一种利用分子标记检测三系杂交水稻红莲型新型恢复基因的方法

摘要

本发明公开了一种利用分子标记检测三系杂交水稻红莲型新型恢复基因的方法，该方法包括下列步骤：首先是特定标记的引物设计，其次是DNA的微量提取；第三是标准PCR扩增体系的建立；第四是扩增的分子标记的检测分析；第五是新恢复基因的确定。本发明方法简便，操作方便，该方法以恢复基因共分离的分子标记为基础，快速、准确、可靠地通过实验室筛选水稻种质材料，使新型恢复系的选育具有强烈的目的性和针对性，提高了新型恢复系的选育效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用分子标记的检测技术领域，具体而言即涉及一种利用分子标记检测三系杂交水稻红莲型新型恢复基因的方法，适用于红莲型和含orfH79基因变异类型的细胞质雄性不育的恢复基因检测。

背景技术

利用分子标记进行品种选择或品种鉴定是当前植物生物技术育种的主要内容。它具有准确、快速、不受季节限制等优点，因而在生产中被广为采用。分子标记辅助选择是现代生物技术与传统育种技术相结合的产物，它使传统遗传育种学中粗放、经验型的育种技术向现代精细、定向选择转变，使育种变得更加具有可操作性。如果知道某一标签的DNA序列，那么就可以通过简单的PCR扩增技术或者RFLP/AFLP技术，跟踪特定的有利基因。由于分子标记具有唯一性，而且可借助PCR技术等方法，具有操作简单、高效、准确、不依赖表型等优点，在遗传育种上已被广泛应用，具有非常广阔的应用前景。

细胞质与细胞核是一个有机统一的整体，植物受外界环境或进化的影响，线粒体基因组功能基因突变往往会导致细胞质雄性不育(CMS)，相应地细胞核也会通过突变产生特定的恢复基因，使不育株的育性恢复正常，保证子代的传递。这些育性恢复基因被认为具有补偿或改善细胞质功能失调的作用从而使小孢子发育恢复正常。多数植物通常具有多种不同的细胞质雄性不育类型，各自有对应的恢复基因。

有关细胞质雄性不育及其育性恢复基因关系的研究在百里香(Thymusvulgaris)和车前草属(Plantago)、甜菜野生群体中已有多年的文献积累，并建立了简单的进化模型。在百里香草中至少发现了5种CMS类型，每种CMS类型至少有一个以上相对应的恢复基因位点，各自恢复基因的分布频率不同，其中3种CMS细胞质在其CMS起源的原始种群中具有相当高的恢复频率(Manicaci，et al.1998)。窄叶车前群体中根据花器官的表型可也划分为MSI和MSII两种，而根据恢保关系MSII又可划分为MSIIa和MSIIb两种，实际上存在三种CMS类型。CMS的育性分别受多个恢复基因位点单独作用或由几个基因通过上位互作实现。而且有趣的是在CMS1类型中恢复作用的进化在一定程度上是以植株自身生长抑制为代价的，因为群落中的雌性植株普遍比雌雄两性植株生长旺盛(Budar，etal.2003)。在冠状车前中同样存在多种CMS类型，每种CMS至少存在5个以上显性恢复或隐性恢复位点(Koelewijn and Van damme，1995)。甜菜中根据线粒体结构可以划分为G-CMS、E-CMS、H-CMS和Owen-CMS四种类型。虽然现在还没有确切知道它们各自恢复基因的数目，但通过对G-CMS、E-CMS恢复频率的比较，发现自然群体中E-CMS的恢复基因分布频率比G-CMS的要高得多(Laporte，et al.2001)。

S-CMS细香葱有三个独立作用的恢复基因X、T和a，其中X能正常稳定恢复不育系的育性。而T基因只有在较高气温(24℃/24℃，昼/夜)下才能有效恢复育性，当温度降低至20℃(20℃/12℃，昼/夜)以下时，便失去恢复能力。a基因则只有在四环素(tetracycline)处理条件下才能产生恢复作用(Engelke and Tatlioglu，2000)。

