水产品中致病菌多重PCR快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及一种微生物检测装置及检测方法。所述的水产品中致病菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于包括：10×PCR buffer，1.0～3.0mmol/LMgCl2，240μmol/L dNTP each，60～200nmol/L沙门氏菌引物，60～200nmol/L副溶血性弧菌引物，200nmol/L单核增生李斯特氏菌引物，1.3～3.0 U Taq酶。本发明有较好的特异性，简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的同时检测，人工污染水产品检测限为10cfu/mL；为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段，有良好的应用前景。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种微生物检测装置及检测方法。

【背景技术】

我国是一个水产大国，随着社会发展和人们对健康的关注以及国际贸易需要，水产品安全问题倍受关注，水产品安全问题直接影响渔业经济发展乃至水产品国际贸易。由于水产品营养丰富，因而极易受到各种微生物的污染，沙门氏菌(Salmonella spp.)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是常见的引起水产品污染的重要致病菌，在我国现行国家卫生标准中，这3种菌被列为无公害水产品不得检出的致病菌。目前，包括我国在内的许多国家对这些致病菌的检验大多仍沿用传统的细菌培养及生化鉴定方法，其检测周期长、操作繁琐、灵敏度低，而且每次只能检测出一种致病菌，面对日益增加的多重混合污染，目前的实验诊断方法显得严重滞后。因此，国内外学者都致力于建立分子生物学的鉴定方法。

由于多重PCR技术可以在一个反应管中同时检测多种病原微生物，具有高效、低成本、速度快等优点，一经提出，即得到众多研究者的青睐，目前已在病原微生物的检测中得到了广泛应用。选择特异的靶基因和设计出合理的引物对PCR检测致病菌至关重要。沙门氏菌的侵袭蛋白决定细菌进入宿主上皮细胞的能力，与沙门氏菌的致病性密切相关，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一组基因编码，其中invA为沙门氏菌的主要毒力因子(ZhaoS，Qaiyumi S，Friedman S，et al.Characterization of Salmonella enterica Serotype newport isolated from humans and food animals.J ClinMicrobiol，2003，41(12)：5366-5371.)。研究证明沙门氏菌的invA基因序列比较保守，可以作为PCR检测沙门氏菌的靶基因(Cohen ND.Neibergs HL.Megruder ED，et al.Genus-specific detection of salmonellae using the polymerase chain reaction.J Vet Diagn Invest，1993，5(3)：368-371.)。副溶血性弧菌的PCR检测方法中，多以其毒力基因tdh和trh为靶基因，但后来研究发现某些不含这两种毒力基因的副溶血性弧菌菌株也具有致病性(Osawa R，Arakawa E.Genotyping of pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 still open to quention.J Clin Microbiol，2002，40(7)：2708-2709.)。本文选取toxR作为检测副溶血性弧菌的靶基因，toxR基因在弧菌属中具有高度的保守性，实验证明副溶血性弧菌的toxR基因与霍乱弧菌的toxR基因的同源性是52％，要比它们的rRNA基因的同源性92％低得多(Kita-Tsukamoto K，Oyaizu H，Nanba K，et al.Phylogenetic relationships ofmarine bacteria，mainly members of the family Vibrionaceae，determined on the basis of 16S rRNA sequences.Int J Syst Bacteriol，1993，43(1)：8-19.及Lin Z，Kumagai K，Baba K，et al.Vibrio parahaemolyticus has a homolog of the Vibrio cholerae toxRS operon that mediatesenvironmentally induced regulation of the thermostable direct hemolysin gene.J Bacteriol，1993，175(12)：3844-3855.)。单核细胞增生性李斯特氏菌的靶基因则采用编码主要胞外蛋白p60的iap基因，它是单核细胞增生性李斯特氏菌重要毒力因子(Bubert A，Hein I，Rauch M，et al.Detection and differentiation of Listeria spp.by a single reaction based on multiplex PCR.Appl Environ Microbiol，1999，65(10)：4688-4692.)。

【发明内容】

本发明提供了一种能同时检测水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的多重PCR检测试剂盒以及检测方法。

