一株低温解烃的极小单胞菌T7－7及其用途

摘要

一株低温解烃的极小单胞菌T7－7及其用途。本发明菌株是从石油污染的海底泥中分离，以液蜡为唯一碳源的情况下在15℃反复驯化培养而获得，其命名为Pusillimonas sp.T7－7，其保藏号为CGMCC No.2172。该菌可在普通牛肉汁、LB、营养琼脂营养培养基中生长，也可在添加葡萄糖的无机盐培养基中生长，还可以以烷烃或原油为碳源生长。本发明提供的T7－7菌在15～30℃最适温度条件下，能够以烃为碳源和能源生长，能够利用16碳～32碳的正构烷烃，对原油(5g/L)的降解率可达16％以上，对中长链正构烷烃降解率最高可达40％以上；当该菌株与其他产表面活性剂的解烃菌株混合培养，协同作用于原油时可获得更高的降解率，因此可用于海洋石油污染的生物修复。

说明书

【技术领域】

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)菌株，及其在海洋石油烃污染的生物修复中的应用。

【背景技术】

随着工业的迅猛发展，水污染日益严重，而海洋污染更成为令人关注的世界性环境问题。在海洋各种污染物中，石油污染是最普遍和严重的一种。石油是当今支撑人类生活的主要能源，并且在可预见的将来其主导地位很难被动摇，因此石油在存储、运输和加工过程中造成的环境污染也必将日趋严重。据联合国国际海事组织(IMO)统计，全球每年通过各种途经流入海洋的石油及其制品已达1.0×10⁸～1.5×10⁸吨。海洋石油污染主要来源于海上石油生产、海洋运输、城市污染废水排放等。石油进入水体后，对生物和生态环境造成严重污染，大量的海鸟和鱼类等海洋生物的生存繁殖受到影响，一些有毒化合物也因此进入生物链，给生态环境及人类的生产活动和生活健康带来巨大的危害。

目前，治理海洋石油污染已成为当今世界各国环境专家的研究热点。为了消除海洋石油污染，国内外学者做了大量工作，寻求安全、可靠、经济有效的治理方法。石油污染的处理方法主要有物理处理法、化学处理法和生物法三种。物理方法除油时，很难去除表面的油膜和海水中的溶解油；采用化学法实际上是向海洋投加人工合成的化学物质，很有可能会造成二次污染。海洋微生物具有数量大、种类多、特异性和适应性强、分布广、世代时间短、比表面积大的特点，与物理和化学方法相比，利用微生物降解石油烃类化合物的生物修复技术价格低，去除污染物更彻底，且产物是CO₂、水和醇等无毒害物质，因此该技术在治理海洋石油污染方面具有非常广阔的前景。

生物修复(Bioremediation)是指生物尤其是微生物催化降解环境污染物，减少或最终消除环境污染的受控或自发过程。在生物修复作用下，污染物转化为稳定且无毒的代谢终产物，如CO₂、水、简单的醇和酸及微生物自身，最终从环境中消失。实践表明，生物修复是一种高效、经济且生态可承受的清洁技术。生物修复的基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用，由于自然界的生物修复过程一般较慢，难以实际推广应用，因此一般指人为促进条件下的生物修复。