玉米有S、T和C-CMS三种细胞质类型，三者在遗传机制上表现差异，它们所对应的恢复基因也截然不同。T-CMS系统的恢复基因主要是Rf1、Rf2、Rf8和Rf^*；C-CMS的恢复基因为Rf4、Rf5和Rf6；而S-CMS玉米只有恢复基因Rf3，作用方式为配子体类型。T-CMS玉米恢复基因目前已有非常详尽的研究，Rf1、Rf8、Rf^*和Rf2是四个已知的T-CMS恢复基因。其中Rf1具有完全恢复能力，而Rf2有着协同的作用，单独缺乏全恢能力，却是小孢子正常发育所必需。而Rf8、Rf^*具有替代Rf1的作用，与Rf2协作恢复CMS的育性。而定位研究表明Rf8、Rf^*等位或者共分离位于同一个基因座，被定位在2L染色体，而Rf1则被定位在第3染色的体着丝粒附近(Wise and Pring，2002)。棉花中的CMS-D2-2和CMS-D8细胞质一般认为含有一对显性恢复基因；CMS-D2-2型恢复系可以同时恢复CMS-D2-2、CMS-hir和CMS-D8细胞质，其中对CMS-D8的恢复模式为配子体方式，其它为孢子体方式。但是相反，后两种细胞质的恢复基因则不能恢复CMS-D2-2，可见它们的恢保关系也存在差异(Zhang and McD.Stewart，2001)。小麦的细胞质雄性不育种类繁多，在其常见的CMS系统中，T-CMS小麦目前至少已经找到了三个定位在不同染色体上的恢复基因Rf3、Rf4和Rf6R(关容霞等，2002)。而D²-CMS小麦育性受两对独立遗传的细胞核恢复基因控制，光敏的D²-CMS小麦育性受一对细胞核恢复基因控制。K-CMS和V-CMS小麦恢复性状的分别受单基因和双基因控制，这些不同的CMS恢复基因对不同的CMS细胞质并不具备兼容性(刘春光等，2002)。S-CMS高粱A3细胞质，是配子体不育类型，它是目前已知的植物配子体细胞质雄性不育类型中唯一的由两对恢复基因(Rf3、Rf4)控制F1育性(Tang，et al.1998)。它同孢子体不育系A4、9E的恢复基因Rf1、Rf2的遗传模式和位点完全不同。

水稻是中国最主要的粮食作物，以细胞质雄性不育为基础的三系杂交水稻的成功开发利用为保障我国粮食安全做出了巨大贡献。根据遗传和细胞学特征，水稻细胞质雄性不育分为野败、红莲和包台三大类型，其各自拥有相应的恢复基因。一般认为野败型有两对恢复基因两对独立遗传的恢复基因Rf3和Rf4，Rf3定位在第1染色体的短臂，与分子标记RG532共分离，而Rf4则位于第10染色体的长臂，与分子标记G4003连锁(Yao，et al.1997)，Rf4具有完全恢复能力，而Rf3则需要Rf4的帮助。遗传分析表明，野败型细胞质恢复基因存在多个恢复基因位点，野败型的两对恢复基因在不同品种中似乎并不等位。Govinda等(1988分析了6个恢复系(IR26、IR36、IR54、IR976-19-1、IR42和IR2797-105-2-2-3)之间F₁对V20A测交分离群体的育性。结果发现，只有IR26×IR36和IR9761×IR54三交一代育性整齐，没有不育株出现，其它组合均出现不同程度的育性分离。根据等位性的不同，将6个品种所具有的恢复基因分为4种类型：IR26和IR36类、IR54和IR976-19-1类、IR42类、IR2797-105-2-2-3类。Ramalinggam等(1995)利用均为有效恢复系且为两对基因遗传的5个品种为试材，进行所有可能的R×R杂交，再用V20A测交，以花粉和小穗育性为指标，结果也发现恢复系间的等位基因是不同的。5个恢复系可分成两组：IR24、IR29723-143-3-2-1、ARC11353和IR54742-22-19-3、IR9761-19-1，它们拥有不同的R基因对，任何两对的适宜组合似乎都能恢复雄性不育系的育性。虽然对这些恢复基因位点的作用方式并不清楚，但是它清楚说明了野败恢复基因存在位点、作用方式的多样性。

最近，何光华等利用SSR分子标记将明恢63的两对野败恢复基因Rf3和Rf4分别定位于第1和第10染色体，其中Rf3距RM1 1.9cM，Rf4位于第RM258和RM304之间，分别相距2.9和0cM(何光华等，遗传学报，2002，29(9)：798-802)。而李广贤等利用测交群体BC₁F₆对水稻恢复系密阳46的主效恢复基因进行定位，发现该基因与RM6100共分离(李广贤等.中国水稻科学，2005，19(6)：506-510)。推测野败型恢复基因在第10染色体上可能存在多个家族成员。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用分子标记检测三系杂交水稻红莲型新型恢复基因的方法，该方法将传统的遗传分析和分子遗传标记技术结合起来，提高了红莲型恢复基因的选择效率，对育种材料的选择由盲目变为更加精确了，有目的地发掘利用新的遗传基因资源，拓宽恢复谱，提高了杂交水稻恢复系的恢复能力，有利于提高了优良恢复基因的聚合选择效率。

