环状芽孢杆菌WZ－12及其在微生物分解处理二氯甲烷中的应用

摘要

本发明提供了一株可降解二氯甲烷的新菌株——环状芽孢杆菌WZ－12，及其在微生物分解处理二氯甲烷和制备二氯甲烷脱卤素酶中的应用。环状芽孢杆菌WZ－12(Bacillus circulans WZ－12)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏编号CCTCC No：M207006。本发明的有益效果主要体现在：提供一株可降解二氯甲烷的新菌株--环状芽孢杆菌WZ－12，该菌可在有氧条件下快速降解二氯甲烷，为以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解机理的研究提供了重要的基础，亦可以直接应用在有机废气的生物处理工艺上。此外，该菌株为野生型，遗传背景非常清晰，适于进行遗传改良，有望大幅度提高对有机废气的处理能力。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株可降解二氯甲烷的新菌株——环状芽孢杆菌WZ-12，及其在微生物分解处理二氯甲烷和制备二氯甲烷脱卤素酶中的应用。

(二)背景技术

二氯甲烷(CH₂Cl₂)是一类使用非常广泛的化学试剂，主要在金属材料去油污、纺织、印染、油漆行业和制药工业等领域作溶剂使用。二氯甲烷属异生物合成物(Xenobiotics)，为难降解有机污染物的典型，当前被认为是大气污染中毒性较大的卤代烃类物质，其广泛使用带来一系列环境污染问题，严重危及人类健康，并且破坏臭氧层，被美国EPA列为优先污染物。Methylobacterium和Hyphomicrobium属的某些菌株能利用二氯甲烷作为唯一碳源进行生长，这些细菌含有参与反应的关键酶——二氯甲烷脱卤素酶，此酶属于谷胱甘肽转移酶类，是诱导酶，能催化二氯甲烷矿化生成甲醛和无机氯。反应途径如下：

难降解的有机污染物的生物法降解既是目前国际上环境污染控制技术领域的研究热点，也是当前和今后我国经济和社会发展中需要解决的重要而迫切的科技问题，并具有广阔的应用前景。但由于以二氯甲烷为代表的卤代有机物水溶性不高，多不能直接被微生物酶系统所识别，甚至对微生物有代谢抑制作用。以现有微生物菌种的生物处理工艺难以奏效。其关键问题是高效降解途径的缺乏和现有已知途径的缺陷。发现微生物新品种和创建的新代谢途径，一则可以进行高效降解途径的设计、组装，以扩展降解菌利用底物的范围、避免有毒中间产物的形成，二则可以增加生物酶催化活性和稳定性，提高底物通量及其生物可利用性等，是解决当前这些问题的关键。自从1980年Rittmann等首次从工业废水中分离出能以二氯甲烷作为唯一碳源和能源的甲基杆菌(Methylobacterium)，到1990年Scholtz R发现二氯甲烷高效降解菌株假单胞菌DM11，迄今有报道相继分离到包括生丝微菌(Hyphomicrobium)在内的10多株分解二氯甲烷的细菌，并对这些菌中的脱卤素酶进行了研究，根据这些酶的性质，把它们分成两组，一组是活力较低的A组二氯甲烷脱卤素酶，另一组是活力较高的B组二氯甲烷脱卤素酶。

迄今尚没有环状芽孢杆菌能以二氯甲烷作为碳源与能源的生物降解的报道。

(三)发明内容

本发明目的是为了提供一株可降解二氯甲烷的新菌株——环状芽孢杆菌WZ-12，及其在微生物分解处理二氯甲烷和制备二氯甲烷脱卤素酶中的应用。

为达到发明目的本发明采用的技术方案是：

环状芽孢杆菌WZ-12(Bacillus circulans WZ-12)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏编号CCTCC No：M 207006。本发明所提供的二氯甲烷降解菌为自行分离筛选获得，代号WZ-12，鉴定为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)，其16S rDNA全序列GenBank accession no.EF100968。就目前所知，迄今尚没有环状芽孢杆菌能以二氯甲烷作为碳源与能源的生物降解的报道。