本发明所述的检测试剂盒，包括：10×PCR buffer，1.0～3.0mmol/LMgCl₂，240μmol/L dNTP each，60～200nmol/L沙门氏菌引物，60～200nmol/L副溶血性弧菌引物，200nmol/L单核增生李斯特氏菌引物，1.3～3.0U Taq酶。

其中，三种菌的引物序列及PCR扩增产物大小分别如表1所示。

表1：三种菌的引物序列及PCR扩增产物大小

  细菌  靶基因  引物序列  扩增产物(bp)Salmonella.sppinvA  上游：5’-ATC GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G-3’下游：5’-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-3’495  Listeriamonocytogenesiap  上游：5’-CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT-3’下游：5’-TTA TAC GCG ACC GAA GCC AAC-3’660  VibrioparahaemolyticustoxR  上游：5’-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG-3’下游：5’-ATA CGA GTG GTT GCT GTC ATG-3’368

本发明所述的检测方法，包括提取样品DNA，多重PCR扩增，扩增后的产物进行电泳检测，分析结果。

较优选地，在提取DNA之前，对样品进行沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的富集培养，培养基为含2％质量(脑心浸液肉汤培养基干粉质量)含量的NaCl的脑心浸液肉汤，培养温度为37℃，培养时间为10小时。

其中，样品DNA提取包括：1)1.5mL样品，10000r/min离心10min，去上清液；2)加567μL TE悬浮沉淀，加50g/L溶菌酶10μL 37℃保温1h，再加30μL100g/L SDS，3μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；3)加100μL 5mol/L NaCl，混匀；4)加80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；5)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v∶v∶v)抽提，10000r/min离心10min，将上层清液移至干净离心管；6)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，v∶v)抽提，取上清液移至干净离心管中；7)加等体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置30min，沉淀DNA；8)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于100μLTE，-20℃保存。

多重PCR扩增包括：1)多重PCR扩增反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2mmol/L MgCl₂，240μmol/L dNTP each，引物浓度分别为：单核增生李斯特氏菌引物200nmol/L，沙门氏菌、副溶血性弧菌引物各60～200nmol/L，3UTaq酶，DNA模板2μL，反应体系25μL。2)扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于4℃下保存。

扩增产物电泳检测包括：将扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳检测及UVI凝胶成像系统分析结果。

本发明有较好的特异性，简便、快速、灵敏地实现水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的同时检测，人工污染水产品检测限为10cfu/mL；为无公害水产品食源性致病菌的快速检测提供了理想手段，有良好的应用前景。

此外，本发明对食品样品中的目标菌进行增菌培养，有效提高了样品的检测敏感性。选用能同时富集多种细菌的培养基，从而节约成本，提高检测效率。

【附图说明】

图1为引物灵敏度检测的电泳图，其中：

M：100bp分子量标准，

1：稀释度为10^-3

2：稀释度为10^-4

3：稀释度为10^-5

4：稀释度为10^-6

5：稀释度为10^-7

6：稀释度为10^-8

7：稀释度为10^-9

8：空白对照

【具体实施方式】

实施例一：引物特异性检测

根据所设计的3对特异性PCR引物对40株常见致病菌进行PCR检测，利用正交反应多次试验，阴性、阳性结果见表2。结果显示：invA引物检测的10株沙门氏菌全部扩增出495bp的目的片段，其它30株非沙门氏菌菌株无任何扩增条带；toxR引物检测的4株副溶血性弧菌均扩增出368bp的目的片段，霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和其它非弧菌属菌株均无任何扩增条带；iap引物检测的5株单核细胞增生性李斯特氏菌均扩增出660bp的目的片段，威尔氏李斯特氏菌、英诺克李斯特氏菌扩增出小于660bp的非目的片段，格式李斯特氏菌和其它非李斯特氏菌属的菌株均无任何扩增条带。结果表明，3对引物仅对它们的目标生物特异。