为了实现上述目的，本发明涉及以下技术措施：

红莲型CMS水稻的育性同包台一样受一对恢复基因控制，刘学群等(2004)比较分析红莲的育性遗传时发现红莲型恢复系密阳23和9311之间的恢复基因并不等位，分别被命名为Rf5和Rf6。并将二者定位在第10染色体长臂，分别与分子标记HL-1和HL-7紧密连锁(Liu XQ et al.Mol Gen Genomics，2004，271：586-594)。在此基础上，申请人通过作图开发了两个更加精密的共分离标记M1和M2，可以准确跟踪鉴定Rf5和Rf6。可见，不同的恢复基因分别与各自特异的分子标记共分离，如果利用与已知的恢复基因紧密连锁的分子标记作对照，与其它恢复系比较，即有可能发现一些新的恢复基因位点，这对于丰富恢复基因的多样性、促进杂交水稻的发展非常有益。

1、恢复基因共分离分子标记的PCR引物设计

引物设计基于本实验室筛选的水稻红莲型细胞质恢复基因共分离分子标记M1和M2，序列如下：

M1引物(与Rf5共分离)：

正向引物F1：5’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’

反向引物R1：5’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’

M2引物(与Rf6共分离)：

正向引物F2：5’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’

反向引物R2：5’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’

2、DNA的提取

(2)每个含恢复基因的水稻品种取一段长3-5cm、宽0.5-1cm，重约0.1克的水稻嫩叶及0.2克粉末状石英沙，依次放入一1.5ml离心管中，作好标记，然后在研磨仪上将叶片研磨成浆。

(3)加入500μl CTAB提取液，65℃水浴25-30min，其间每隔5min振荡一次离心管。

(4)水浴结束后，每个离心管中加入500μl氯仿∶异戊醇：24∶1，混匀20min至颜色深褐色，离心机上10000rpm离心5min。

(5)取上清300μl转移至另一1.5ml离心管；加入600μl无水乙醇，-20℃，混匀，4℃冰上放置20min，12000rpm离心15min。

(6)倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精风干，然后加入30μl无菌水溶解DNA沉淀即可。

3、PCR扩增体系的建立

标准的PCR扩增反应体系为15μl，组成如下：

总DNA/50 ng            1μl

10×PCR buffer/pH8.3   1.5μl

25 mM MgCl₂            0.6μl

25μm dNTP             0.6μl

0.6单位Taq酶           0.6μl

5 pM的引物F            1μl

5 pM的引物R            1μl

去离子无菌水/ddH₂O     8.7μl

                                                       

合计                   15μl

反应混合物用矿物油(Sigma公司)覆盖，PCR反应程序如下：

1 cycle：  94℃ 5min

30 cycle：94℃ 1min；50-58℃ 1min；72℃ 1min

1 cycle：  72℃ 5min

store：    4℃；

4、扩增DNA片段检测

(1)分别以含红莲恢复基因Rf5、Rf6的水稻品种密阳23和9311作对照，分别以Rf5、Rf6共分离的分子标记M1和M2进行PCR扩增，扩增产物均在3.0％的琼脂糖胶上电泳。

(2)电泳电压为120V，时间1h，使扩增产物充分分开，然后在凝胶成像系统中观察电泳结果。

(3)将每个品种扩增的带型分别与9311(江苏省里下河地区农科所)、密阳23(韩国)中Rf5、Rf6共分离的分子标记M1和M2带型进行比较：如果某一个水稻品种分子标记的带型与红莲型恢复基因Rf5(密阳23)、Rf6(9311)带型不同，那么就确定该水稻品种可能携带一个与已知的红莲Rf5、Rf6不同的新恢复基因，将其确定为新恢复基因的候选材料。

5、红莲型细胞质雄性不育新恢复基因位点的确定

(1)以红莲不育系粤泰A(广东省农科院水稻所)作为测试对照，抽穗时选择每个待测材料分别与两个不育系与候选水稻材料测交，并套袋。杂交25天后即收种，50℃烘烤3天，打破休眠。