由于海洋的低温、高盐度的特殊环境条件，因此得到能耐低温、高盐的海洋环境，并在此环境条件下能够对石油烃高效降解的菌株的获得是进行海洋石油污染的生物修复的首要问题。

【发明内容】

本发明的目的是解决海洋石油污染日益严重的问题，提供一种极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)和该菌在海洋石油污染的生物修复中的应用。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)菌株，于2007年9月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市朝阳区大屯路3号，中国科学院微生物研究所)，命名为Pusillimonas sp.T7-7，其保藏号为CGMCC No.2172。并于2006年7月1 2日保藏于“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(DSMZ)”，保藏号为DSM 18250^T。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)菌株，是从石油污染的海底泥中分离，以液蜡为唯一碳源的情况下在15℃反复驯化培养而获得。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)的菌落特征：在LB平板上培养两天的菌落大小直径0.5～1mm，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，半透明。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)的细胞形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，单端极生鞭毛，能运动，兼性好氧，细胞大小0.2-0.5μm(宽)×0.5-1.0μm(长)。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)的生理生化特征：生长温度4-37℃，生长pH范围6-9，NaCl耐受性高达5.5％。接触酶，亚硝酸盐还原，脲酶，硫化氢产生，分解七叶苷实验均为阳性；M.R.V-P，吲哚产生，硝酸盐还原，反硝化，淀粉水解，产氨，明胶水解实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；石蕊牛奶试验为产碱型。降解中长链烷烃及相应的醇、酸。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)细胞壁脂肪酸分析：T7-7与菌株Pusillimonas noertemannii BN9T(Stolz et al，2005)的细胞壁脂肪酸性质比较，主要成分都含有碳16饱和脂肪酸及碳17Δ-cis-9，10亚甲基脂肪酸，但BN9T中碳19Δ-cis-11，12亚甲基脂肪酸占有很大比重，而在T7-7中则比重较小。T7-7与菌株Pusillimonasnoertemannii BN9^T仍然有一定的差异(见表一)。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)的16S rRNA基因序列特征：CGMCC No.2172接种于LB培养基，30℃摇床培养(180rpm)24小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用上游引物(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送大连宝生物公司进行测序。PCR条件为：94℃，5min；94℃，45s，56.2℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃9min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1493p，在GenBank中的登录号为DQ417606，与Pusillimonas noertemannii的16S rDNA(GenBank accession No.AY695828)序列相似性为96.65％，进化距离为0.00568。其16S rDNA的序列如序列表所示。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)DNA碱基组成(G+C mol％)分析：根据T7-7 DNA的热变性曲线、Pusillimonas noertemannii BN9^T和E.coli K12 AS.1.365的热变性曲线(图4)计算，T7-7的Tm值为64.5℃，Pusillimonas noertemannii BN9^T的Tm值为68.5℃，E.coli的Tm值为64℃，算出T7-7的G+Cmol％为52.24％，BN9^T的G+Cmol％为62.18％。结果说明T7-7与Pusillimonas noertemannii BN9^T存在一定的差异。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)与Pusillimonas noertemanniiBN9^T之间DNA/DNA同源性测定：通过对各个DNA样品的温度对OD260的曲线见图5，根据直线斜率计算菌株T7-7与Pusillimonas noertemannii BN9^T的全基因组DNA同源性为66.67％，低于国际种间杂交标准的70％(Wayne et al，1987)。

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，细胞壁脂肪酸分析，168 rDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，以及DNA碱基组成(G+C mol％)分析和与Pusillimonas noertemannii BN9T之间DNA/DNA同源性测定，经多项分类鉴定T7-7菌株为一新菌，属于极小单胞菌属(Pusillimonas)，经过Professor J.P.Euzéby的协助，命名为Pusillimonas sp.T7-7。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中生长，也可以在添加葡萄糖的无机盐培养基中生长，也可以以烷烃或原油为碳源生长。菌株在4-37℃之间的一适宜温度下兼性厌氧生长。

本发明提供的极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)具有一定的降解石油烃的能力，可降解C16～C32的正构烷烃和原油。用T7-7生长细胞进行降解实验结果表明，该菌在15-30℃温度条件下，通过基础培养基生长繁殖过程能同时降解加入的5g/L的烷烃或原油，其基础培养基组成为g/L：KH₂PO₄ 3.48，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5，(NH₄)₂SO₄ 4.0，MgSO₄·7H₂O 0.70，酵母提取物0.05，pH 7.0～7.2。往复摇床180rpm转速培养72h。对中长链烷烃降解率最高的可达40％以上，最低也在10％左右。如图1所示。T7-7还能够利用中长链醇类及酸类较好的生长如图3所示。另外，当菌株T7-7与其他产表面活性剂的解烃菌株混合培养，协同作用于原油时可获得更高的降解率(见图6)。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供的Pusillimonassp.T7-7菌在15～30℃最适温度条件下，能够以烃为碳源和能源生长，能够利用16碳～32碳的正构烷烃，对原油(5g/L)的降解率可达16％以上，对中长链正构烷烃单独作用时降解率最高可达40％以上；该菌株具有能够适应低温及高盐度极端环境的性质，以及能够对海洋石油污染物进行较有效的降解作用，因此可以应用于海洋石油污染的生物修复。