本发明菌株的获得：从浙江各地有记录长期被二氯甲烷污染的土壤、废水中，如杭州华东制药厂暴气池、新昌制药厂暴气池和杭州农药厂废水污泥中采集样品36份，通过样品驯化，初筛，复筛，获得具有二氯甲烷降解能力的纯培养物。对该纯培养物进行了形态和生理生化鉴定，并对其16S rDNA全序列同源性作了分析，将其鉴定为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。另外通过分子筛层析和离子交换层析等手段，分离纯化了该二氯甲烷降解菌WZ-12发酵液中的二氯甲烷脱卤酶组分。通过SDS-PAGE电泳测得分子量为30.8kD。

菌株的鉴定：

1)菌株的细胞形态：该菌呈杆状，大小为(0.4～0.6μm)×(0.9～1.5μm)，端生单根鞭毛(见图1)，革兰氏染色为阴性。在无碳查氏固体培养基30℃培养2～3d后，菌落呈乳白润泽，较小，圆形，边缘整齐，表面光滑，不易挑起。

2)菌株的生理生化特性：接触酶、过氧化氢酶阴性，可以葡萄糖、木糖、棉子糖、鼠李糖、蔗糖和麦芽糖发酵产酸，但不能利用肌糖、山梨醇和甘露糖。甲基红反应、V.P反应阴性，吲哚反应、淀粉水解和明胶液化阳性。DNA中的G+C mol％为35.6。结果表明，菌株WZ-12的生理特征与芽孢杆菌属(Bacillus genus)的细菌种极为相似。

3)菌株16S rDNA序列测定与系统发育树分析：16S rDNA扩增产物见图4，PCR产物测序结果得到长度为1490bp的16S rDNA全长序列，并基于相关属菌株的16S rDNA序列构建系统发育树(见图2)。

16S rDNA PCR产物测序结果得到长度为1490bp的全长序列(GenBankaccession no.EF100968)，如下：

 1   CTGGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGC

51   GGACTTAAAAAGCTTGCTTTTTAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACAC

101  GTGGGCAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAA

151  TACCGGATAATCCTTTCCTACTCATGTAGGAAAGCTGAAAGACGGTTTAC

201  GCTGTCACTTACAGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAA

251  CGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCA

301  CACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA

351  ATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATG

401  AAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACGAGA

451  GTAACTGCTCGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTA

501  CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTA

551  TTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCC

601  ACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAA

651  GAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAG

701  GAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCG

751  CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT

801  AAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGC

851  AAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTC

901  AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC

951  GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTCCTGACAATCCTA

1001 GAGATAGGACGTTCCCCTTCGGGGGACAGGATGACAGGTGGTGCATGGTT

1051 GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA

1150 ACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGC

1201 CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCT

1251 TATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAAAGGGCAGCAA

1301 AACCGCGAGGTCGAGCCAATCCCATAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTA

1351 GGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAG

1401 CATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC

1451 CACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCTTCTGGGAGCC

1490 AGCCGCCTAAGGTGGGATAGATGATTGGGGTGAAGTTCGT。

菌株的生长特性：

培养条件：在摇床上250ml三角烧瓶，以二氯甲烷为唯一碳源和能源的培养基，即在微量元素培养基(MSM)中添加二氯甲烷，二氯甲烷终浓度为32mM，分4次加入。温度30℃，起始pH7.5，检测生物量、pH和比酶活的变化，每12小时检测1次。结果如图3。

MSM配法：KH₂PO₄，6.8mg/ml；(NH₄)₂SO₄，0.2mg/ml；MgSO₄，0.1mg/ml；glycerol，5g在121℃下灭菌18分钟后，补加0.25％Ca(NO₃)₄溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L。