(2)将杂交种子在30℃下浸泡12h，然后露水用湿布包裹，30℃下保温12h；然后在30℃下浸泡12h，继续露水用湿布包裹，37℃下保温12h催芽，当芽长0.5cm左右，播种，秧苗30天移栽，按正常生产管理直到抽穗。

(3)抽穗时，用1％KI-I₂染色考察每个杂交组合的花粉育性，即每个组合在抽穗时取当天即将开放的颖花，挑出花药，挤出花粉，然后在显微镜下观察，全黑色的为可育花粉，其他的为不育花粉。成熟时考察套袋结实率和自然结实率。

(4)当测交组合F1花粉育性在30％以上、套袋结实率在20％以上，其所对应的水稻父本，即确定为含恢复基因。

(5)新恢复基因的验证：将含红莲型恢复基因的候选恢复系R’与对照品种杂交，配制杂种F1，即Rf5：R’/密阳23；Rf6：R’/9311；然后以红莲不育系粤泰A作母本与相应的杂种F1测交，将测交组合(A//R’/密阳23，A//R’/9311)种植300株以上的群体，观察育性分离，如果群体中出现不育株，说明候选恢复系R’的恢复基因与对照品种恢复系的恢复基因不等位，候选恢复系R’含新的红莲恢复基因。

本发明的优点

本发明与传统杂交育种方法相比具有以下优点和效果：

(1)快速、准确、可靠：核酸提取加上PCR反应，总共仅需3-4小时。

(2)设备简单，只需要PCR仪、台式离心机等即可，普通的分子生物学实验室皆可完成。

(3)方法简便、操作方便、高通量：PCR反应不需要特别的技术培训，一般的大学毕业生或经过培训的实验员均可独立操作，一次PCR反应可以检测96个材料，可以高通量操作。

(4)将传统方法与现代生物技术相结合，大幅度提高选育效率：传统的杂交方法无法预测杂交的结果，而通过分子检测的材料可以确定具有不同的恢复基因位点，可以事先对材料进行选择，大幅度提高筛选效率。

(5)可以拓宽恢复系育种材料的选择范围，增加遗传多样性：传统选育恢复系的育种方法一般是利用已知的恢复系进行转育，所以恢复基因类型完全一致，而利用该方法不仅在野生稻中，而且在栽培稻中也检测到新的红莲型恢复基因。

附图说明

图1与红莲恢复基因共分离的分子标记M1和M2在野生稻和栽培稻中的PCR扩增检测示意图。图中所有的品种或生态型是从大量材料中筛选出来的与密阳23(Rf5)或9311(Rf6)有差异带型的材料集中展示。Marker，DNA分子量标记DL2000；含W字母的是野生稻，其余是栽培稻。M1和M2分别代表Rf5、Rf6的共分离标记。

具体实施方式

利用PCR扩增，快速检测水稻红莲型新型恢复基因的分子标记，结合遗传分析以筛选红莲红莲型新型恢复基因为例，其具体步骤如下：

1、PCR引物设计

引物设计基于水稻红莲型细胞质恢复基因Rf5和Rf6共分离的分子标记M1和M2，序列如下：

M1引物：

正向引物F1：5’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’

反向引物R1：5’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’

M2引物：

正向引物F2：5’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’

反向引物R2：5’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’

2、DNA的提取：

每个水稻品种取一段长3-5cm、宽0.5-1cm，重约0.1克的水稻嫩叶及0.2克粉末状石英沙，依次放入一1.5ml离心管中，将叶片研磨成浆，加入500μlCTAB提取液，65℃水浴25-30min；其次是在水浴后的离心管中加入500μl氯仿∶∶异戊醇：24∶1，混匀，离心机上10000rpm离心5min，取上清300μl转移至另一1.5ml离心管；然后加入600μl无水乙醇，-20℃，混匀，4℃冰上放置20min，12000rpm离心15min，倒掉上清液，将离心管倒置10min使酒精风干，最后溶于30μl无菌水即可。