【附图说明】：

图1是Pusillimonas sp.T7-7菌对各链长单烷烃的降解效果；

图2是Pusillimonas sp.T7-7菌对柴油降解的气相色谱图；A未接菌的对照，B为作用后；

图3是Pusillimonas sp.T7-7利用中长链醇类及有机酸类的生长情况；A.T7-7利用有机酸类的生长情况；B.T7-7对利用醇类的生长情况。

图4是T7-7 DNA的热变性曲线、Pusillimonas noertemannii BN9^TDNA以及E.coli K12AS.1.365的热变性曲线；A.E.coli K12的热变性曲线；B.T7-7的热变性曲线；C.Pusillimonasnoertemannii BN9^T的热变性曲线；

图5是Pusillimonas sp.T7-7和Pusillimonas noertemannii BN9^T基因组杂交复性曲线；

图6是Pusillimonas sp.T7-7菌与红平红球菌3C-9(Rhodococcus erythropolis 3C-9)混合培养时对不同原油降解的气相色谱图；A.孤岛稀油对照；B.孤岛稀油经混合菌降解后；C.官69稠油对照；D.官69稠油经混合菌降解后。

表1是Pusillimonas sp.T7-7和Pusillimonas noertemannii BN9^T菌株细胞壁脂肪酸含量分析。

【具体实施方式】

实施例1

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株的筛选和育种。

从渤海被石油污染的海底区域采集泥样，经纬度坐标为东经118°26′36″及北纬38°50′30″。取5g泥样于100mL液体石蜡为唯一碳源的无机盐培养基中(培养基组成：KH₂PO₄ 3.48，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5，NH₄ SO₄ 2，MgSO₄·7H₂O 0.70，酵母提取物0.05；液体石蜡含量2％；蒸馏水，1000ml；pH7.2；121℃灭菌30min)，置于200r/min低温摇床15℃富集培养7天，划线得到7株菌的混合菌群命名为T7-1～T7-7；吸取5mL富集液移至新鲜的100mL液体石蜡培养基中，进行发酵培养，培养条件同上；经过三个周期富集后最终得到两株主体菌，T7-2和T7-7；在LB固体平板上反复划线，挑取单菌落划斜面保存；将两株菌分别取一环接入装有5mL LB培养液的试管内，15℃震荡培养48h，作为种子液；分别取1mL种子液接入装有50mL柴油无机盐培养基的250mL三角瓶中，15℃震荡培养7d，检测菌株对柴油的降解作用，见图2。

菌株对单烷烃、柴油及原油的降解作用均通过Agilent 6820气相色谱仪进行检测，使用角鲨烷作为内标。具体方法如下：

将菌株培养后的培养液或者对照样品，加入适量正己烷，完全密闭条件下充分振荡混匀萃取，静置分层后取出大部分有机相，再向混合体系中加入正己烷进行二次萃取，重复萃取3次，萃取的有机相合并在一起加入角鲨烷至终浓度为0.006％(w/v)作内标，定溶至所需体积后按以下方法进行气相色谱分析。经计算得T7-7对柴油的降解率为16.13％。

样品用Agilent 6820气相色谱仪系统进行分析，色谱柱为SPB^TM-5 capillary column(30m×0.53mm i.d.1.5μm thickness)(Supelco)。色谱程序如下：

进样口：280℃；

柱温：

检测器(FID)温度：350℃；

载气(N₂)35mL/min；

空气400mL/min；

氢气(H₂)30mL/min；

尾吹(N₂)20mL/min。

根据未接菌对照和降解后残余峰面积与加入的角鲨烷内标峰面积的比值来表征底物的降解情况。

实施例2：

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株的形态特征和生理生化特征。

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》(Vol.VIII)的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。接触酶，氧化酶，M.R.实验，V-P实验，吲哚产生，硝酸盐还原，亚硝酸盐还原，反硝化，淀粉水解，产氨实验，脲酶，硫化氢产生，明胶水解，葡萄糖发酵，石蕊牛奶试验，分解七叶苷实验。

革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，单端极生鞭毛，能运动，兼性好氧，细胞大小0.2-0.5μm(宽)×0.5-1.0μm(长)。生长温度4-37℃，生长pH范围6-9，NaCl耐受性高达5.5％。接触酶，亚硝酸盐还原，脲酶，硫化氢产生，分解七叶苷实验均为阳性；M.R.V-P，吲哚产生，硝酸盐还原，反硝化，淀粉水解，产氨，明胶水解实验为阴性；葡萄糖发酵为氧化型；石蕊牛奶试验为产碱型。