表2引物特异性电泳结果

  Strain  Source  invA  toxR  iap  Salmonella typhi  CMCC50098  +  -  -  S.typhimuriumn  CMCC50115  +  -  -  S.typhi  CMCC50071  +  -  -  S.paratyphi A  CMCC50093  +  -  -  S.paratyphi B  CMCC50004  +  -  -  S.choleraesuis  CMCC50018  +  -  -  S.tho-mpson  CMCC50023  +  -  -  S.enteritidis  CMCC30335  +  -  -  S.arizonae  CMCC47001  +  -  -  S.typhimurium  GIM20201  +  -  -  Vibrio parahaemnolyticus  ATCC17802  -  +  -  V.parahaemolyticus  VPL4-90  -  +  -  V.parahaemolyticus  GIM30102  -  +  -  V.parahaemolyticus  GIM30104  -  +  -  V.cholerae  VbO  -  -  -  V.alginolyticus  GIM30103  -  -  -  V.vulnificus  GIM30105  -  -  -  Listeria monocytogenes  CMCC54002  -  -  +  L.monocytogenes  CMCC54003  -  -  +  L.monocytogenes  CMCC54004  -  -  +  L.monocytogenes  GIM60101  -  -  +  L.monocytogenes  GIM60102  -  -  +  L.welshimeri  GIM60104  -  -  -  L.innocua  GIM60105  -  -  -

  L.grayi  GIM60107---  Escherichia coli  NCTC12900---  E.coli  ATCC43889---  E.coli  GIM20102---  E.coli  GIM20101---  E.coli  GDCIQ O157-h---  E.coli  CMCC44113---  E.coli  CMCC44102---  E.coli  ATCC8739---  E.coli  ATCC25922---  E.coli  8099---  Yersinia enterocolitica  广临检-52---  Shigella sonnet  CMCC51592---  Enterobacter aerogenes  CMCC45103---  Citrobacter freundii  ATCC8090---  Enterobacter cloacae  CMCC45301---

注：NCTC(United Kingdom National Collection of Type Cultures，英国国立标准菌种收藏所)，CMCC(National Center for Medical Culture of Collections，中国医学细菌保藏管理中心)，ATCC(AmericanType Culture Collection，美国标准菌种保藏中心)，GDCIQ(Guangdong Entry-Exit Inspection andQuarantine Bureau，广东出入境检验检疫局)，GIM(Guangdong Institute of Microbiology，广东省微生物研究所)，VPL4-90(上海疾病控制中心来源菌种)

实施例二：引物灵敏度检测

将标准菌株S.typhimurium CMCC50115、V.parahaemolyticus VPL4-90、L.monocytogenes CMCC54002的培养液(平板计数结果分别为：2.5×10⁹cfu/mL、1.5×10⁹cfu/mL、4.7×10⁹cfu/mL)等量混合后，做10倍梯度稀释，然后将各个梯度稀释液分别接种到含10g碎鱼肉的90mL脑心浸液肉汤培养液(含脑心浸液肉汤培养基干粉质量2％的NaCl)中，培养10h后，提取DNA进行多重PCR检测。结果如图1所示。将可检测到的最高稀释浓度作为多重PCR在样品中的最高检测灵敏度。则结果表明可检测的最高稀释度为10^-9，即可检测到的三种菌的浓度分别为2.5cfu/mL沙门氏菌、1.5cfu/mL副溶血性弧菌、4.7cfu/mL单核细胞增生性李斯特氏菌。

实施例三、培养基的增菌比较

分别使用普通营养肉汤液培养液、脑心浸液肉汤培养液和本发明所述的含2％(脑心浸液肉汤培养基干粉质量含量)NaCl脑心浸液肉汤培养液，同时富集培养沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌，比较三种培养液的增菌效果。

将沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌加入到5mL培养液中，37℃培养18h后，平板计数，其结果如表3所示。结果表明，本发明所述的含2％(脑心浸液肉汤培养基干粉质量含量)NaCl脑心浸液培养液对沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的增菌效果较好。

表3三种培养液富集培养目标菌的结果

  沙门氏菌cfu/mL  副溶血性弧菌cfu/mL  单核细胞增生性李斯特氏菌cfu/mL  普通营养肉汤液培养液  2×10⁹  2.8×10⁶  6.1×10⁸  普通脑心浸液肉汤培养液  4.25×10⁹  2.0×10⁸  1.6×10⁹  含2％NaCl脑心浸液肉汤培养液  2.0×10⁹  1.0×10⁹  4.0×10⁹