痕量元素溶液：MnCl₂·4H₂O，0.2g/l；CoCl₂·6H₂O，0.34g/l；ZnCl₂，0.2g/l；CaCl₂·2H₂O，0.4g/l；H₃BO₃，0.038g/l；NiCl₂·6H₂O，0.1g/l；Na₂M0O₄·4H₂O，0.04g/l；NH₄VO₃，0.04g/l；KI，0.8g/l。

菌种的保存：获得的菌种分别采用斜面菌种在4℃冰箱数份、沙土管保存1份和制成冻干粉保存1份。

所述的环状芽孢杆菌WZ-12可用于微生物分解处理二氯甲烷。所述的应用为：以二氯甲烷为唯一碳源和能源，对环状芽孢杆菌WZ-12菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液为酶源，使二氯甲烷矿化为氯离子和甲酸盐。

所述应用为：以二氯甲烷为唯一碳源和能源，对环状芽孢杆菌WZ-12菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液浸没生物填料，挂膜后用于二氯甲烷分解处理，所述菌液细胞浓度为0.5～2×10⁶个/mL。

所述菌液由如下方法得到：将环状芽孢杆菌WZ-12接种到种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以0.5～2×10⁵个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30℃震荡培养，48h后终止培养，得菌液；种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃，0.5～3g/L；K₂HPO₄，0.5～2g/L；KCl，0.2～1.0g/L；MgSO₄·7H₂O，0.3～1.0g/L；Fe SO₄，0.005～0.02g/L；pH7.0～7.2，在121℃下灭菌20分钟，气态碳源CH₂Cl₂终浓度为32mM，培养时分4次加入；

具体的，所述应用按如下顺序步骤进行：

(1)斜面培养：采用无碳查氏固体培养基，斜面涂布环状芽孢杆菌WZ-12菌种，定时滴加二氯甲烷，30℃下培养2～3天，获得的单菌落转入大试管斜面，在斜面的对侧试管壁上放置滴有二氯甲烷的棉花，获得斜面菌种；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以0.5～2×10⁵个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30℃震荡培养，48h后终止培养，得菌液；种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃，2g/L；K₂HPO₄，1g/L；KCl，0.5g/L；MgSO₄·7H₂O，0.5g/L；Fe SO₄，0.01g/L；pH7.0～7.2，在121℃下灭菌20分钟，CH₂Cl₂终浓度为32mM，培养时分4次加入；

(3)将菌液转入生物滴滤池，聚丙烯填料表面接种和挂膜，接种量为20％体积比，30天后，二氯甲烷气体和循环液(循环液可为常见适用于环状芽孢杆菌的营养液，本发明中采用循环液组成如下：NaNO₃，0.5～3g/L；K₂HPO₄，0.5～2g/L；KCl，0.2～1.0g/L；MgSO₄·7H₂O，0.3～1.0g/L；Fe SO₄，0.005～0.02g/L；pH7.0～7.2)在滴滤池内逆流操作，在循环液pH值7.0±0.5、温度28.5±2℃、气体空床停留时间15.0～16.0s、二氯甲烷进口浓度为0.7～3.12g/m³的条件下进行二氯甲烷废气处理。

所述的环状芽孢杆菌WZ-12也可直接用于制备二氯甲烷脱卤素酶。

所述二氯甲烷脱卤素酶由如下方法制备得到：

(1)环状芽孢杆菌WZ-12在种子培养基中培养获得菌悬液，菌悬液以1×10⁶个细胞/mL培养基接种到产酶培养基中，pH7.5、30℃震荡培养48h，得产酶培养物；

种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃，2g/L；K₂HPO₄，1g/L；KCl，0.5g/L；MgSO₄·7H₂O，0.5g/L；Fe SO₄，0.01g/L；pH7.0～7.2，在121℃下灭菌20分钟，CH₂Cl₂终浓度为32mM，培养时分4次加入；

产酶培养基各组分终浓度为：KH₂PO₄，6.8g/L；(NH₄)₂SO₄，0.2g/L；MgSO₄，0.1g/L；甘油，5g/L；在121℃下灭菌18分钟后，补加质量浓度0.25％的Ca(NO₃)₂溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L；

所述痕量元素溶液组成为：MnCl₂·4H₂O，0.2g/L；CoCl₂·6H₂O，0.34g/L；ZnCl₂，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，0.4g/L；H₃BO₃，0.038g/L；NiCl₂·6H₂O，0.1g/L；Na₂M0O₄·4H₂O，0.04g/L；NH₄VO₃，0.04g/L；KI，0.8g/L；

(2)步骤(1)所得产酶培养物4℃，1000rpm离心15min，细胞沉淀用0.05MTris-HCl、pH7.5缓冲液水洗一次，得湿菌体，湿菌体悬浮于0.05MTris-HCl、pH7.5缓冲液中，超声波破碎2次，4℃、15000rpm离心2次，每次15min，取上清液，即为粗酶液，粗酶液经分离纯化，即得所述二氯甲烷脱卤素酶。

本发明的有益效果主要体现在：提供一株可降解二氯甲烷的新菌株——环状芽孢杆菌WZ-12，该菌可在有氧条件下快速降解二氯甲烷，为以二氯甲烷为代表的卤代烃类有机污染物的生物降解机理的研究提供了重要的基础，亦可以直接应用在有机废气的生物处理工艺上。此外，该菌株为野生型，遗传背景非常清晰，适于进行遗传改良，有望大幅度提高对有机废气的处理能力。

(四)附图说明

图1为菌株WZ-12染色特征和JEOL-1230扫描电镜照片；

图2为基于16S rDNA序列同源性的菌株WZ-12和其他相关菌株的系统发育树；

图3为菌株WZ-12的生长特性：pH(■)，生物量(^*)，比酶活(○)；

图4为菌株WZ-12的16s rDNA扩增产物(M：marker；B：样品条带)；

图5为二氯甲烷脱卤素酶分子筛层析图谱；

图6为二氯甲烷脱卤素酶Q-Sepharose Hiprep 16/10Q XL柱层析图谱；

图7为二氯甲烷脱卤素酶Sepharose F.F.柱层析图谱；

图8为二氯甲烷脱卤素酶SDS-PAGE电泳图谱(M：标准蛋白；A和B：样品条带)；

图9为菌株WZ-12固体培养图示；1为培养基，2为含二氯甲烷的无菌棉花。环状芽孢杆菌WZ-12(Bacillus circulans WZ-12)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年1月19日，保藏编号CCTCC No：M 207006。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：菌株WZ-12来源二氯甲烷脱卤素酶的制备与分离纯化

(1)菌株的产酶培养：采用无碳查氏液体培养基，在种子培养基中培养获得菌悬液，10ml菌悬液(1×10⁶)接种到装有100ml产酶培养基的250ml三角瓶中，用橡皮塞盖紧瓶口，30℃震荡培养，CH₂Cl₂的终浓度为32mmol/L，分4次加入，每次8mmol/L，pH7.5，48h终止培养，得产酶培养物。

种子培养基各组份终浓度为：NaNO₃，2g；K₂HPO₄，1g；KCl，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；Fe SO₄，0.01g；H₂O，1000ml；pH7.0～7.2。在121℃下灭菌20分钟。气态碳源CH₂Cl₂终浓度为32mM，培养时分4次加入。

产酶培养基各组分终浓度为：KH₂PO₄，6.8g/L；(NH₄)₂SO₄，0.2g/L；MgSO₄，0.1g/L；甘油，5g/L；在121℃下灭菌18分钟后，补加质量浓度0.25％的Ca(NO₃)₂溶液1ml/L和痕量元素溶液1ml/L；

痕量元素溶液组成为：MnCl₂·4H₂O，0.2g/L；CoCl₂·6H₂O，0.34g/L；ZnCl₂，0.2g/L；CaCl₂·2H₂O，0.4g/L；H₃BO₃，0.038g/L；NiCl₂·6H₂O，0.1g/L；Na₂M0O₄·4H₂O，0.04g/L；NH₄VO₃，0.04g/L；KI，0.8g/L；

(2)新鲜湿细胞的获得：产酶培养物4℃，10000rpm离心15min，细胞沉淀用0.05M Tris-HCl(pH7.5)洗一次，贮存备用。

(3)二氯甲烷脱卤素酶的分离纯化：2g新鲜湿细胞悬浮于0.05M Tris-HCl，pH7.5缓冲液中，超声波破碎两次，4℃，15000rpm离心两次，每次15min，上清液即为粗酶液。粗酶液中加入硫酸铵盐至40％(质量含量)饱和度，4℃下过夜。离心，去除杂蛋白，取上清液测酶活，于上清液中缓慢补加硫酸铵至80％(质量含量)饱和度，4℃过夜，收集沉淀，上清液测酶活，确定上清液中没有酶活。使用AKTA FPLC层析系统，先将经过预处理的粗酶液上Sephadex G-75分子筛，酶蛋白得到初步分离，只有出现的第一个峰的前半部分具有很高的脱卤酶活(图5)。然后，收集上述具有酶活性的蛋白峰样品上样于以A液(0.05MTris-HCl，pH7.5缓冲液)预平衡的Q-Sepharose Hiprep 16/10Q XL柱进行阴离子交换层析，用B液(含1.0M NaCl的A液)溶液进行线性梯度洗脱，得到2个蛋白峰，酶活力最高部分集中在第2个蛋白峰内(图6)，将这部分蛋白经超滤浓缩，调pH至7.2，然后通过预先用0.05MTris-HCl，pH7.5缓冲液平衡的Sepharose F.F.柱(1.0×5mL)进行第二次强阴离子交换层析，用1.0mol/L NaCl(于缓冲液中)线性梯度洗脱(2mL/min)，得到一个酶活力蛋白峰(图7)。整个提纯过程如表1。

经过以上分离纯化过程，只得到一个二氯甲烷脱卤素酶组分，对样品进行电泳分析表明，在SDS-PAGE胶上形成单一条带，确定其分子量约为30.8kD(图8)。表明该组分已达电泳纯。在整个提纯过程中，二氯甲烷脱卤素酶被提纯8.27倍，收率34.83％(见表1)。

表1：菌株WZ-12二氯甲烷脱卤素酶的提纯

  总蛋白  (mg)  总酶活(U)  比活力  (U/μg)  得率(％)  回收倍数  Crude extract  33.4  477.6  14.36  100  1  (NH₄)₂SO₄salting out  13.4  286.5  21.38  60  1.5  Sephadex G-75  4  196.48  49.12  41.11  3.42  DEAE-Sepharose F.F.  1.4  166.35  118.82  34.83  8.27

实施例2：菌株WZ-12在生物过滤处理二氯甲烷中的应用

(1)菌株培养：采用无碳查氏固体培养基如图9方法培养，首先在固体培养基表面涂布菌种，然后在皿盖上加一大块无菌棉花，棉花中滴适量的二氯甲烷，置30℃下培养，定时补加二氯甲烷。对照平板的棉花中加无菌生理盐水，培养2～3天后，获得的单菌落转入大试管斜面，在斜面的对侧试管壁上放置滴有二氯甲烷的棉花，便可获得斜面菌种。

(2)菌种扩大培养：斜面菌种在种子培养基中培养获得菌悬液，50ml菌悬液(细胞浓度1×10⁶个/mL)接种到装有1000ml种子培养基的5L三角瓶中，用橡皮塞盖紧瓶口，30℃震荡培养，48h终止培养。种子培养基各组分终浓度为：NaNO₃，2g/L；K₂HPO₄，1g/L；KCl，0.5g/L；MgSO₄·7H₂O，0.5g/L；Fe SO₄，0.01g/L；pH7.0～7.2，在121℃下灭菌20分钟，CH₂Cl₂终浓度为32mM，培养时分4次加入；

(3)以上方法获得的菌悬液(浓度1×10⁶个/ml)，在50mm的有机玻璃生物滴滤池内，聚丙烯填料表面接种和挂膜，接种液(组成：NaNO₃，2.5g/L；K₂HPO₄，1.5g/L；KCl，0.6g/L；MgSO₄·7H₂O，0.8g/L；Fe SO₄，0.015g/L；pH7.2)48L，接种菌悬液约9.6L，接种和挂膜约需30天。二氯甲烷模拟气体和循环液在滴滤池内逆流操作，循环液pH值为7.0±0.5，温度维持在28.5±2℃的条件下，在气体空床停留时间为15.7s、二氯甲烷进口浓度为0.7～3.12g/m³的范围内，去除效率为72.0％～89.1％。

实施例3：采用工业微生物育种方法提高二氯甲烷降解效率

以本发明菌株WZ-12为出发菌株，采用无碳查氏固体培养基如实施例1的方法获得菌种的扩大培养物，采用紫外辐照结合⁶⁰Coγ射线诱变的工业微生物育种方法，获得遗传改良的降解菌株，对该菌株与它的出发菌株的降解能力进行对比试验，结果显示，对二氯甲烷的降解能力提高了24～32％。具体方法如下：

(1)菌种诱变程序：

出发株→紫外线辐照→初筛、复筛→⁶⁰Coγ射线辐照→初筛、复筛→二氯甲烷高降解效率菌株。

(2)紫外线诱变处理：

取培养3～5d的新鲜斜面，用无菌生理盐水洗下菌苔制成菌悬液，经玻璃珠振荡打散和脱脂棉过滤后，调整菌悬液浓度10⁶个/mL左右，吸取5mL菌悬液至无菌的小平皿中，在25W紫外灯(距离30cm)照射下，磁力搅拌，照射时间根据致死率确定，菌悬液在无菌室红灯下适当稀释涂平板，平板倒置于30℃恒温培养箱中培养7～8d。

(3)⁶⁰Coγ射线辐照处理：

采用培养好的新鲜试管斜面直接进行辐照。分别以0.5kGy、2.0kGy剂量对试管中菌体进行⁶⁰Coγ射线辐照，用无菌生理盐水将经辐照处理后的斜面制成孢子悬液，并经适当稀释后涂平板，平板倒置于30℃恒温箱中培养7～8d。

(4)初筛和复筛：

采用无碳查氏固体培养基，以二氯甲烷为唯一碳源和能源，采用气态碳源提供方法进行选择性培养，挑选单菌落，转接液体培养基，上摇床通过检测降解效率进行复筛。

(4)降解能力对比试验：

改良菌株与它的出发菌株的降解能力对比试验是在250mL三角瓶内上摇床分别检测降解效率。

序列表[1].ST25

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>环状芽孢杆菌WZ-12及其在微生物分解处理二氯甲烷中的应用

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1490

<212>DNA

<213>Bacillus circulans

<400>

ctgggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggacttaaaa   60

agcttgcttt ttaagttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggcaacc tgcctgtaag  120

actgggataa cttcgggaaa ccggagctaa taccggataa tcctttccta ctcatgtagg  180

aaagctgaaa gacggtttac gctgtcactt acagatgggc ccgcggcgca ttagctagtt  240

ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca  300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccgca  360

atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg gatcgtaaaa  420

ctctgttgtt agggaagaac aagtacgaga gtaactgctc gtaccttgac ggtacctaac  480

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gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg  720

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