用于基于瘤细胞及受刺激的白细胞内mRNA表达谱而预测对肿瘤疾病的免疫应答的方法

摘要

肿瘤坏死因子(TNF)能够通过与癌细胞表面上的特异性TNF受体相互作用而诱导凋亡。因为TNF配体和受体的多种成员存在于每个超家族内，故存在超过300种不同的配体－受体组合。活化的血液白细胞产生TNF作为抗癌免疫应答的部分，并产生趋化因子以吸引其它白细胞至癌症部位。本发明公开了使全血暴露于热聚集性人IgG或抗T－细胞受体抗体而作为免疫系统相互作用的模型时，检测血液白细胞内多种TNF超家族亚型和趋化因子mRNA的显著诱导作用的方法。观察到在诱导的TNF亚型和趋化因子方面个体之间的重大差异。因为外周血液白细胞是抗癌免疫细胞的来源，定量血液内适宜TNF配体和趋化因子的离体诱导性将用于个体化癌症免疫治疗中。如果癌块小，如早期不可见的转移性损害，适宜的TNF攻击可以足以防止复发。

说明书

发明背景

相关申请

本申请要求美国临时申请号60/688,744(2005年7月8日提交)和 60/735,508(2005年11月11日提交)的优先权。

发明领域

本发明涉及用于预测哺乳动物内对肿瘤疾病的免疫应答的方法，其中该方 法基于瘤组织内肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族mRNA的表达谱(profile) 和循环白细胞内肿瘤坏死因子(TNF)超家族mRNA的表达谱。在该方法中， 获得瘤组织的样品并评估表达于这些组织内的TNF-R超家族亚型mRNA。另 外，哺乳动物的全血接受活化血液内T-细胞的刺激物处理并且鉴定应答该刺激 物在表达水平上表现显著改变的TNF超家族亚型mRNA。确定这样的个体对 其疾病可能具有较低严重性的预后，其中所述个体显示与表达于它们的肿瘤组 织内的TNF-R超家族亚型相关的TNF超家族亚型的表达水平改变。

相关技术的描述

不同方式的癌症疗法可以比喻为社会中各种类型力量的用途。化疗类似于 在城市大范围地使用军事力量；相关武器极大的威力可附带造成平民损害。相 反，在循环外周血内作为人体内癌细胞主要杀手的白细胞类似于处理街头犯罪 的城市街道巡逻警察。类似地，当白细胞遭遇身体内癌细胞时，这些细胞是对 癌靶的最初应答者。基于形态学分析和细胞表面标记的表征，使用流式细胞术 或免疫组织化学染色技术，白细胞分类为众多的类和亚类。这些类和亚类类似 于通过制服和身份徽章(budge)确定警官。每mm³外周血的白细胞数目对应 于城市内警察的数目。

当警察遭遇街头罪犯时，他首先必须用手头拥有的武器对付罪犯。但是警 察不总是携带适宜的武器。类似地，不总是给细胞毒性T-细胞提供适用于对付 特定癌细胞的抗肿瘤因子。当癌细胞被IgG包被时，细胞毒性T-细胞经IgGFc 受体(FcRγ)识别癌细胞。该过程称为抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。 实际上，用抗人IgG染色而在癌边缘周围经常识别出IgG(参见例如，Richman AV，Immunofluorescence studies of benign and malignant human mammary tissue， J.Natl.Cancer Inst.1976；57：263-7和Koneval T等，Demonstration ofimmunoglobulin in tumor and marginal tissues of squamous cell carcinomas of thehead and neck，J.Natl.Cancer Inst.1977；59：1089-97)。很多情况下也可以发现单 核白细胞浸润至癌损害内。在细胞毒性T-细胞表面上的FcRγ类似于警察携带 的备有多种武器的口袋。不同类型的FcRγ如CD16、CD32和CD64对应于不 同类型的口袋。棍棒(cudgel)是最初的武器并且待用于任何时候的攻击。在 细胞毒性T-细胞内，棍棒对应于预先合成及贮藏在细胞毒性T-细胞细胞液内 并且一旦FcRγ活化则立即释放的穿孔素(参见Nakanishi等，Perform expressionin lymphocytes infiltrated to human colorectal cancer，Br.J.Cancer 1991；64：239-42)。其它即刻可用的预先合成“棍棒”包括颗粒酶、与消化酶胰 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相关的蛋白酶，可以起到在靶细胞内触发凋亡的作用。

警官还携带威力更大的枪支，可以对应于细胞毒性T-细胞内的肿瘤坏死因 子(TNF)。通常，“子弹”在细胞环境下(TNF亚型)不装填在枪支内并且仅 在Fc受体活化时才得到合成并从细胞毒性T-细胞中释放。TNF能够通过与靶 细胞表面上存在的特定TNF受体相互作用而诱导凋亡。为了维持抗广谱靶细 胞的杀伤活性，存在不同类型的TNF配体(作为TNF超家族的部分，缩写成 TNFSF)。根据GenBank和UniGene信息(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，人 TNF超家族包含总共17个人类成员的多达18个TNF超家族，其中某些编号 (16和17)缺失并且相同编号内具有多种序列(13A和13B)。对于相应TNF 受体(TNF-R超家族：缩写成TNFRSF)，人TNF-R超家族包含多达21个TNF-R 超家族亚型。虽然TNF/TNF-R超家族亚型的相互作用不是严格特异性的，然 而每种配体通常与特定的受体反应，如表1内所示，并且存在超过300个不同 的TNF超家族亚型TNF-R超家族组合。

表1.TNFRSF mRNA和TNFSFmRNA的GenBank UniGene条目列表

TNFRSF(UniGene#)   相应的TNFSF(UniGene#) 1A(Hs.279594) 1B(Hs.256278) 3(Hs.1116) 4(Hs.129780) 5(Hs.472860) 6(Hs.244139) 7(Hs.355307) 8(Hs.1314) 9(Hs.193418) 10A(Hs.401745) 10B(Hs.521456) 10C (Hs.119684) 10C(Hs.119684) 10D(Hs.213467) 11A(Hs.204044) 11B(Hs.81791) 12A(Hs.355899) 14(Hs.512898) 17(Hs.2556) 18(Hs.212680) 25(Hs.462529)     2(Hs.241570)     2(Hs.241570)     1(Hs.36)     3(Hs.376208)     4(Hs.181097)     5(Hs.652)     6(Hs.2007)     7(Hs.501497)     8(Hs.494901)     9(Hs.1524)     10(Hs.478275)     10(Hs.478275)     10(Hs.478275)     10(Hs.478275)     10(Hs.478275)     11(Hs.333791)     11(Hs.333791)     12(NM003809)^*    14(Hs.129708)     13(Hs.54673)     13B(Hs.525157)     18(Hs.248197)     15(Hs.241382)

*：GeneBank登录号(未找到UniGene条目).

当从浸润的细胞毒性T-细胞中释放适宜的TNF超家族亚型时，癌的彻底 消灭可以发生。癌症奇迹幸存者的稀有病例可能是其中TNF超家族亚型 TNF-R超家族亚型完美组合的那些病例。

抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)是涉及结合抗体的白细胞细胞毒 功能的另一种机制(见Perussia等，Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC)and reverse ADCC(redirected cytotoxicity)in human natural killer cells.Methods Mol Biol.2000；121：179-92)。一旦IgG的Fab部分与靶细胞 结合，则IgG的Fc部分活化在白细胞上的Fc受体，则随即活化这些白细胞以 攻击靶细胞。虽然已经研究ADCC多年，但是在涉及ADCC的体外(in vitro) 实验中的条件取决于纯细胞系统中混悬在人工溶液内的效应细胞毒性T-细胞 与靶细胞间的比率。此外，因为细胞溶解通常通过同位素(铬-51)从靶细胞 内的释放进行定量，不知道所观察的细胞溶解是否因穿孔素或TNF发生。也 不知道哪种TNF超家族亚型参与ADCC。

最后，白细胞对付癌的又一个重要机制是释放趋化因子以召集更多白细胞 至发病部位。已经发现此类众多细胞因子。虽然没有建立特定趋化因子与所召 集的特定白细群体间的关系，然而趋化因子释放与白细胞召集现象在对付癌症 中是重要的。这里可以类比为遭遇一伙罪犯的警察用无线电发回总部请求更多 增援。

总之，虽然需要复杂的细胞机制以培育能够识别特定癌标记的适宜白细胞 亚群，并且应当释放适宜的趋化因子以吸引这些成熟的白细胞至损害处，实际 的癌杀伤以两种不同方式发生。立即癌杀伤因穿孔素从这些白细胞中的释放而 发生，随后通过合成和释放TNF而缓慢及持续地诱导凋亡(见Vujanovic，Role of TNF family ligands in antitumor activity of natural killer cells，Int.Rev. Immunol.2001 Jun；20(3-4)：415-37)。TNF通过与靶细胞表面上的特定受体结合 而诱导凋亡。这意味白细胞必须释放与存在于癌细胞上的受体相对应的特定 TNF配体。虽然已经考虑利用TNF/TNF受体的比作为疾病结果的预测(参见 McDermott，TNF and TNFR biology in health and disease.Cell.Mol. Biol.(Noisy-le-grand).2001 Jun；47(4)：619-35)，然而很少了解癌细胞内的TNF 受体谱及白细胞内配体的诱导谱，也很少知道如何召集适宜的白细胞群体。

发明简述

若病理学标本显示IgG沉积在癌边缘，这意味患者至少能够产生识别癌的 IgG。若单核白细胞浸润出现在癌块边缘，这意味患者的白细胞某种程度上被 吸引至癌损害处，可能原因是在结合癌的IgG活化补体期间释放了趋化因子 (C3a、C5a、C567)(见Becker，The relationship of the chemotactic behavior of the complement-derived factors，C3a，C5a，and C567，and a bacterial chemotactic factor to their ability to activate the proesterase 1 of rabbit polymorphonuclear leukocytes，J.Exp.Med.1972；135：376-87)。在癌细胞表面上表达的TNF-R超家 族亚型的类型可以通过例如免疫染色(若抗体可获得)、原位(in situ)杂交或 原位PCR(可从GenBank获得序列)进行鉴定。对表达于浸润性单核细胞内 TNF超家族亚型的鉴定难以解释，因为FcRγ可以未被活化。由于外周血内的 白细胞类似于后备警察，在外周血内供应适宜且充分装备的细胞毒性T-细胞是 抗癌战斗的首要关键步骤。因此，本方法有可能通过定量外周血白细胞内适宜 TNF超家族亚型的诱导性来预测每名患者内的抗癌免疫力。

因此，本发明的实施方式提供测定哺乳动物内肿瘤疾病预后的可能严重性 的方法，该方法包括：测定来自哺乳动物的全血第一样品内的多种肿瘤坏死因 子(TNF)超家族亚型的表达水平；使哺乳动物的全血第二样品暴露于活化全 血内T-细胞的刺激物；测定第二样品内的多种肿瘤坏死因子(TNF)超家族亚 型的表达水平；鉴定在所述第一样品和第二样品之间显示在所述全血内表达水 平显著改变的亚型；并且当已鉴定的TNF超家族亚型与在哺乳动物瘤细胞内 表达的特定肿瘤坏死因子受体(TNF-R)超家族亚型相对应时，确定预后可能 较低的严重性。

在另外方面，瘤组织内表达的TNF-R超家族亚型选自由TNF-R超家族亚 型1A、3、12A和14所组成的组中。在另一方面，瘤组织内表达的TNF-R超 家族亚型得到鉴定。在又一个方面，瘤组织内表达的TNF-R超家族亚型采用 选自由下列所组成的组中的方法鉴定：免疫染色、原位杂交、原位聚合酶链式 反应和体外聚合酶链式反应。

在另外方面，暴露全血包括添加肝素。在另一方面，刺激物选自由热聚集 性人IgG和抗人α/βT-细胞受体单克隆IgG所组成的组中。在另外方面，由发 病细胞表达的肿瘤坏死因子受体超家族亚型选自由下列所组成的组中：TNF-R 超家族亚型1A、1B、3、4、5、6、7、8、9、10A、10B、10C、10D、11A、 11B、12A、14、17、18和25。在另一方面，在所述已被暴露的全血内表达的 肿瘤坏死因子超家族mRNA亚型选自由下列所组成的组中：TNF超家族亚型 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13B、14、15和18。

在另一方面，本方法还包括测定来自哺乳动物的全血第三样品内多种趋化 因子的表达水平；使哺乳动物的全血第四样品暴露于活化全血内T-细胞的刺激 物；测定第四样品内多种趋化因子的表达水平；以及当鉴定在所述的第三样品 和第四样品之间显示在全血内表达水平显著改变的趋化因子时，确定预后可能 较低的严重性。在又一个方面，趋化因子选自由下列所组成的组中：CCL1、 CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、 CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、 CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、 CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL9、CXCL10、 CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL16、IL1B、IL5、IL6、IL8、 IL12A、IL12B、IL15和IL16。

本发明的又一个实施例提供测定饮食成分用于治疗哺乳动物内肿瘤疾病 的可能效用的方法，该方法包括：获得哺乳动物的全血第一样品；使哺乳动物 的全血第二样品暴露于饮食成分；使哺乳动物的全血第一样品和第二样品暴露 于活化全血内T-细胞的刺激物；测定来自哺乳动物的全血第一样品和第二样品 内的多种肿瘤坏死因子(TNF)超家族亚型的表达水平；鉴定在所述的第一样 品和第二样品之间显示在所述全血内表达水平显著改变的亚型；以及当已鉴定 的TNF超家族亚型对应于表达在哺乳动物瘤细胞内的特定TNF-R超家族亚型 时，确定所述饮食成分可能具有用于治疗肿瘤疾病的功用。

在另外方面，使第一样品暴露于活化全血内T-细胞的刺激物之前暴露于对 照刺激物。在另一方面，瘤组织内表达的TNF-R超家族亚型选自TNF-R超家 族亚型1A、3、12A和14。在另外方面，瘤组织内表达的TNF-R超家族亚型 得到鉴定。在另一个方面，瘤组织内表达的TNF-R超家族亚型采用选自由下 列所组成的组中的方法鉴定：免疫染色、原位杂交、原位聚合酶链式反应和体 外聚合酶链式反应。

附图简述

图1A显示在全血暴露于热聚集性IgG(HAG)后，外周血白细胞内所诱 导的TNF超家族mRNA的分析结果；

图1B显示图1A重复分析的结果；

图2显示取自各种腺癌和鳞状细胞癌的组织样品内表达的TNF-R超家族 mRNA的分析结果；

图3显示在全血暴露于抗人T-细胞受体(TCR)单克隆抗体后，外周血白 细胞内所诱导的TNF超家族mRNA的分析结果；

图4A显示当使外周血白细胞暴露于抗TCR抗体并定量TNF超家族亚型 2mRNA表达时，剂量反应和动力学的分析结果；

图4B显示当使外周血白细胞暴露于抗TCR抗体并定量TNF超家族亚型 2mRNA表达时，动力学的分析结果；

图5A显示当使外周血白细胞暴露于HAG并定量TNF超家族亚型15 mRNA表达时，剂量反应和动力学的分析结果；

图5B显示当使外周血白细胞暴露于HAG并定量TNF超家族亚型15 mRNA表达时，动力学的分析结果；

图6显示关于图5数种TNF超家族亚型mRNA及对照mRNA方面的重 复分析结果；

图7显示在全血暴露于HAG后，外周血白细胞内所诱导的TNF超家族 mRNA的分析结果；

图8显示实施例4内所用的趋化因子引物序列；

图9显示在全血暴露于HAG后，外周血白细胞内诱导的趋化因子mRNA 的分析结果；

图10显示在事先用饮食补充物或对照刺激物刺激的全血等分试样暴露于 HAG后，外周血白细胞内诱导的TNF超家族亚型3mRNA的分析结果。

优选实施方式的详述

mRNA的定量

本发明的发明人开发了名为Hem(A)⁺系统的能够定量全血白细胞内基 因表达细微变化的独特技术。该技术在美国专利申请号10/796,298和国际专 利申请系列号PCT/US2004/036309内详细描述，两篇文献均在本文引用作为 参考(还见Mitsuhashi，Absolute quantitation of rnRNA in human blood leukocytes as a model for phenotypic gene expression-based diagnostics，Clin Chem， 52：4(2006))。

在定量技术中，将全血施加至96孔滤板以捕获白细胞。将含有合成性外 来对照RNA和特异性反向引物的裂解缓冲液添加到滤板，并转移细胞裂解物 至用于杂交的寡(dT)固定化微量培养板。随后在寡(dT)固定化微量培养 板内从所述引物位点合成cDNA。将含有特异性反向引物所引发的cDNA的溶 液用于实时PCR。可以贮藏含有寡(dT)所引发的固定化cDNA的平板作为 cDNA库(bank)。

更详细地，该测定方法由3个主要步骤组成：(a)在滤板上分离并裂解白 细胞；(b)在寡(dT)固定化微量培养板内进行mRNA分离、反向引物杂交 和cDNA合成；以及(c)实时定量的PCR。制造定制的96孔滤板，可以通 过装配白细胞还原膜(leukocyte reduction membrane)(Leukosorb；Pall)通过 例如由Whatman或Pall。这些滤板安放在收集平板上，并施加150μL的5 mmol/L Tris(pH7.4)以润湿滤膜。在4℃于120g离心1分钟以从膜上移走 Tris溶液后，施加50μL充分混合的全血样品至每个孔内并立即在4℃于120g 离心2分钟。孔随后用300μL磷酸盐缓冲盐水洗涤一次。在4℃于2000g离 心5分钟以除去盐溶液，添加以1mL/L 2-巯基乙醇(Bio-Rad)、0.5g/L蛋白 酶K(Pierce)、0.1g/L鲑精DNA(5 Prime Eppendorf/Brinkman)、0.1g/L大肠 杆菌(Escherichia coli)tRNA(Sigma)、5nmol/L每种特异性反向引物和10⁹个分子/L的合成RNA34(作为外来对照)补充的60μL贮藏裂解缓冲液[5g/L N-月桂酰基肌氨酸盐、4×标准柠檬酸盐水、10mmol/L Tris-HCl(pH7.4)、1 mmol/L EDTA、1mL/L IGEPAL CA-630(NP-40的替代物)、1.79mol/L异硫 氰酸胍(均来自Sigma)]至滤板的各孔内。随后该平板在37℃温育10分钟， 安放在寡(dT)固定化微量培养板(GenePlate；RNAture)上并在4℃于2000g 离心5分钟。在4℃下贮藏过夜后，微量培养板在4℃用100μL空白裂解缓冲 液(plain lysis buffer)洗涤3次并随后用150μL洗涤缓冲液[0.5mol/LNaCl、 10mmol/L Tris(pH7.4)1mmol/L EDTA]洗涤3次。

可以通过添加30μL含有1×逆转录缓冲液[50mM KCl、10mM Tris-HCL (pH8.3)、5.5mM MgCl₂、1mL/L Tween 20]缓冲液、每种三磷酸脱氧核苷1.25 mM、4单位rRNA酶抑制剂(rRNAsin)和80U的MMLV逆转录酶(Promega； 无引物)并在37℃温育2小时，于每孔内直接合成cDNA。将每30μL反应物 (reaction)、4μL cDNA直接转移至384孔PCR平板内，并添加5μL的TaqMan 通用主混合物(universal master mixture)(Applied Biosystems)和1μL寡核苷 酸混合物(正向引物和反向引物每种5μM和1-2μM TaqMan探针)。PCR可 以在PRISM 7900HT(Applied Biosystems)内进行，在95℃下10分钟1个循 环，随后是45个循环：95℃下30秒；55℃下30秒和60℃下1分钟。每种基 因在独立的孔内扩增。用分析软件(SDS；Applied Biosystems)测定循环阈值 (Ct)，即产生一定量PCR产物(基于荧光)的循环。

为构建用于定量的校正曲线，合成用于每种靶的含有正向引物及反向引物 以及TaqMan探针的序列的合成长DNA寡核苷酸。用于对照RNA34的TaqMan 探针例如是CCAAGGCCCAGCCCTCACACA。可选地，可以利用SYBRGreen PCR。每种寡核苷酸可以通过HPLC纯化至＞95％的纯度。每个PCR含有10-10⁶个分子/孔的这些模板核苷酸。可以使用对于由DNA寡核苷酸所产生的对照 RNA34的校正曲线来将样品的Ct值转换成分子/PCR孔(4μL的cDNA)，随 后乘以7.5(30除以4)以获得分子/样品(30μL的cDNA)。RNA34的回收 百分数通过将这些值除以60μL原始裂解缓冲液内RNA34的量而获得(6×10⁵＝10⁷/mL×60μL)。对于天然mRNA，分子/PCR孔如以上所述用相应校正曲 线加以确定，并且随后通过乘以7.5(30除以4)，除以每一个样品内的RNA34 回收百分数并除以添加到滤板每孔内血液的体积(通常50μL)而将这些值转 换成分子/每微升血液。平均数(SD)从全血的三份等分试样中计算并可以使 用Student t-检验来统计分析。

在实施方式中，使用以上所述的mRNA定量系统(Hem(A)⁺)在各种 癌标本中表征TNF受体超家族(TNFRSF)mRNA的表达谱。随后，TNF超 家族(TNFSF)mRNA的诱导性通过使用分别作为细胞毒性T-细胞介导反应 和抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)的离体模型的小鼠抗人T细胞受体 单克隆抗体或热聚集性IgG对肝素化全血刺激加以定量。使用本领域内众所周 知的统计方法计算表达水平的显著诱导或减少；使用0.05或更小的p值。所 示重大的个体对个体变异表示可以使用本发明的实施方式铺垫个性化癌症免 疫疗法的基础。

实施例1

使用以上所述的mRNA定量方法来定量在施加或不施加由热聚集性IgG (HAG)所引起的离体刺激下的全部类型的TNF超家族mRNA，其中使用所 述的热聚集性IgG作为免疫复合物刺激模型(见Ostreiko等，Production and characterization of heat-aggregated IgG complexes with predetermined molecular masses：light-scattering study，Immunol Lett.1987；15：311-6)。当与靶细胞结合的 IgG分子以高亲和力结合至白细胞上的Fc受体时，免疫复合物形成，导致Fc 受体交联及白细胞活化信号产生。

三份等分试样的每份50μL的肝素化全血与200μg/mLHAG在37℃温育2 小时。随后如上所述，将血液样品施加至96孔滤板以捕获白细胞，并转移细 胞裂解物至96孔寡(dT)固定化的微量培养板以分离poly(A)⁺mRNA。cDNA 在微量培养板上合成并通过监视SYBR绿色荧光而用于384孔平板内的实时 聚合酶链式反应(PCR)(见Morrison等，Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification，Biotechniques 1998；24：954-8，960，96)。简而言之，如此实施SYBR Green PCR，即通过在水 中稀释cDNA 3-4倍，并直接转移4μl cDNA溶液至384孔PCR平板内，向 384孔PCR平板内施加5μl主混合物(BioRad，Hercules，CA)和1μl寡核苷 酸混合物(每种正向引物和反向引物15μM)，并在PRISM 7900HT(ABI)内 实施PCR，在95℃下10分钟1个循环，随后是45个循环：95℃下30秒和、 60℃下1分钟。每种基因在独立的孔内扩增。Ct用分析软件(SDS，ABI)测 定。仔细优化PCR条件，以至在解链曲线分析上检测到单个适宜的峰，无任 何引物二聚体。为验证分析条件，合成RNA34添加至裂解缓冲液内，并且这 种RNA34也通过实时PCR定量。引物的序列特异性通过blast分析证实 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。设定Ct等同于产生一定量PCR产物 的PCR循环，并且ΔCt(ΔCt)还通过从受刺激样品的Ct值中扣除未刺激样 品的Ct值加以计算。由于Ct是对数标度，1ΔCt意指2倍或1.5倍量，并且 负ΔCt指示表达增加。

结果示于图1A和图1B。在所述附图中，通过SYBR Green实时PCR定 量TNFSFmRNA(1-18)和所添加的RNA34对照。ΔCt值3、2、1、0、-1、 -2和-3分别表  1/8、1/4、1/2、0、2、4、8倍增加。在图1A中，每个符号 是来自每一个体的平均值。○符号表示显著增加(p＜0.05)，而Δ符号表示显著 减少(p＜0.05)并且X表示没有变化。图1B显示在连续2日内使用相同的个 体，重复分析2次的结果。符号是来自每一个体的平均数±标准差。分别为●： TNFSF-2(TNFα)，▲：TNFSF-8，◆：TNFSF-15。实线是其中两个数据集合相 同的线。虚线表示±0.5ΔCt。

该技术能够检测在血液白细胞内TNF超家族mRNA的全部成员的基础水 平。如图1A中所示，鉴定当全血暴露于HAG时显著诱导TNF超家族mRNA。 虽然存在巨大的个体对个体变异，优势的TNF超家族mRNA是TNF超家族 亚型2(TNFα)、8和15。这些mRNA分别在80％(12/15)、73％(11/15)和 60％(9/15)的受测试个体内表现HAG诱导性应答。TNF超家族亚型1、3、 4、6(即FasL)、7、9、10(即TRAIL)、14和18mRNA在至少一个受测试 个体内表现HAG诱导性应答。TNF超家族亚型5、11、12、13和13B mRNA 在任何受测试个体内均不表现HAG诱导性应答。TNF超家族亚型2、8和15 中的至少一种在每名受测试个体内因暴露于HAG而诱导。例如，不表现HAG 诱导性TNF超家族亚型2应答的3名个体均表现亚型15应答，而不表现HAG 诱导性TNF超家族亚型15应答的6名个体均表现亚型2应答。其中TNF超 家族亚型8不表现HAG诱导性应答的4名个体的确表现亚型2应答或亚型15 应答。如图1A中所示，所添加RNA34对照的ΔCt完全在±0.5内。为了进一 步验证这些实验，血液样品在连续2日内从相同个体中采取两次。如图1B中 所示，对于TNF超家族亚型2、8、15和RNA34的值以±0.5标准差内可重复。 三份全血等分试样内的变异也小于0.5ΔCt(图1B，每种符号内的X-Y轴 (bar))。

本方法可以按如下方式在实施例内应用。分析从接受手术摘除或活组织检 查的哺乳动物患者中所取出癌标本的IgG沉积、单核白细胞浸润和在癌细胞上 表达的TNF-R超家族亚型的类型。随后从相同个体中获得血液样品并对其分 析以确定哪种类型的TNF超家族mRNA由HAG刺激而诱导并到达何种程度。 将个体分成其中诱导的TNF超家族和表达的TNF-R相匹配的组以及其中它们 不相匹配的组。在这两组中临床结果的比较结果表明匹配的组表现预后的较低 严重性。如果癌块小，如早期的不可见转移性损害，适宜的TNF超家族介导 性免疫系统攻击可能足以防止癌复发。所比较的临床结果因此应当包括缓解的 时间长度和复发(转移)的频率。

实施例2

TNF-R超家族mRNA和TNF超家族mRNA的DNA序列从GenBank下 载，如表1内所示，并且在下文表2内所示的引物序列通过Primer Express (Applied Biosystems)和HYBsimulator(RNAture)设计。在多种转录物之间 的共有区域内设计这些序列，如果此类变体存在。在无cDNA下，无扩增发生 (无引物二聚体)并且在解链曲线分析中检测到单峰。

表2：所用的引物序列

靶mRNA   正向   反向 TNFRSF-1A TNFRSF-1B TNFRSF-3 TNFRSF-4 TNFRSF-5 TNFRSF-6 TNFRSF-7 TNFRSF-8 TNFRSF-9 TNFRSF-10A TNFRSF-10B TNFRSF-10C TNFRSF-10D TNFRSF-11A TNFRSF-11B TNFRSF-12A TNFRSF-14 TNFRSF-17 TNFRSF-18 TNFRSF-25 TNFSF-1 TNFSF-2 TNFSF-3 TNFSF-4 TNFSF-5 TNFSF-6 TNFSF-7 TNFSF-8 TNFSF-9 TNFSF-10 TNFSF-12 TNFSF-13 TNFSF-13B TNFSF-14 TNFSF-15 TNFSF-18 RNA34   CCTGCCAGGAGAAACAGAACA   CAAGCCAGCTCCACAATGG   CCTCCCGGGCTCTCTACAC   ACGACGTGGTCAGCTCCAA   GGCCAAGAAGCCAACCAATA   TGGCATCAACTTCATGGAAAGA   CTGCAGAGCCTTGTCGTTACAG   GGTTGAGGCAGCAAACAGATG   CGTCGACTGCGTTGCTCTT   TGAGGACAATGCTCACAACGA   CTGAGACAGTGCTTCGATGACTTT   GGAAGTGTAGCAGGTGCCCTAGT   ATGGACTTACGAGGGTTCGACTTAG   GGAAACAGTAACTCCACGTTCATCT   TGCAAACCCAGTGACCAGATC   CGCTGATCCAGTGACAATGTG   CAGGGAGCCTCGTCATCGT   GGAGGAAGGCGCAACCAT   AGTTTTGGCTTCCAGTGTATCGA   CCTGCTCGCCCCTATCG   CAGCTATCCACCCACACAGATG   CGAAGGCTCCAAAGAAGACAGT   AGGGTGTACGTCAACATCAGTCA   GCCCCTCTTCCAACTGAAGAA   CCACAGTTCCGCCAAACCT   TGGCAGCATCTTCACTTCTA AATG   CACACTCTGCACCAACCTCACT   ACCACCATATCAGTCAATGTGGAT   AGCTACAAAGAGGACACGAAGGA   GGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATG   TACTGTCAGGTGCACTTTGATGAG   ATATGGTGTCCGAATCCAGGAT   ATGCCTGAAACACTACCCAATAATT   CGTCCGTGTGCTGGATGA   TGCGAAGTAGGTAGCAACTGGTT   CGGCTGTATAAAAACAAAGACATGAT   AGCCCCCTCACTCCCAAA   GGAGACACACTCGTTTTCTCTTAGAA   TGACCGAAAGGCACATTCCT   TCATGGGTGATAAATTGGTTCCT   GCGGCAGACTGTGTCCTGTGT   GAAGATCGTCGGGAAAATTGAT   GCAAGAGTACAAAGATTGGCTTTTT   GCTCCGGTTTTCGGTAATCC   GCCTGGTGGTTAAGGTCTGATG   TTCTGCCCCGTTTAACAACAG   TTGCTGCTCAGAGACGAAAGTG   CCATGAGGCCCAACTTCCT   ACCAAATTCTTCAACACACTGGATAT   GGAAAAGAGATGTACAGCCTACAGTAGTAAGC   GCGAGGTCTGGCTGACGTA   AAGGTGTCTTGGTCGCCATT   GCGTCTGGGAGGCAGAGA   CACCCCTTGGCTTTCTTCTTT   GCAGCTGGCAGGCTCTTG   GCAGTCTGTCCAAGGTTTGCA   TTCACCCCCTCTCGACATTC   CGAAGGCTCCAAAGAAGACAGT   CAGGGCAATGATCCCAAAGT   CACGGCCCCAAAGAAGGT   GGTATTGTCAGTGGTCACATTCAAG   CACCTGGTTGCAATTCAAATACTC   GAAATGAGTCCCCAAAACAT CTCT   TGCACTCCAAAGAAGGTCTCATC   GAAGATGGACAACACATTCTCAAGA   CGCAGCTCTAGTTGAAAGAAGACA   AAAAGGCCCCGAAAAAACTG   CGCAGTGGCTGAGAATTCCT   CCTGACCCATGGTGAAAGTCA   GCAAGTTGGAGTTCATCTCCTTCT   CATGAAAGCCCCGAAGTAAGAC   CCATTAGCTTGTCCCCTTCTTG   TCCCCAACATGCAATTCATAAG   GGGTGCTGTGCTTCTGTGAAC