实施例3：

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株的细胞壁脂肪酸分析。

取适量细菌培养物，置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液I(45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水)，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5～10秒，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；待样品管冷却后，加入2ml溶液II(190ml浓盐酸，275ml甲醇溶于135ml蒸馏水)，盖严振荡，随后精确控制80±1℃水浴10min，冰浴冷却；加入1.25ml溶液III(200ml正己烷与200ml乙醚混合均匀)，快速振荡10min左右，弃去下层水相；有机相中加入3ml溶液IV(10.8克氢氧化钠溶于900ml蒸馏水)及几滴溶液V(饱和氯化钠溶液)，快速振荡5min左右，取2/3上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。

分析方法：HP 6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HP CHEMSTATION verA 5.01)；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每min5℃升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100∶1，进样量2μl；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，补充气(氮气)流速30ml/min。

结果表明，T7-7与菌株Pusillimonas noertemannii BN9^T(Stolz et al，2005)的细胞壁脂肪酸性质比较，主要成分都含有碳16饱和脂肪酸及碳17Δ-cis-9，10亚甲基脂肪酸，但BN9^T中碳19Δ-cis-11，12亚甲基脂肪酸占有很大比重，而在T7-7中则比重较小。T7-7与菌株Pusillimonas noertemannii BN9^T仍然有一定的差异(见表1)。

表1 T7-7与BN9^T菌株细胞壁脂肪酸含量分析

NT：not detected

实施例4：

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。

极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)的16S rRNA基因序列特征：CGMCC No.1565接种于LB培养基，25℃摇床培养(180rpm)24小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用上游引物(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送大连宝生物公司进行测序。PCR条件为：94℃，5min；94℃，45s，56.2℃，45s，72℃ 90s，30个循环；72℃9min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1493p，在GenBank中的登录号为DQ417606，与Pusillimonas noertemannii的16S rDNA(GenBank accession No.AY695828)序列相似性为96.65％，进化距离为0.00568。

实施例5：

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株DNA碱基组成(G+C mol％)分析(Marmur et al，1962；周志伟等，1991；Mandel et al，1968)。

DNA样品溶于0.1×SSC中，在DU-7 Beckman分光光度计上调整DNA的浓度，将OD260稀释到0.5左右，DNA纯度OD230/OD260/OD280＝0.454∶1∶0.515，然后测定Tm值。使用Shimadzu UV-VIS-NIR recording spectrophotometer UV-365仪器测定Tm值，在波长260nm处首先记录25℃的吸光度值，然后温度开始上升，每上升3～5℃记录一次杯内温度T和OD260，OD值开始上升表示变性开始，直至OD值不变，将OD值乘相应温度的相对膨胀系数(Vt)与25℃时OD相比Vt/V25求得相对光密度，以T为横坐标，以相对OD为纵坐标，绘制热变性曲线，曲线中点相对应的T即为熔链温度(Tm值)。按照以下公式计算，对照菌株为E.coli K12AS1.365。

G+Cmol％＝(Tm sample-Tm E.coli)×2.44+51.2

根据T7-7 DNA的热变性曲线、Pusillimonas noertemannii BN9^T和E.coli K12 AS.1.365的热变性曲线(图3)计算，T7-7的Tm值为64.5℃，Pusillimonas noertemannii BN9^T的Tm值为68.5℃，E.coli的Tm值为64℃，算出T7-7的G+Cmol％为52.24％，BN9^T的G+Cmol％为62.18％。结果说明T7-7与Pusillimonas noertemannii BN9^T存在一定的差异。

实施例6：

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株与Pusillimonas noertemannii BN9^T之间DNA/DNA同源性测定。

提取两菌株的DNA，溶于15mLTE中，置冰水混合物中，150w超声15次，使DNA片段在2～5×105 dalton(即300～760bp)之间；将剪切过的待测DNA样品(A，B)分别用0.1×SSC精确配制成OD260＝1.5，取样品A、B各3mL分别装于两只离心管中，再取A、B各1.5mL装在1只离心管中，混匀为样品M。A、B、M均加入10×SSC 0.72mL混匀，使溶液最终浓度为2×SSC；使用分光光度计测定DNA的复性速率；按下面公式计算同源性：

Va、Vb和Vm分别表示A、B样品和M混合样品的复性速率

计算得菌株T7-7与Pusillimonas noertemannii BN9^T的全基因组DNA同源性为66.67％，低于国际种间杂交标准的70％(Wayne et al，1987)。

实施例7：

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株对直链烷烃的降解。

将菌株在LB平板上进行活化，取单菌落接入5ml LB液体培养基中过夜培养，以1％接种量接种至100ml LB液体培养基中，15℃振荡培养8h至对数生长期，以2％接种量接种至装有100ml含有不同烷烃为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，每种烃类以不接菌实验组作为对照，15℃振荡培养，用气相色谱法分析该菌株对不同碳数烷烃及柴油的降解率(气相色谱条件同实施例1)。结果如图1所示。T7-7对C16～C32烷烃的降解率分别在10％～40％以上。

实施例8：

本发明提供的Pusillimonas sp.T7-7菌株对天然海水中原油的降解室内模拟实验。将菌株T7-7与Rhodococcus erythropolis菌株3C-9(F.Peng，Z.Liu，L.Wang and Z.Shao，2006，An oil-degrading bacterium：Rhodococcus erythropolis strain 3C-9 and its biosurfactants，Journal of Applied Microbiology 102：1603-1611)在LB平板上进行活化，取单菌落接入5mlLB液体培养基中过夜培养，以1％接种量接种至100ml LB液体培养基中，25℃振荡培养至对数生长期，分别以2.4％、2％的接种量(经实验验证二者比例为6∶5时最好)接种至装有100ml含有不同柴油为碳源的天然海水中(取自天津塘沽沿海水域，补加营养成分：(NH₄)₂SO₄ 2.53g/L、Na₂HPO₄ 2.75g/L和酵母粉10.19mg/L)的三角瓶中，每种油类以不接菌实验组作为对照，15℃振荡培养7d，过程中间隔取样，用适量正己烷萃取后，将有机相合并在一起加入角鲨烷至终浓度为0.006％(w/v)作内标，定容至所需体积后进行气相色谱分析，结果如图6所示，对孤岛稀油降解率达到90％以上，对官69稠油降解率也能够达到60％以上，Rhodococcus erythropolis 3C-9能够降解C14～C36的烷烃，且其所产生的表面活性剂能够大大增加T7-7与油的接触，从而增加了T7-7对原油的降解，二者协同作用可以在海洋环境下对原油达到很好的降解效果。

序列表

<110>南开大学

<120>一株低温解烃的极小单胞菌T7-7及其用途

<160>1

<170>Patentin Version 2.1

<210>1

<211>1493

<212>DNA

<213>极小单胞菌T7-7(Pusillimonas sp.T7-7)

<400>1    

attgaacgct agcgggatgc tttacacatg caagtcgaac ggcagcgcga aaagagcttg 60

ctctttttgg cggcgagtgg cgaacgggtg agtaatatat cggaacgtgc ccagtagcgg 120

gggataacta cgcgaaagcg tggctaatac cgcatacgcc ctacggggga aaggggggga 180

ttcttcggaa cctctcacta ttggagcggc cgatatcaga ttagctagtt ggtgaggtaa 240

aggctcacca aggccgcgat ctgtagctgg tttgagagga cgaccagcca cactgggact 300

gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga attttggaca atgggggcaa 360

ccctgatcca gccatcccgc gtgtgcgatg aaggccttcg ggttgtaaag cacttttggc 420

agggaagaaa cggcgccgga taatacctgg cgtcactgac ggtacctgca gaataagcac 480

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta atcggaatta 540

ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttcgg aaagaaagat gtgaaatccc agagcttaac 600

tttggaactg catttttaac tctcgaacta gagtatgtca gaggggggta gaattccacg 660

tgtagcagtg aaatgcgtag agatgtggag gaataccgat ggcgaaggca gccccctggg 720

ataatactga cgctcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780

tccacgccct aaacgatgtc aactagctgt tggggccttc gggccttagt agcgcagcta 840

acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac 900

ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga aaaaccttac 960

ctacccttga catgtctgga agcttcaaga gattgaagtg tgctcgcaag agaaccggaa 1020

cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080

cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg aaagggcact ctaatgagac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc ccttatgggt agggcttcac 1200

acgtcataca atggtcggga cagagggtcg ccaacccgcg agggggagcc aatcccagaa 1260

acccgatcgt agtccggatt gcaggctgca actcgcctgc atgaagtcgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgtcg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccatggga gtgggtttta ccagaagtag ttagcctaac cgcaaggggg gcgattacca 1440

cggtaggatt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtatcgga agg        1493