一种龙芽楤木叶片植株再生诱导培养基

摘要

本发明属于农业生产中的植物组织培养技术领域。是一种龙芽楤木叶培养及其植株再生诱导培养基。本发明包含培养基营养元素和培养基激素，其中培养基无机盐包括NH

说明书

技术领域

本发明属于农业生产中的植物组织培养技术领域。涉及龙芽楤木组培快繁的核心技术，是一种龙芽楤木叶片植株再生诱导培养基。

技术背景

龙芽楤木〔Araliaelata(Miq.)Seem.〕又称刺嫩芽、东北野香椿，是五加科多年生落叶小乔木，被誉为“山菜之王”。龙芽楤木主要分布于我国东北地区，朝、俄、日也有分布。其萌发的嫩芽可食用，味鲜美清香，富含蛋白质、氨基酸、矿物质、维生素，是我国出口创汇的主要野菜品种。另外，龙芽楤具有多种药用保健价值。祖国医药学中，以龙芽楤木的根皮和树干皮入药，其性平味苦，有小毒，具有补气安胎、强筋滋肾、祛风活血、除湿止痛的功效。许多学者对其叶进行研究，含有大量皂甙类化学成分，具有一定的细胞杀毒作用，对内瘤S 80和肝癌H22细胞具有较强的杀伤作用，可明显抑制它们的生长。同时由于它含有齐墩果酸、半乳糖、木糖、楤木皂甙A、B、C、胆碱、原儿茶酸、生物碱、皂甙、鞣质、挥发油、香豆精、屏边三七甙R1和R2、豆甾醇等物质，因此具有保健疗效作用，对治疗精神衰弱、风湿性关节炎、龙芽楤木肾虚阳瘘、糖尿病、肝炎、胃痉挛、肾炎水肿及外伤出血等病症效果明显。

随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们开始关注科学的饮食结构，注意协调膳食营养，对于某些疾病的预防和治疗注重药膳的运用，昔日用于度荒的野菜，以其特有的营养价值和药用价值及其独特的风味，吸引着各界人士。近年来，食用绿色食品极为风行，而龙芽楤木因其生长在无污染的环境中，是极其优良的绿色食品品种，因而深受国际市场，特别是日本和韩国的欢迎。据调查，黑龙江省林区及吉林长白山林区的龙芽楤木当地收购价已达每公斤8至10元，销往日本、韩国，2000年到2004年价格翻了8～10倍，近5年每年出口量10万吨以上，为国家年创造近10亿元外汇，因其具有极高的经济利用价值，许多林区把龙芽楤木采收作为产业，采收人员每天可采125～150公斤，年纯收入2万元。由于龙芽楤木分布区域较窄，自然蓄积量有限，而且食用部分仅为嫩芽，难以满足国内外市场需求。

事实表明，由于多年来连续采集(人为掠夺式的采集)，野生资源已经遭到极为严重的破坏，浅山区已近乎绝迹，蕴藏量和可采集量以每年30％速度逐年锐减，采集的刺嫩芽变得越来越瘦，愈来越小，供需矛盾日益突出，龙牙楤木已被地方政府列为濒危经济植物加以保护。因此，发展龙芽楤木人工栽培产业具有重要的生态意义与经济意义。

近年来，东北地区人工栽培规模不断扩大，目前已达近10万亩，种苗需求量也随之不断增长。种苗来源较困难，种苗质量不高限制了这一产业的可持续发展。生产上大多采用龙芽楤木种子实生苗繁育方法。该方法存在诸多问题，(1)采集困难且破坏资源；(2)种子处理时间长(长达5个月)，成本较高；(3)自然变异大，生长不一，不利于商品生产。

通过组培快繁可以解决上述问题，因国内外相关研究人员较少，这一繁殖技术尚未在龙芽楤木繁殖上得到广泛应用。目前，国内一般采用MS基作组织培养，但因培养植物种类不同、培养部位不同，其效果也不同，对龙芽楤木叶培养效果不佳。我们于2002年始开展了龙芽楤木繁育、栽培的系统研究，其中在繁殖方面解决了一系列组培难题，通过叶培养与植株再生诱导实现了快速繁殖种苗目的，并已在生产中得到推广应用。基于多年来的研究积累与龙芽楤木生产实际需要提出本发明。

发明内容

本发明从调整营养元素与激素浓度入手，突破传统培养基配方，以龙芽楤木叶营养元素含量分析标准浓度和对试管苗全株营养元素分析结果为基础，以大量、微量元素及激素的生理生化作用机理为依据，通过改变培养基的无机盐种类与含量，科学调整激素比例，目的是提供一种龙芽楤木叶片再生植株诱导培养基。本发明利用单因子与多因子设计方法筛选激素种类与水平，在试管苗全量营养分析的基础上设计各种无机盐不同梯度水平的多次试验，确定适宜营养元素用量。经多次筛选得到的本发明，不仅降低了培养基成本，且有效地提高了植株再生诱导率。

本发明包含培养基营养元素和培养基激素，其中培养基营养元素可以分成大量元素和微量元素，大量元素和微量元素是一些盐类。所述的大量元素包括：NH₄NO₃，NH₄H₂PO₄，KNO₃，CaCl₂·2H₂O，MgSO₄·7H₂O，Ca(NO₃)₂·4H₂O，EDTA-Fe；微量元素包括：KI，MnSO₄·H₂O，H₃BO₃，ZnSO₄·7H₂O，NaMoO₄·2H₂O，CuSO₄·5H₂O，CoCl₂·6H₂O；培养基激素包括：BA，GA₃，ZT，IBA。为了更清楚地表述本发明，用下表给出各大量元素、各微量元素和各培养基营养元素及含量。

