.29U/mL，这是目前报道的内切-β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最高产量。本发明用于发酵基因工程产物β-葡聚糖酶，能有效提高产品产量，大大降低成本。

附图说明

图1为本发明实施例恒速流加甘油发酵过程菌体生长与β-葡聚糖酶合成曲线。在图1中，横坐标为培养时间(h)，左纵坐标为甘油浓度(g/L)，右纵坐标为胞外β-葡聚糖酶活力(U/mL)和细胞干重(g/L)。◆-胞外β-葡聚糖酶活力；■-甘油浓度；●-细胞干重；↓-甘油开始流加。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明，以便为更好地理解本发明提供依据。

实施例1：分别选取不同的碳源，考察不同浓度的碳源对菌体生长和β-葡聚糖酶合成的影响。间歇培养条件：通气量1L/(L·min)，搅拌速率400r/min，发酵温度37℃。培养基中其他组分：酵母粉24g·L^-1、NaCl 10g·L^-1、KH₂PO₄ 2.4g·L^-1、K₂HPO₄ 12.5g·L^-1，卡那霉素0.05g·L^-1，其余为水。结果如表1所示。结果表明，以蔗糖和葡萄糖为碳源时，酶活力均较低，并且随着添加浓度的增加进一步降低。而以小麦粉为碳源时产酶效果最好，大麦粉和甘油次之。但由于小麦粉中绝大部分成分不溶于水，发酵结束后很难将细胞从其中分离出来，因此会对菌体和酶的后处理过程造成一定的影响。

表1碳源对菌体生长及产酶的影响

  碳源  添加量(％)  生物量(g·L^-1)  β-葡聚糖酶活力(U·mL^-1)   甘油    蔗糖    葡萄糖   大麦粉   小麦粉  0.60  1.00  5.00  0.60  1.00  5.00  0.60  1.00  5.00  5.00   5.00  4.15  4.30  4.46  3.85  4.00  4.07  2.83  2.76  2.11  -   -  20.80  35.90  24.27  12.80  9.85  9.07  2.91  2.90  1.65  23.73   40.49

实施例2：分别以甘油(10g·L^-1)和小麦粉(50g·L^-1)为碳源，在实施例1所述间歇培养条件下，考察不同氮源对细胞生长和β-葡聚糖酶合成的影响。培养基中除碳氮源以外的其他组分：NaCl 10g·L^-1、KH₂PO₄ 2.4g·L^-1、K₂HPO₄ 12.5g·L^-1，卡那霉素0.05g·L^-1，其余为水。结果如表2所示。

表2氮源对菌体生长及产酶的影响

  碳源  氮源  氮源添加量(％)  生物量(g·L^-1)  β-葡聚糖酶活力(U·mL^-1)      甘油      酵母粉  酪蛋白胨  牛肉膏  玉米浆   NaNO₃  NH₄NO₃  (NH₄)₂SO₄  尿素  2.40  1.2  3.6  3.6   1.2  1.2  1.2  1.2  1.78  4.67  4.79  4.02   0.10  0.26  0.14  0.44  181.90  17.50  10.12  220.08   3.52  10.30  6.90  8.21      小麦粉       酵母粉  酪蛋白胨  牛肉膏  玉米浆   NaNO₃  NH₄NO₃   (NH₄)₂SO₄  尿素  2.40  1.2  3.6  3.6   1.2  1.2   1.2  1.2  -  -  -  -   -  -   -  -  24.67  20.95  11.11  60.20   9.44  20.20   15.00  13.06

结果表明，以无机氮为唯一氮源时生物量很低，因而限制了酶的合成；而以酵母粉和玉米浆为有机氮源与甘油复配时，酶活性有显著提高。

实施例3：以甘油(10g·L^-1)为碳源，如实施例1所述间歇培养条件，考察有机和无机氮源复配对细胞生长和β-葡聚糖酶合成的影响。培养基中除碳氮源以外的其他成分如实施例2。结果如表3所示。