实施例四、使用本发明所述的多重PCR快速检测试剂盒检测花甲中的沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌。

1、富集培养

采用无菌操作随机取样10g，加入到90mL含2％(脑心浸液肉汤培养基干粉质量含量)NaCl脑心浸液肉汤培养液中，37℃培养10小时。

2、DNA提取

1)取1.5mL培养物，10000r/min离心10min，去上清液；2)加567μL TE悬浮沉淀，加50g/L溶菌酶10μL 37℃保温1h，再加30μL100g/L SDS，3μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；3)加100μL 5mol/L NaCl，混匀；4)加80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；5)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v∶v∶v)抽提，10000r/min离心10min，将上层清液移至干净离心管；6)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，v∶v)抽提，取上清液移至干净离心管中；7)加等体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置30min，沉淀DNA；8)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于100μLTE，-20℃保存。

3、多重PCR扩增

1)多重PCR扩增反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2mmol/L MgCl₂，240μmol/L dNTP each，引物浓度分别为：单核增生李斯特氏菌引物200nmol/L，沙门氏菌、副溶血性弧菌引物各60nmol/L，3U Taq酶，DNA模板2μL，反应体系25μL。

2)扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于4℃下保存。

4、扩增产物电泳检测

将扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像系统分析结果，产物大小为495bp，说明检测的花甲中含沙门氏菌。

实施例五、使用本发明所述的多重PCR快速检测试剂盒检测牡蛎中的沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌。

1、富集培养

采用无菌操作随机取样10g，加入到90mL含2％(脑心浸液肉汤培养基干粉质量含量)NaCl脑心浸液肉汤培养液中，37℃培养10小时。

2、DNA提取

1)取1.5mL培养物，10000r/min离心10min，去上清液；2)加567μL TF悬浮沉淀，加50g/L溶菌酶10μL 37℃保温1h，再加30μL100g/L SDS，3μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；3)加100μL 5mol/L NaCl，混匀；4)加80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；5)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v∶v∶v)抽提，10000r/min离心10min，将上层清液移至干净离心管；6)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，v∶v)抽提，取上清液移至干净离心管中；7)加等体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置30min，沉淀DNA；8)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于100μLTE，-20℃保存。

3、多重PCR扩增

1)多重PCR扩增反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2mmol/L MgCl₂，240μmol/L dNTP each，引物浓度分别为：单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌引物各200nmol/L，3U Taq酶，DNA模板2μL，反应体系25μL。

2)扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于4℃下保存。

4、扩增产物电泳检测

将扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像系统分析结果，产物大小分别为660bp和368bp，说明检测的牡蛎中含副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌。

实施例六、使用本发明所述的多重PCR快速检测试剂盒检测青口中的沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌。

1、富集培养

采用无菌操作随机取样10g，加入到90mL含2％(脑心浸液肉汤培养基干粉质量含量)NaCl脑心浸液肉汤培养液中，37℃培养10小时。

2、DNA提取

1)取1.5mL培养物，10000r/min离心10min，去上清液；2)加567μL TE悬浮沉淀，加50g/L溶菌酶10μL 37℃保温1h，再加30μL100g/L SDS，3μL20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；3)加100μL 5mol/L NaCl，混匀；4)加80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；5)用等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，v∶v∶v)抽提，10000r/min离心10min，将上层清液移至干净离心管；6)用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1，v∶v)抽提，取上清液移至干净离心管中；7)加等体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置30min，沉淀DNA；8)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于100μLTE，-20℃保存。

3、多重PCR扩增

1)多重PCR扩增反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2mmol/L MgCl₂，240μmol/L dNTP each，引物浓度分别为：单核增生李斯特氏菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌引物各200nmol/L，3U Taq酶，DNA模板2μL，反应体系25μL。

2)扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于4℃下保存。

4、扩增产物电泳检测

将扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像系统分析结果，产物大小分别为495bp、660bp和368bp，说明检测的青口中含沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌。