人类免疫系统的动物模型及产生它的方法

摘要

本发明涉及在非人类哺乳动物中建立可操作的适应性的人类免疫系统的方法。本发明的系统特征在于以下步骤：a)将具有造血潜能的人类干细胞移植到非人类哺乳动物中，以及b)使用人类细胞系、细胞和/或组织培养物的细胞培养上清液调制非人类哺乳动物，和任选的c)使用无独立造血潜能的支持细胞。如此建立的动物模型包含造血系统的人类具有免疫能力的细胞，所述细胞尤其包括T和B细胞，单核细胞，树突细胞，NK细胞，粒细胞和CD34

说明书

本发明涉及在适合的动物模型中建立功能性适应性人类免疫系统 的方法，以及通过该方法产生的动物模型。该动物模型适合用于例如 临床前药理学研究以及人类抗体的生产。优选情况下，几乎不能对移 植的细胞发展出任何免疫反应的免疫缺陷小鼠可以用于此目的。

医学治疗特别是再生医学领域中的基本策略和技术，其特点通常 在于动物模型(例如通过使用啮齿动物)。但是，当将用这种方法获 得的原理使用于人类的临床应用时，通常难以界定治疗产品或治疗策 略是否对于人类靶是最适的。因此，有两种可能性：a)在临床应用中 人类靶是有病的，或b)治疗药剂不具有同样的功能性质。这对于肿瘤 或移植疗法(尤其是干细胞移植)来说是特别有关联的，在利用种-特 异性单克隆或多克隆抗体制剂的免疫疗法中也受到特别的关注。制药 公司面临着这样的挑战，即只有10％的在临床研究中试验的活性成分 最终能够产生新的被批准的药物。为了验证以及接受新的技术或工作 策略，需要临床前的模型和工具，在其中可以在尽可能复杂的系统生 物学背景中研究人类细胞和组织。就此而论，其中的人类免疫系统细 胞可以彼此反应而不被排斥的免疫缺陷小鼠可以提供一个解答，因为 它们将小动物模型的优点和与改进的临床病症相关性结合起来了。到 目前为止，已经实现了两种在啮齿动物中开发相应动物模型的策略。

第一种策略利用了用于产生遗传修饰(转基因、敲除、敲入)动 物的技术，通过诱导特定的突变或用同源的人类基因替换鼠类基因， 将人类基因导入体细胞或生殖细胞，以模拟遗传修饰或表达人类抗原 或靶。除了花费高和成功率低之外，这种方法的局限性还特别在于通 常只产生单个人类性质、以及它们通常与动物配体分子的反应性以及 通常与不一致的基因表达控制机制的反应性。因此，该方法通常专门 用于对活性成分在活性成分的代谢以及毒性的确定方面进行定性，或 用于检测单个靶或一组靶的活性(1；2)。

第二种也是更复杂的途径是通过异体移植产生嵌合体(3)。这包 括在通常是免疫缺陷的动物中使用人类细胞或组织。用于产生人类免 疫系统的良好的宿主动物是在适应性免疫中有几个缺陷的小鼠株系， 例如Rag2^-/-/γ^-/-(4)、BNX或NOD/SCID B2m^null株系。NOD/SCID(非 肥胖型糖尿病/严重合并免疫缺陷)小鼠的不同株系被用作人源化的标 准模型。它们基本上通过下面的免疫缺陷性质进行定性：完全失去B 淋巴细胞和T淋巴细胞、NK细胞数量减少、抗原呈递细胞的分化和功 能缺陷、以及缺少循环补体。这些小鼠比野生型更易受电离辐射的影 响，它们在DNA修复系统中有缺陷。在移植了人类造血干细胞、分化 的造血细胞以及淋巴器官后，在免疫缺陷动物中形成人类血细胞生成 单个株系或几个株系是可能的。根据所用的小鼠株系及其调理以及造 血干细胞的数量和来源的不同，在动物的外周血或脾脏和骨髓中发育 出0.1到90％的人类CD45⁺细胞是可能的。

缺点是血细胞生成重建的高度可变性。此外，根据小鼠的株系和 动物调理的不同，表现的个体人类细胞类型不同。NOD/SCID小鼠的特 征是优选的并且几乎专门生长B细胞。人类B淋巴细胞表现出典型形 式的免疫球蛋白基因重排(6)，在使用人类胎儿、脐带血或成年淋巴 祖细胞后产生了多样性的免疫球蛋白库(7)。循环T细胞没有或仅以 极小量形成，并且形成滞后。只有在用重组的肿瘤坏死因子预处理动 物并使用大量单核细胞后，才能检测到T-淋巴细胞的快速和强烈的发 育(8)。但是，人类移植移植物与动物组中有非常高的差异。对人类 T-细胞的表现型进行定型研究显示出，尽管具有可变性，根据使用的干 细胞来源的不同，CD4/CD8的比值是1∶1或1∶2。细胞具有多样化的 T-细胞受体库。在使用PHA或IL-2的体外增殖研究中对这些T-细胞进 行的初步功能分析显示出它们可以被活化，但是仅仅是非常低的水平。 U.S.6,627,792 B2利用了被操作的病人的肋骨组织切片，将其通过皮下 注入腹膜腔内，成功地重建了T-细胞。它们的可用性和伦理学考虑限 制了其应用。在静脉内注射了该骨组织的个体细胞悬浮液后，人类的 嵌合现象非常低，几乎不能检测到T-细胞。U.S.6,060,643利用了G-CSF 调动的外周血(PB)、胎儿和成人骨髓(FBM、ABM)在BNX小鼠 中重建人类造血细胞。在移植了PB或ABM后6-8周后，只有17％或 4.7％的小鼠是嵌合的，变化性极高。使用FBM后没有获得嵌合。不 到3％或15％的接受了PB或ABM或FBM移植的动物被证实显示出长 期的移植现象。接受PB的动物在30天后平均存活率为25％。这可能 与自反应细胞形成或调节活性细胞种群没有发育有关。只有在使用成 年供体的外周血之后才发现移植物抗宿主疾病的清晰特征(9)。这说 明了到目前为止人类细胞在动物模型背景中功能潜力不能令人满意。

到目前为止，在移植了人类脐带血单核细胞后，发现巨噬细胞树 突状细胞类型的人类细胞仅仅是不成熟的CD34^-HLA-DR⁺CD4⁺树突 状细胞前体(DC)。在NOD/SCID小鼠的淋巴器官中没有检测到成熟 的DCs(10)。尽管在动物模型中DCs向成熟细胞的分化被阻断了， 在体外条件下成熟的DCs被证明在混合的白细胞反应中是有效的刺激 物。Cravens等(11)证实了在NOD/SCID小鼠中不添加细胞因子的 情况下人类成熟和反应性DCs的发育。细胞对体外LPS刺激作出反应， 导致细胞因子IL-8、TNF-α、IL-10以及IL-12p70的大量分泌。IL-1β、 IL-6和IFNγ的释放相对较低。然而，这些细胞因子是人类系统中急性 或全身性感染的特征。因此，还需要进一步开发出其中的细胞因子产 生情况可以与目标人类系统相比较的系统。

综上所述，显然目前存在的方法和模型部分地反映出人类造血细 胞的发育和成熟以及它们在动物中的反应性。但是，目前还没有成熟 的方法能够产生标准化的、可重复的、代表了人类的整体、特别是适 应性免疫系统的模型。但是，为了使临床前期的试验更有效并使治疗 失败最小化，绝对需要这种方法。人类特异性治疗或再生药剂的制备 和使用需要有正常功能的人类树突状细胞、T-细胞、B-细胞、NK细胞、 单核细胞和粒细胞的存在。

因此，本发明所解决的问题是提供能够永久性生产不具有现有技 术中已知的缺点的人类特异性嵌合体的新方法。具体来说，本发明的 目的是增加在动物中具有造血潜能的细胞的移植物生长的可靠性，以 及最小化再生结果的个体间差异。通过这种方式，提供了能够具有可 比的反应形式和强度纯系的实验组的条件。

此外，本发明的目的是以均衡的方式永久地生产造血系统的所有 细胞，以及在动物中分别发育出细胞典型的反应形式。本发明将能够 使人类细胞在动物中以其典型的方式协同作用，并且通过这种方式提 供有功能的人类的，特别是适应性的，免疫系统。嵌合体应该不显示、 或仅显示出最少的移植引起的抗宿主生物体的反应的特征。此外，部 分基于该方法的非常高的动物死亡率(15-65％)应该被最小化。

作为这个目标的解决方法，本发明提供了利用新的调理宿主动物 方法克服已知解决方案的现有技术缺点的方法。

根据本发明，目标可以通过在非人类哺乳动物中产生用于人类免 疫系统的动物模型的方法来解决，包括下列步骤：

a)将具有造血潜能的人类干细胞移植到非人类哺乳动物中；以 及

b)用人类细胞系、细胞和/或组织培养物的细胞培养上清液调理 非人类哺乳动物，以及可以选择的

c)给药本身不具有造血潜能的支持细胞。

本发明的特征在于使用了“调制的细胞培养上清液”，其含有信 使物质、特别是人类来源的信使物质的组合(鸡尾酒)。它们与人类 干细胞结合给药，被用于生产本发明的动物模型(免疫系统嵌合体)， 优选在免疫缺陷动物中生产。

本发明的方法的优点是能够形成B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、NK 细胞、单核细胞、粒细胞、造血干细胞以及树突状细胞，并能发展出 这些细胞的细胞类型特异性反应。因此，获得了在其功能性的显著特 征方面反映了人类、特别是适应性免疫系统的模型。本发明可用于所 有体内或衍生的体外的应用，只要其中用于诊断目的、研究目的、医 疗方法的开发和试验、或者产品的开发而需要涉及人类细胞的免疫过 程。例如单克隆人类抗体的生产和使用，疫苗接种策略、动物实验疾 病模型的开发，药物活性成分的测试，器官移植后、特别是通过给药 人类的、人源化的或鼠类抗体诱导免疫耐受的策略的开发。

本发明的方法的重要特点显示在权利要求书中，在随附的权利要 求书中的权利要求将在下面以概括的方式解释。

被认为对本发明的嵌合体的产生来说是重要的是单独或与支持细 胞相结合使用“调制的细胞培养上清液”进行调制。

“调制的细胞培养上清液”被定义为已经与单独存在的或组织样 品中的细胞分离开的无细胞的可溶相，其中在组织样品中细胞的分离 是在各种不同分子已经在保温期间被分泌到细胞培养上清液中之后。 此外，无细胞的体液、例如血浆、血清或腹水也被该术语所涵盖。分 泌细胞优选应该与用来产生嵌合体的干细胞源属于同样的物种。优选 情况下，应该使用能够永久或在适当的刺激或分化后产生可溶性因子 例如细胞因子的人类细胞系来产生细胞培养上清液。例如细胞系358/8 (从NCI-H358衍生，欧洲细胞培养物保藏中心，European Collection of Cell Cultures，Salisbury，Wiltshire，UK，No.95111733)及从其衍生的亚 克隆(亚克隆SC25，从Institut fr Zoologie，Universitt Leipzig获得)、 A-549(人类II型肺细胞，LGC Promochem，Cell Biology Collection ATCCNo.CCL-185^TM，London UK)以及VA-ES-BJ(人类上皮样肉 瘤细胞系，Deutsche Sammlung fr Mikroorganismem und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，DE，ACC 328)。

细胞培养上清液优选含有在从358/8、A-549和VA-ES-BJ中选择 的细胞系的细胞培养上清液中、或上述细胞系中的两种或三种的混合 细胞培养上清液中包含的因子。

已经发现细胞培养上清液中存在因子IL-8、IL-6、VEGF、IP-10、 MCP-1、ANG和t-PA是有利的。

在上述的细胞培养上清液中存在的IL-8、IL-6、VEGF、IP-10、 MCP-1、ANG和t-PA的优选浓度范围分别为20pg/ml到10mg/ml。

在上述的培养上清液中包含的细胞因子的特别优选浓度范围如 下：IL-8(500pg/ml到10ng/ml)、IL-6(50pg/ml到1ng/ml)、VEGF (500pg/ml到10ng/ml)、IP-10(20pg/ml到1ng/ml)、MCP-1(500 pg/ml到10ng/ml)、ANG(20pg/ml到1ng/ml)、以及tPA(500pg/ml 到15ng/ml)。

相反，TNF-α、IL-10、MIG、RANTES、sVCAM-1、sCD40L、bFGF、 sP选择素或IGF是不需要的或不需要高浓度的(≤20pg/ml)。

用细胞培养上清液进行调制的时间点可以在移植日之前和之后一 天或几天。给药量不应该违背根据实验动物的治疗的指导方针所确定 的普遍推荐剂量。

优选情况下，调制的培养上清液在细胞移植后直接给药，并且在 随后的14天的时间内隔日给药。

对于给药的位置没有限制。但是，推荐静脉内或腹膜内给药。在 小鼠的情况下，腹膜内给药的目标是每次给药大约200μl的量，优选 150μl到250μl。在移植前测试每种选定的“调制的细胞培养上清液” 在动物模型中的相容性是有利的。

除了给药含有干细胞的源之外，在本发明的方法的特殊变化中， 使用了所谓的“支持细胞”，它们本身不具有造血潜能。在这一点上， 可以使用例如干细胞源的干细胞减少的(最大干细胞含量≤0.1％)或 干细胞阴性的细胞种群(最大干细胞含量≤0.01％)以及间充质干细胞。 具有致癌潜能的“支持细胞”的使用应该被避免。例如脐带血或骨髓 的CD34阴性或CD133阴性的单核细胞可以用作支持细胞。支持细胞 的优选使用浓度在每次细胞移植1×10⁴到5×10⁷个细胞的范围内。已 经认识到优选将支持细胞与含有干细胞的种群一起使用。

对于动物模型来说，优选利用免疫缺陷的哺乳动物、优选啮齿动 物、特别优选小鼠作为产生嵌合现象的宿主动物。动物的性别并不重 要。具体来说，小鼠的年龄应该超过6周。当受体是主要在适应性免 疫反应中具有几种免疫缺陷的近亲交配株系的后代时，该方法更为便 利。优选的是小鼠株系SCID以及NOD/SCID(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA)、Rag2^-/-/γ^-/-(Taconic Animal Models，Lille Skensved， DK)、BNX(Taconic Animal Models，Lille Skensved，DK)或NOD/SCID B2m^null(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA)、NOD/SCID IL-2-受 体-γ链^null(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，USA)。大部分情况下免 疫缺陷动物应该饲养在特定的无病原体条件下；其他情况下，标准的 管理就足够了。

产生嵌合现象所需的干细胞可以从任何含有干细胞的来源取得。 优选情况下，这些细胞应该具有造血(生血)潜能。这样的造血干细 胞是能够增殖并能够产生造血系统、特别是免疫系统的所有细胞的细 胞。这样的干细胞主要可以在人类骨髓、被调动的和未被调动的外周 血、脐带血和脐带组织制备物中发现。用于本发明的干细胞能够产生 人类免疫系统的细胞。具体来说，干细胞可以分化成B-淋巴细胞和T- 淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、粒细胞以及树突状细胞。

供体的年龄和性别是不重要的。干细胞的富集是可能的，但是一 般并不需要。优选情况下，应该制作单核个体细胞级分。推荐使用常 规方法除去红细胞和粒细胞。可以使用新鲜获得的以及低温保存的制 备物。用选择性的活力染料例如CFSE染色细胞并不妨碍方法的成功。

总的来说，在其中产生嵌合现象的动物通过调制变得更有接受力， 调制的目的是和其它材料一起作用除去残留的动物免疫能力细胞用于 随后的干细胞移植。优选情况下，这通过对受体生物体进行放射性辐 射来实现。放射性同位素以及X-射线装置可用作辐射源。辐射不应该 超出推荐的动物特异性的亚致死剂量。该剂量对于每种培育的株系来 说是分别确定的。一般来说，应该进行一次辐射而不进行多次辐射。 对于NOD/SCID小鼠来说单次辐射的亚致死剂量一般是250-350cGy。