表1本发明营养元素配方

表2本发明激素配方

  激素  BA  NAA  IAA  ZT  用量(mg/L)  0.5-2.0  0.05-0.2  0.05-0.2  1.0-2.0

表2中的BA为6-苄基氨基嘌呤，NAA为萘乙酸，IAA为吲哚乙酸，ZT为玉米素。

本发明的无机盐含量是2363.4-2546.5mg/L，最适浓度2455.0mg/L与MS培养基所含无机盐浓度比为1∶1.9，也就是说MS培养基所含无机盐浓度(4633.3mg/L)是本发明所含无机盐浓度的1.9倍。本发明所含无机盐的浓度低于现有技术所含无机盐浓度。

另外，本发明与MS培养基比较有如下不同：1)本发明是在1/2MS培养基的基础上将大量元素用量进行了调整，降低了NO₃、铁元素浓度，提高了Mg浓度。并以(NH₄)H₂PO₄替代了KH₂PO₄，降低了CaCI₂.2H₂O用量，而用Ca(NO₃).4H₂O做部分替代以补充Ca源；2)微量元素中硫酸铜用量为MS的10倍；3)本发明总离子浓度较低，与MS培养基总离子浓度比为1∶1.9；4)调整与确定适宜激素种类与配比。

研究结果表明：合理降低培养基无机盐含量有利于分化培养，高浓度无机盐抑制愈伤组织植株的再生，尤其是磷镁含量越高、比值越大其抑制作用越大；利用本发明进行龙芽楤木叶片培养，再生植株诱导率最高可达75％以上，可比对照培养基节约投入成本近2倍；微量元素铜含量的增加可促进愈伤组织健康生长及胚状体的产生。

在本发明基本培养基上附加适宜浓度的6-BA、ZT和IAA、NAA构成完整培养基配方，试验调查表明，龙芽楤木叶片比较容易诱导愈伤组织的产生，当6-BA浓度在0.5～1.0mg/L，IAA的浓度为0.1～0.2mg/L，NAA浓度在0.1～0.2mg/L时愈伤组织诱导率均可达到90％以上。经继代获得大量愈伤，选取生长良好淡绿色愈伤组织为材料转接至不同激素配比的分化培养基上，具体诱导结果如下表所示：随着6-BA、ZT浓度的增加分化率上升，当6-BA、ZT浓度为2mg/L时，最高分化率分别可达77.9％、71.5％，其中6-BA对愈伤分化的促进效果要好于ZT，平均分化率较高。当6-BA浓度一定的时分化率随IAA、NAA浓度增加都呈现先上升再下降的趋势，其中以0.1mg/L的浓度为最佳。与此不同，在ZT与IAA、NAA的配比组合中，当ZT浓度一定时，IAA浓度变化对分化率的影响与附加6-BA时相同，IAA、浓度以0.1mg/L最为适宜，而随着NAA浓度增加分化率则呈缓慢下降趋势，NAA浓度以0.05mg/L最为适宜。数据调查如下表：

处理    接种愈伤        激素配比(mg/L)         分化率

        组织数    6-BA  ZT       IAA    NAA    (％)

1       60        1.0   0        0.05   0      57.2

2       60        1.0   0        0.1    0      63.5

3       60        1.0   0        0.2    0      59.3

4       60        1.0   0        0      0.05   55.7

5       60        1.0   0        0      0.1    61.6

6       60        1.0   0        0      0.2    53.8

7       60        2.0   0        0.05   0      62.5

8       60        2.0   0        0.1    0      75.7

9       60        2.0   0        0.2    0      73.1

10   60   2.0   0      0      0.05   61.0

11   60   2.0   0      0      0.1    77.9

12   60   2.0   0      0      0.2    73.8

13   60   0     1.0    0.0    50     57.9

14   60   0     1.0    0.1    0      66.2

15   60   0     1.0    0.2.   0      63.0

16   60   0     1.0    0      0.05   61.7

17   60   0     1.0    0      0.1    59.2

18   60   0     1.0    0      0.2    52.3

19   60   0     2.0    0.05   0      66.5

20   60   0     2.0    0.1    0      70.3

21   60   0     2.0    0.2    0      68.4

22   60   0     2.0    00.05  7      1.5

23   60   0     2.0    0      0.1    70.7

24   60   0     2.0    0      0.2    66.9

基于综合分析确定本培养基配方为改良的基本培养基附加6-BA、ZT(1～2mg/L)，NAA(0.05～0.1mg/L)，IAA(0.05～0.1mg/L)。经过三年来的实践应用本配方对龙芽楤木叶片愈伤组织植株再生诱导率稳定达到75％，在目前相关研究中尚未见更高报道。实现了通过叶片培养达到快速繁殖龙芽楤木种苗的目的，组培种苗已在生产中得到应用，推广面积达到2000余亩，表现出高度一致性和丰产性，亩产龙芽楤木600～800公斤。

具体实施方式

六月中旬芽苞展开后取叶龄15-20天的叶片用70％酒精浸泡15s，无菌水冲洗2遍，再用0.1％升汞液消毒5～8min或10％NaClO消毒8～10min，无菌水冲洗3～5遍；接种时将叶片尖端剪去，保留叶柄正面向上接种于本发明培养基表面；培养温度24～26℃，光照时间14～16小时，光照强度1800～2000Lx，20～30天继代一次。

本发明配制方法与常规培养基配制方法相同，但配方要求严格，各种元素与激素一定要在其浓度范围内进行配制；另外，本发明涉及的叶片取材时期与灭菌处理也非常关键，否则就会达不到本发明的目的和效果。