3、红莲恢复基因连锁分子标记的PCR扩增

标准的PCR扩增反应体系为15μl，组成如下：

总DNA/50 ng              1μl

10×PCR buffer/pH8.3     1.5μl

25mM MgCl₂               0.6μl

25μm dNTP               0.6μl

0.6单位Taq酶             0.6μl

5 pM的引物F              1μl

5 pM的引物R              1μl

去离子无菌水/ddH₂O       8.7μl

反应混合物用矿物油覆盖，PCR反应程序如下：

1 cycle：  94℃ 5 min

30 cycle：94℃ 1min；50℃ 0.5min；72℃ 1min

1 cycle：  72℃ 5min

store：    4℃；

4、扩增DNA片段电泳分析

(1)以含红莲恢复基因Rf5的密阳23和含Rf6的9311作对照，利用引物M1和M2对这些候选恢复系进行PCR扩增，所有扩增产物在3.0％的琼脂糖胶上电泳。

(2)密阳23和9311含红莲恢复基因Rf5、Rf6两个不同的位点，被检测水稻品种的带型同对照的两个品种一致时，说明该被检测的品种恢复基因与两个对照的恢复基因等位；如果被检测的水稻品种育对照的带型不同，说明被检测的水稻品种可能含有新的恢复基因位点。在本实验中，初步筛选出来的8个材料与9311和密阳23的带型不同，含有新的恢复基因(图1)。

5、恢复基因的检测：

(1)以红莲不育系粤泰A作为测试对照，抽穗时用筛选出的8个待测材料分别与两个不育系测交，并套袋。杂交20天后即收种，收获的种子50℃下烘烤3天，打破休眠。

(2)将测交种子在30℃下泡10h，然后露水用湿布包裹，37℃下保温12h；然后在30℃下泡10h，继续露水用湿布包裹，37℃下保温12h催芽，当芽长0.5cm左右，播种，秧苗30天移栽，按正常生产管理直到抽穗。

(3)抽穗时，用1％KI-I₂染色考察每个杂交组合的花粉育性，即每个组合在抽穗时取当天即将开放的颖花，挑出花药，挤出花粉，然后在显微镜下观察，深黑色的为可育花粉，其他的为不育花粉。成熟时考察套袋结实率。

(4)当杂种F1花粉育性在30％以上、套袋结实率在20％以上时，其杂交组合的父本即确定为含恢复基因。表1中筛选的8个品系测交F1的育性均正常(野生稻杂种由于容易掉粒，所以考种结果偏低)，说明全部含红莲型恢复基因。

表1  筛选的水稻品种与红莲粤泰A测恢杂种F₁的育性(％)

品种/株系    编号    种名  花粉育性(％)结实率(％) 9311 鄂早11 密阳23 W3 W4 W5 W9 W19 W20 W26  101978  103821  104659  105709  104705  105887  东乡2  O.sativa  O.sativa  O.sativa  O.nivara  O.nivara  O.nivara  O.rufipogon  O.nivara  O.rufipogon  O.rufipogon    43.3±1.1    45.3±1.3    55.0±2.1    40.5±1.9    30.5±1.7    43.2±3.2    32.5±0.9    73.6±2.5    50.3±4.3    50.9±2.1  81.5±1.7  54.0±1.3  84.9±3.3  21.7±2.6  43.3±0.7  18.3±3.4  38.3±2.2  66.1±1.8  49.2±2.6  27.6±1.7

6、红莲型新型恢复基因的确定：

(1)以含红莲恢复基因Rf5的密阳23和含Rf6的9311分别作母本与测交含恢复基因的材料杂交，获得杂种F1，然后以F1为父本与粤泰A测交，获种子500粒以上，以保证BC1的群体足够大于300株。

(2)BC1回交群体开花时，显微镜观察每一株花粉的育性，并套袋自交，如果BC1群体中出现不育株，则说明该父本的恢复基因与9311或密阳23不等位。如果该父本的恢复基因与Rf5和Rf6都不等位，则说明该父本携带新的恢复基因。

表2.被筛选材料的红莲型恢复基因等位性分析

    测交组合不育株群体大小重组率(％)    等位性 YtA//9311/W26 YtA//9311/W20 YtA//9311/W19 YtA//9311/W9 YtA//9311/鄂早11 YtA//密阳23/W19 YtA//密阳23/W26 YtA//密阳23/W9 YtA//密阳23/鄂早11    12    0    5    5    12    14    8    4    7    89    107    103    98    110    103    91    87    100    26.97    0    9.70    10.20    21.82    27.18    17.58    9.19    14  不等位  等位  不等位  不等位  不等位  不等位  不等位  不等位  不等位

(3)综合测交杂种F1的结实率和分子标记分析的结果，则可确定恢复基因的位点特征。本试验中W20的恢复基因与9311等位，其余的7个材料均携带的恢复基因与已知的Rf5、Rf6都不等位，属于新的恢复基因(表2)。该方法综合运用分子标记和遗传试验进行分析，并得到了等位性分析的验证，说明该方法可靠实用。