每种mRNA的量通过以上所述的方法在做如下调整时加以测定。简而言 之，大约125mg冰冻的癌标本与以1％2-巯基乙醇(Bio Rad)、0.5mg/mL蛋 白酶K(Pierce)、0.1mg/mL鲑精DNA(5 Prime Eppendorf/Brinlαnann)、0.1 mg/mL大肠杆菌tRNA(Sigma)、10mM每种TNF-R超家族亚型特异性反向 引物和作为外来对照的10⁷个分子/mL合成RNA34补充的1mL裂解缓冲液混 合，并通过Polytron(Brinlαnann)进行匀浆。施加70μL这些裂解物至用于 mRNA纯化的寡(dT)固定化微量培养板(GenePlate，RNAture)。在4℃温育 过夜后，微量培养板在4℃用100μL空白裂解缓冲液洗涤3次并随后用150μL 洗涤缓冲液(0.5mol/L NaCl、10mmol/L Tris、pH7.4、1mmol/L EDTA)洗涤 3次。通过添加30μL含有1×RT-缓冲液(50mM KCl、10mM Tris-HCL、pH 8.3、5.5mmol/L MgCl₂，无二硫苏糖醇)缓冲液、每种三磷酸脱氧核苷1.25mM、 4单位rRNA酶抑制剂和80U的MMLV逆转录酶(Promega；无引物)并在 37℃温育2小时直接在每孔内合成cDNA。将100μL水添加至30μL这些cDNA 内并将4μLcDNA转移至384孔PCR平板内，其中向所述PCR平板施加5μL Taq SYBR主混合物(BioRad)和1μL引物的混合物(每种正向引物和反向引 物10μmol/L)，并且在PRISM 7900HT(Applied Biosystems)内实施PCR，在 95℃下10分钟1个循环，随后是45个循环：95℃下30秒和60℃下1分钟。 每种基因在独立孔内扩增。用分析软件(SDS；Applied Biosystems)测定循环 阈值(Ct)，即产生一定量的PCR产物(荧光)的循环。在无cDNA下，证实 无扩增(无引物二聚体)并且在解链曲线分析中检测到单峰。为了在20个不 同mRNA间比较多个样品，对每个Ct扣减来自相同样品的TNFRSF1A的Ct (ΔCt，Y-轴)。正Ct意指比TNFRSF1A更低的表达，并且1ΔCt意指1.5倍 表达。每种符号代表来自单个标本的平均值。图2中每一列的左侧(○◆)显 示来自包括结肠、肝脏、胃、子宫的腺癌样品及3个乳腺癌病例(◆)样品以 及黑素瘤样品的结果。右侧(△)显示来自鳞状细胞癌的结果，包括肺癌、咽 癌、舌癌和颈癌(cervical cancer)样品。

对于分析由抗人T细胞受体(TCR)单克隆抗体在肝素化全血内诱导的 TNF超家族mRNA，分析结果示于图3内，60μL全血在37℃用5μg/mL抗 TCRα/β或对照IgG仅刺激2小时，重复三份。如上所述，施加50μL血液样 品至滤板内以捕获白细胞，随后通过添加裂解缓冲液在膜内进行裂解。如上所 述实施poly(A)⁺mRNA的纯化、cDNA合成和实时PCR。通过从抗TCRα/β 的Ct中扣减对照IgG的Ct值计算ΔCt。每种符号代表来自单一个体三次重复 的血液等分试样的平均ΔCt。还定量作为外来对照而添加至裂解缓冲液内的合 成RNA34以验证每个分析。

使用分析软件(SDS，Applied Biosystems)确定循环阈值(Ct)，即产生一 定量的PCR产物(荧光)的PCR循环。虽然DNA芯片技术(见Schena等， Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray，Science 1995；270：467-70)能够同时分析众多基因，但是该技术缺少 精确定量的能力，并通常需要多于3倍的增加作为有意义的结果。相反，以上 所述的DNA定量技术通过考虑每一样品内的RNA回收效率和cDNA合成效 率而提供更精确的定量，并且可以检测到统计显著的微小如150％(1.5倍)一 样的变化。因此，如上所述，通过SYBR Green实时PCR(见Morrison等， Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification，Biotechniques 1998；24：954-8，960，96)分析由本方法所制备 的每种cDNA中的每种mRNA。

图2显示在各种癌(结肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、黑素瘤、 肺癌、咽癌、舌癌和子宫颈癌)内TNF-R超家族mRNA表达的结果。为了在 20个不同mRNA间比较多个样品，从每个观察到的Ct(ΔCt，Y-轴)中扣减 来自相同样品TNF-R超家族亚型1A的Ct。正Ct意指比TNFR超家族亚型1A 更低的表达水平，并且1ΔCt意指1.5倍表达水平。如图2中所示，几乎全部 癌组织表达高水平的TNF-R超家族亚型1A、3、12A和14。

这表示如果癌浸润性白细胞能够在浸润部位产生TNF超家族亚型1(即 淋巴毒素)(对应于TNF-R超家族亚型3)、TNF超家族亚型2(即TNFα)(对 应于TNF-R超家族亚型1A和1B)、TNF超家族亚型12(对应于TNF-R超家 族亚型12A)、TNF超家族亚型14(对应于TNF-R超家族亚型14)或这些配 体的组合，则可能根除任意这些类型的癌。虽然在评估的样品内TNF-R超家 族亚型4、5、8、9、11A和11B及17的表达水平非常低(图2)，不能排除其 它样品可以表达这些受体亚型的可能性。因此，白细胞内TNF超家族亚型4 (对应于TNF-R超家族亚型4)、TNF超家族亚型5(即CD40配体)(对应于 TNF-R超家族亚型5)、TNF超家族亚型8(即CD30配体)(用于TNF-R超家 族亚型8)和TNF超家族亚型13和13B(对应于TNF-R超家族亚型17)的 诱导性也可能对癌症免疫疗法是重要的。虽然存在巨大的个体对个体变异，白 细胞内TNF超家族亚型6(即Fas配体)(对应于TNF-R超家族亚型6)、TNF 超家族亚型7(即CD27配体)(对应于TNF-R超家族亚型7)、TNF超家族亚 型11(对应于TNF-R超家族亚型11A和11B)、TNF超家族亚型18(对应于 TNF-R超家族亚型18)和TNF超家族亚型15(即DR3的配体)(对应于TNF-R 超家族亚型25)的诱导性可能对其中相应受体表达水平高的癌是重要的。尽 管在癌内的TNF-R超家族亚型10A mRNA表现高表达，然而诱饵受体TNF-R 超家族亚型10B的mRNA表达(见Sheridan等，Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors.Science 1997 Aug 8；277(5327)：818-21和Pan等，An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL，Science 1997 Aug 8；277(5327)：815-8)比 TNF-R超家族亚型10A更高。然而，TNF-R超家族亚型10(即TRAIL)仍可 能是用于治疗某些癌的有用靶。在腺癌/黑素瘤(示于图2内各列左侧)和鳞 状细胞癌(示于图2内各列右侧)之间不存在明显差异。