移植的实施可以在通过辐射调制后马上进行或延迟进行。术语马 上意味着在辐射后立即进行，而延迟包括几天。一般来说，可以考虑 辐射后3到24小时的时间窗口。对移植实施的位点没有强制要求。对 于单独的细胞悬浮液来说优选进行静脉内或腹膜内给药。如果需要可 以对动物进行麻醉。优选情况下，对每只小鼠移植1×10³到5×10⁷个 含有干细胞的单核细胞。优选情况下，CD34阳性干细胞的含量优选在 5到5×10⁵的范围内，优选在1×10³到1×10⁴的范围内。

移植后，动物被保持在标准条件或特定的无病原体条件下。

产生的嵌合的发展通过在有规律的时间间期、使用基于移植受体 动物的外周血样品的对照来确定。在小鼠中，特别是从眼球后视丛或 尾部静脉收获血是有利的。人类细胞的比例优选通过使用人类特异性 抗体(株系标记物、分化抗原、活化标记物)的流式细胞检测来确定。 在最小样品体积的情况下，推荐使用对应的种特异性的泛白细胞标记 物例如CD45，如果可能的话直接比较供体和受体种。

有利的是，当使用本发明的方法时，在移植后已经14天时，在外 周有把握地检测人类细胞是可能的。这种形式的监测在本发明的条件 下可以对短暂的重建成功给出可靠的结论。此外，人类细胞在外周的 存在与在脾脏和骨髓中的移植相关。

本发明克服了产生人类嵌合动物的现有技术的问题和缺点，通过 使用新的动物调制方法联同人类干细胞，提供了新的可标准化的、高 度可重复的方法。

本方法能够提供等价值的嵌合体，因此减小了现有技术中已知的 高度个体间差异。在本发明的条件下，观察到的致死率仅仅是10％。

本发明的新的方面是可靠地实现了形成人类造血系统的具有免疫 能力的细胞的嵌合体。

因此，本发明的另一个目标是在非人类动物中建立具有人类免疫 系统的动物模型，其中含有人类的具有免疫能力的造血系统细胞。具 体涵盖的是T细胞和B细胞、单核细胞、树突状细胞、NK细胞、粒细 胞以及CD34⁺干细胞。所有的动物在本发明条件下在外周血、脾脏和 骨髓中表现出人类移植物。优点是永久地重建了造血能力。在移植后 56天时在按照本发明处理的NOD/SCID小鼠中被分析的人类血像的表 达和成分可以在5个月的时间间期内被有利地检测到。因此按照本发 明产生的用于人类免疫系统的动物模型是非常稳定的。

本发明有利地提供了表达免疫系统的动物，该系统在特别是反应 性适应性免疫系统方面与人类的免疫系统具有可比性(等效)。在本 发明的动物模型中，具有人类免疫能力的细胞有利地具有与人体中可 比的功能性，特别是可比的对抗原的反应和可以与人类分布情况可比 的细胞因子分布情况。

动物模型中的人类树突状细胞能够组成型产生人类白细胞介素 -8，并且在免疫刺激(例如用LPS)后能够产生人类白细胞介素-6、人 类白细胞介素-1β和人类肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。

令人吃惊的是，动物没有显示出移植物抗宿主疾病的可见的特征。 作为在受体生物体中人类造血干细胞的新的稳定的表达的结果，从其 衍生的细胞的进一步移植可以在一个或几个次级受体中有利地进行， 通过这种方式，可以进行嵌合生物体的进一步繁殖。

调制过的移植受体动物在它们的脾脏中含有平衡量范围内的人类 细胞T-细胞(中值为29％)和B-细胞(中值为20％)。此外，人类 NK细胞(中值为0.36％)、单核细胞(中值为1.1％)、粒细胞(中 值为4％)以及CD34阳性干细胞(中值为0.7％)也可以检测到。中 值是基于对21个动物的测定获得的。

被证实体内形成人类免疫球蛋白M和免疫球蛋白G，这成为人类 B细胞活性的证据。

树突状细胞(骨髓中人类细胞的0.2％-2.4％)的高度反应性被体 外LPS刺激后细胞因子的产生所证实。细胞在刺激后24和48小时产 生了细胞因子例如IL-1β(超过1,000pg/ml)、IL-6(超过5,000pg/ml)、 TNF-α(超过90pg/ml)以及IL-10(超过100pg/ml)。细胞因子IL-8 已经组成型分泌。该细胞因子的情况可以与人类中的感染事件相比。 由于树突状细胞作为潜在的在适应性免疫系统的活化和表达中具有重 要功能的抗原呈递细胞(外源和内源抗原)的反应性以及反应性人类T 细胞和B细胞的同时存在，就提供了与人类免疫系统的功能性等效的 (嵌合)动物模型。