表3有机、无机氮组合对菌体生长及产酶的影响

  氮源种类  添加量(％)  生物量(g·L^-1)  β-葡聚糖酶活力(U·mL^-1)   酵母粉、NaNO₃    酵母粉、NH₄NO₃    酵母粉、(NH₄)₂SO₄    酵母粉、尿素    玉米浆、NaNO₃    玉米浆、NH₄NO₃    玉米浆、(NH₄)₂SO₄    玉米浆、尿素   2.40、1.20   1.20、0.72  2.40、1.20   1.20、0.34  2.40、1.2   1.20、0.56  2.40、1.20   1.20、0.255  2.40、1.20   1.2、0.72  2.40、1.20   1.20、0.34  2.40、1.20   1.20、0.56  2.40、1.20   1.20、0.255  1.00   0.86  2.85   0.98  2.74   1.22  2.33   0.77  3.84   2.57  3.68   1.68  3.10   2.05  4.30   3.34  102.20   297.71  80.27   195.09  114.00   150.05  47.09   109.11  306.51   286.54  166.00   110.52  168.17   141.47  120.76   131.35

由表3可见，酵母粉和玉米浆与无机氮源复配都能促进酶的合成，尤其是酵母粉和NaNO₃(1.20∶0.72)复配时，酶活达到近300U/mL，玉米浆与NaNO₃(2.4∶1.2)复配时，酶活达306.51U/mL。但玉米浆对菌体生长的刺激作用更加明显，在各种不同的复配浓度下，生物量普遍高于酵母粉和无机氮源的复配效果。考虑到生物量和培养基的制作成本，选择玉米浆和NaNO₃复配作为β-葡聚糖酶合成培养基的氮源。

实施例4：以甘油10g·L^-1、NaNO₃ 10g·L^-1、NaCl 10g·L^-1、KH₂PO₄ 2.4g·L^-1、K₂HPO₄12.5g·L^-1作为发酵培养基成分，如实施例1所述间歇培养条件，考察不同玉米浆浓度对菌体生长和产酶的影响。结果如表4所示。

表4玉米浆浓度对菌体生长和产酶的影响

  玉米浆(g·L^-1)  生物量(g·L^-1)  β-葡聚糖酶活力(U·mL^-1)    18  3.95  430.7  16  3.78  482.0  15  9  3.28  3.22  498.2  466.8

可见，玉米浆最佳浓度为15g/L，此时β-葡聚糖酶活力达到498.2U·mL^-1，细胞密度达3.28g/L。

实施例5：采用如实施例4所述发酵条件，考察玉米浆和硝酸钠不同配比对菌体生长和产酶的影响。其区别在于发酵培养基中玉米浆9g·L^-1，NaNO₃ 6g·L^-1。

实施例6：采用如实施例4所述发酵条件，考察玉米浆和硝酸钠不同配比对菌体生长和产酶的影响。其区别在于发酵培养基中玉米浆12g·L^-1，NaNO₃ 8g·L^-1。

实施例7：采用如实施例4所述发酵条件，考察甘油浓度对菌体生长和产酶的影响。其区别在于甘油浓度8g·L^-1，玉米浆12g·L^-1，NaNO₃ 8g·L^-1。

实施例8：采用如实施例4所述发酵条件，考察甘油浓度对菌体生长和产酶的影响。其区别在于甘油浓度12g·L^-1，玉米浆15g·L^-1，NaNO₃ 10g·L^-1。

实施例9：在上述优化培养基的基础上，进行β-葡聚糖酶的流加发酵。在10L发酵罐上，培养自第12h起，持续匀速流加甘油8h，流加速率为1.04mL/min。结果如图1所示。

由图1可见，在上述流加发酵条件下，细胞干重由间歇发酵的3.28g/L增加到3.84g/L，β-葡聚糖酶活性由间歇发酵的498.2U/mL提高到679.29U/mL，表明流加甘油对于细胞生长和产酶都有较大幅度的提高，流加效果显著。

实施例10：采用实施例9所述发酵条件，进行β-葡聚糖酶的流加发酵。其区别在于，培养自第10h起，持续匀速流加甘油8h，流加速率为2mL/min。

实施例11：采用实施例9所述发酵条件，进行β-葡聚糖酶的流加发酵。其区别在于，培养自第16h起，持续匀速流加甘油20h，流加速率为2mL/min。