T-细胞受体(TCR)是识别特定外来的非己分子的细胞毒性T细胞的细胞 表面分子。TCR在抗原呈递的初始步骤以及癌杀伤中的作用是众所周知的(见 例如Mami-Chouaib，Antitumor cytotoxic T-lymphocyte response in human lung carcinoma：identification of a tumor-associated antigen，Immunol Rev.2002 Oct；188：114-21)。虽然细胞免疫学中常见的实验采用纯细胞系统，该系统利用 混悬于人工溶液内的分离的细胞，本发明实施例内所用的mRNA分析法允许 鉴定在离体刺激全血后各种mRNA水平的变化。因所述的mRNA分析法比前 面的纯细胞系统更接近生理状态，故本实施例使用在全血内TCR与靶分子相 互作用的刺激，其中存在细胞对细胞以及细胞对血浆的相互作用。

由于全血含有细胞毒性T细胞和其它类型的白细胞，故TCR特异性地由 抗人α/βTCR小鼠单克隆gG1k(“抗TCR”可从BioLegend获得)刺激。作 为对照，还使用相同浓度纯化的小鼠IgG1k(也从BioLegend获得)。60μL全 血在37℃下用5μg/mL抗TCR或或对照IgG仅刺激2小时，重复三份。剂量 和温育时间通过抗TCR对外周血白细胞内TNFSF mRNA表达影响的初步分析 加以确定，其中所述初步分析的结果示于图4A和4B内。就剂量反应和动力 学而言，如图4A中所示，三份等分试样的每份60μL的肝素化全血与PBS(○)、 10μg/mL(■)或1(◆)μg/mL小鼠抗人α/βTCR IgG1k混合，或与10(□) μg/mL或1(◇)μg/mL纯化的小鼠IgG1k混合，并在37℃下温育0-7小时。 随后如上所述定量TNFSF-2mRNA。就动力学而言，如图4B中所示，TNFSF-2 (●)、TNFSF-5(◇)、TNFSF-6(△)、TNFSF-9(□)和TNFSF-14(▲)的ΔCt 通过从各自的Ct值中扣减对照IgG的Ct值进行计算。每个数据是来自全血的 三份等分试样的平均数±标准差。ΔCt通过从使用抗TCR所获得的Ct值中扣 减使用对照IgG所获得的Ct值进行计算。

如图3中所示，抗TCR刺激特异性地诱导TNF超家族亚型2、5、6、9、 10和14。TNF超家族亚型2和14的结果是特别有意义的，因为这些受体的 mRNA表达水平在全部类型的癌中都高(见图2)。同时类似于联合化疗，活 化多重TNF/TNF-R超家族亚型相关的级联可以防止癌细胞的抵抗机制。用添 加至裂解缓冲液内的合成RNA34对照获得的结果显示出极小变化，小于±0.3 ΔCt(图3中的RNA34)，表明该测定系统是可靠的。更重要地，TCR应答表 现巨大的个体对个体变异，并且分别地，9名个体中的6名(66％)没有显示 TNF超家族亚型2的抗TCR介导性诱导，以及9名个体中的5名(56％)没 有显示TNF超家族亚型14的抗TCR介导性诱导。另外，显示阴性TNF超家 族亚型2应答的个体也显示阴性TNF超家族亚型14应答。然而，这些个体 的确显示其它的阳性TNF超家族配体。

实施例3

在本实施例中，如实施例1中那样，利用作为ADCC内所发现的免疫复 合物的模型而广泛使用的热聚集性人IgG(HAG)来刺激全血内白细胞的Fc 受体。简而言之，将人IgG(Sigma)以20mg/mL混悬于PBS内并在63℃下 加热20分钟。将重复三份的60μL全血在37℃下用200μg/mLHAG或对照磷 酸盐缓冲盐水(PBS)刺激仅2-4小时。HAG的剂量和温育时间通过初步分 析确定，如图5和图6中所示。

图5A显示剂量反应分析的结果。三份等分试样的每份60μL的肝素化全 血与各种浓度的人IgG(○)或HAG(●)混合并在37℃下温育2小时。图5B 显示动力学的分析结果。三份等分试样的每份60μL的肝素化全血与PBS(○) 或200mg/mL HAG(●)混合并在37℃温育0-12小时。随后定量 TNFSF-15mRNA。每个数据是来自全血的三份等分试样的平均数±标准差。

图6显示重复性分析的结果。血液在1-3日内从相同个体中抽取并定量 HAG-诱导的TNFSF mRNA和对照RNA34。符号分别表示：○：RNA34，●： TNFSF-2，◆：TNFSF-8和▲：TNFSF-15。每个数据是来自全血的三份等分试 样的平均数±标准差。实线是其中两个数据集合相同的线。虚线表示±0.5ΔCt。

如图7中所示，HAG主要诱导TNF超家族亚型2、8、14、15和18的表 达。TNF超家族亚型15的诱导比用抗TCR刺激所获得的TNF超家族亚型的 诱导更高(图3)。此外，HAG应答表现重大的个体对个体变异。一些个体仅 表达TNF超家族亚型15，并且其它个体表达TNF超家族亚型2和8而无TNF 超家族亚型15应答。有意义的是全部个体均显示至少1种TNF超家族应答。 添加至裂解缓冲液的对照RNA34的结果显示小于±0.6ΔCt的极小变化(图3 中的RNA34)，表明该测定系统是可靠的。为了验证分析法的重复性，血液在 1-3日内从相同个体中抽取二次。不过，结果非常相似，ΔCt差异小于0.5(图 6)。在使用HAG和抗TCR刺激独立地检验血液的9名个体中，由HAG刺激 所诱导的TNF超家族亚型15表达应答与由抗TCR刺激所诱导的TNF超家族 亚型2和14表达应答不相关。

实施例4

在本实施例中，来自数名个体的全血接受HAG刺激，并且趋化因子组的 mRNA水平的变化用如实施例1内所述的相同方式进行评估。使用RNA34和 CD4mRNA作为对照。用于待分析趋化因子mRNA的正向引物序列和反向引 物序列示于图8。

分析结果示于图9内。在该图中，圆圈表示其中特定趋化因子mRNA的 水平由HAG刺激显著诱导的个体。三角形表示在刺激后mRNA水平显著减少， 而X符号表示没有显著改变。如可以从图9中看出，应答在个体间不同，虽 然存在共同点：例如，全部受测试个体均表现CCL-3和CCL-20；CXCL-1、 CCL-2和CCL-3；以及IL-8和IL-1B的显著诱导。

这些结果表示有可能确定癌症患者能够召集更多白细胞至发病部位的可 能性，并且如果在特定趋化因子与特定白细胞群间建立联系，则可能使用图9 内所示数据，基于所召集白细胞群体与肿瘤细胞之间的TNF/TNF-R匹配分析 来评估召集能够有效对付肿瘤的白细胞群体的可能性。

实施例5

在本实施例中，评估各种饮食成分如补充物对TNF超家族亚型3mRNA 水平的HAG-诱导性变化的影响。“饮食成分”指可由哺乳动物摄取的任何化 合物或物质而“饮食补充物”表示用来补充哺乳动物饮食的那些有益饮食成分， 如维生素和天然提取物以及其它化学化合物如药物。因此，“饮食成分”含义 更广泛并包括“饮食补充物”。所用的饮食成分是：维生素A(10nM，终浓 度)、染料木黄酮(大豆(soy))(100nM)、姜黄色素(辛料姜黄(spice turmeric)) (100nM)和栎精(植物色素类黄酮)(100nM)。据报道全部这些饮食成分 对免疫系统或癌或同时对二者有影响。已知维生素A可以刺激免疫系统。在 某些研究中发现染料木黄酮具有抗癌活性；其可能的作用机制包括上调凋亡、 抑制血管发生、抑制DNA拓扑异构酶II并抑制蛋白酪氨酸激酶。姜黄色素在 癌细胞内具有促凋亡效应(proapoptotic effects)并干扰在癌细胞内经常高度过 量表达的转录因子NF-κB的活性。已经证实栎精促进大鼠内天然杀伤细胞的 活性并抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞和中性粒细胞的脱颗粒。在本实施例中， 使用磷酸盐缓冲盐水作为对照。

肝素化全血与各种饮食补充物在37℃下预温育1小时(在如上所述的血 液浓度上)，随后用1.2μL的热聚集性IgG刺激4小时。血液随后在37℃温育 2小时，随后使用实施例1内所述的方法评估TNF超家族亚型3mRNA的水 平。引物序列在上文表2内给出。TNF超家族亚型3又称作淋巴毒素-α(LTα)、 肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和淋巴毒素-β(LTβ)。分泌的LTα组装成可溶性 同三聚体LTα3。分泌的LTα还与膜结合的LTβ复合以产生两个类型的异三 聚体：LTα1/β和LTα2/β1。亚型3由活化的天然CD4细胞、非极化的分泌 IL-2的效应细胞和Th1效应细胞表达，并且亚型3特异性受体由某些肿瘤细 胞表达。

结果示于图10内。在图10中，空心圆圈表用PBS对照所获得的TNF超 家族亚型3值。而实心圆圈表示使用HAG刺激物时所获得的亚型3值。亚型 3mRNA的基础水平不因饮食补充物的预处理而变化(空心圆圈)。然而，该 结果显示HAG导致显著诱导暴露于栎精的血液内的TNF超家族亚型3表达 (p＝0.03)。如果该个体也具有表达适宜TNF-R亚型(亚型3)的肿瘤细胞， 则该基因表达的增加可以增加肿瘤细胞凋亡，因此，栎精将是包含在具有抗癌 特性的用于该个体的饮食内的优良候选者。图10内的Y-轴值表示循环阈值 (Ct)。每个数据是来自50mL肝素化的全血的三份等分试样的平均数±标准 差。

本领域技术人员将认识到还有可能筛选药物和其它化学性化合物以类似 地影响特定TNF超家族亚型或趋化因子的表达，因此本实施例的系统可以广 泛用于筛选用于在特定个体内发动抗癌免疫应答的物质。

通过病理学检验经常在手术切除的组织标本内观察到癌浸润性白细胞。然 而，这些发现对患者而言并不总是毫无疑问的良好征兆：有时候癌症进展甚至 在白细胞浸润存在时发生。当该现象发生时，病理学家往往疑惑不解。本发明 的实施方式还提供对此项技术的进一步改良：在癌细胞内的TNF-R超家族亚 型与在浸润性白细胞内的TNF超家族亚型的匹配可能是良好的预后征兆，尤 其当趋化因子诱导也得到证实时。

浸润性白细胞的病理学分析难以解释，因为我们不知道每种白细胞是否遭 遇癌细胞并且TNF超家族级联是否被活化。定量的基线TNF超家族mRNA 水平也难以解释。相反，本发明的实施方式使用在抗TCR或HAG刺激后， 对TNF超家族mRNA亚型表达的功能性变化的分析。由于浸润性白细胞来自 血流，本发明实施方式的离体功能性分析将成为有用工具用于在癌症患者及在 患有如自身免疫疾病、炎症、移植等的其它疾病的患者内，就诊断监视、治疗 监视、预后标记和对有效免疫调节药物、基于单克隆抗体的药物、基因疗法及 疫苗鉴定方面分析免疫功能。该分析法简单且接近生理条件(2-4小时温育不 分离白细胞的全血)、有统计分析意义地精确(全血的三份等分试样作为原材 料)和敏感(60μL全血足以用于全部17种TNF超家族亚型mRNA定量)。 由于全血的三份等分试样之间的mRNA数据变异极小，因此该分析法允许鉴 定在很多情况下如0.5-1.0ΔCt那样小的基因表达的显著改变，这远优于基于 DNA芯片的方法学或常规的实时PCR。NK细胞或细胞毒性T-细胞的数目可 以通过流式细胞分析或免疫组织化学染色定量，其中每一细胞群体通过特定的 细胞表面标记鉴定。然而，不清楚这些标记阳性细胞是否在分析时具有预期的 功能。虽然本实施例的方法不鉴定具有每种TNF超家族亚型mRNA的刺激应 答的特定细胞群体，该方法显示整体的功能，这对理解单个的人有用。所获得 的巨大个体变异可以导致发现个体的特定遗传构成。虽然TNF超家族应答在 1-3日内显示良好的重复性(图6)，该应答也可以经过长时间并因施饮食补充 物和锻炼而变化，这表明涉及到非遗传因素。因此本实施例的方法代表未来个 性化癌症免疫疗法的前进方向。

这类个性化癌症免疫疗法将基于增加血液白细胞内适宜TNF超家族亚型 的表达以及通过适宜的趋化因子信号作用召集亚型特异性白细胞。以上所述的 实施例的系统和方法将用于药物筛选、验证和临床试验。此外，相同系统可以 可应用于自身免疫疾病，其中抑制适宜的TNF超家族是用药目的。

城市中大量提供适度装备的警察仅在这些警察派往犯罪现场时才有意义 的。如果警官遭遇一伙罪犯，他或她的主要任务是呼唤帮助以引导更多同事至 现场，而不是尽量只身逮捕罪犯。对于细胞毒性T-细胞而言，这种行为可能相 当于释放趋化因子如CCL和CXCL趋化因子和白细胞介素(IL)(序列可从 GenBank和UniGene获得)。因此，监视外周血白细胞内CCL、CXCL和IL 也是重要。类似于警察调度员，肿瘤学家能够通过监视外周血内每个患者自身 免疫细胞的供应而组织患者自身的免疫细胞。