小鼠中人类适应性免疫系统的功能性已经被诱导的T细胞依赖性 抗原特异性抗体的生产(免疫作用)的证实所明确地证明。免疫反应 的成熟已经通过产生抗原特异性抗体免疫球蛋白G同种型的方式被证 明。

因此，本发明的动物模型有利地代表了人类免疫系统的模型系统， 其适合于产品开发和研究、特别是药物学研究、临床前研究、病原学 研究、新的诊断策略或治疗策略的开发的。

本发明的产生人类反应性嵌合体的方法以及根据本发明由此产生 的动物模型能够有利地产生人类单克隆和多克隆抗体。特别重要的是 产生完全人类的抗体，它们不含有基于动物的外源部分，并具有完整 的生理糖基化。这些人类抗体对于药物市场、治疗市场以及诊断市场 来说是非常重要的。

按照本发明在动物模型中产生的人类细胞有利地具有检测外源和 内源抗原以及在其基础上产生免疫反应的能力。此外，在此基础上， 可以衍生出产生抗原特异性树突状细胞，例如通过使用人类、人源化 或鼠类治疗抗体测试免疫治疗方案，研究免疫调节物质(染色质修饰 物、“小分子”)或免疫调节有效的细胞种群(间充质干细胞、调节 性T细胞、组织工程产品)的特征的可能性。

该模型可以有利地用作平台技术，进一步开发用于传染性疾病(例 如HSV、EBV、HIV、风疹)、自身免疫疾病、肿瘤性疾病、移植相 关疾病或炎症性疾病和治疗策略的模型。

下面将在一个实施方案和相关的图的帮助下解释本发明的方法。

1.调制的上清液的制备

人类肺细胞癌细胞系(这里是II型肺细胞系358/8亚克隆[从 NCI-H358衍生]，从Institut fr Zoologie，Universitt Leipzig获得)或 肉瘤细胞系(VA-ES-BL，Deutsche Sammlung fr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，DE，ACC 328)在无菌条件下在添加 了5％胎牛血清的RPMI 1640中生长，直到其达到对数生长期。为了产 生调制的培养基接种2-4×10⁵个细胞/ml。在3天后收获培养基，在无 菌条件下收集、过滤(孔径大小0.2m)，并分成小份储存在至少-20 ℃下直到进一步使用。

在调制的培养上清液中含有的细胞因子出于下面列出的浓度范围 内：IL-8(500pg/ml到10ng/ml)、IL-6(50pg/ml到1ng/ml)、 VEGF(500pg/ml到10ng/ml)、IP-10(20pg/ml到1ng/ml)、MCP-1 (500pg/ml到10ng/ml)、ANG(20pg/ml到1ng/ml)、以及tPA (500pg/ml到15ng/ml)。

然而，TNF-α、IL-10、MIG、RANTES、sVCAM-1、sCD40L、 bFGF、sP-选择素或IGF不能被检测到，或不能以较高浓度(≤20pg/ml) 被检测到。

2.在小鼠中产生人类免疫系统的方法

至少6周龄的雄性和雌性NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories， USA)被培养在特定的无病原体的条件下，并用作受体。通过X-射线 治疗仪以350cGy进行动物的全身照射，在照射后3-5小时，将从人类 脐带血分离的1-10×10⁶个单核细胞注射到乙醚麻醉的动物的尾静脉 中。使用了从单个供体的血液获得的细胞和几种混合血液样品的细胞。 单核细胞通过密度梯度离心使用淋巴细胞分离培养基LSM 1077(PAA Laboratories，Pasching，AT)按照Boyum(1976)的方法分离。在移植前 将单核细胞级份在-196℃下储存至少24小时，在移植日即时融化。将 细胞在4℃下储存在培养基或PBS中直到进行移植。在给药细胞后， 立即通过腹膜内注射第一剂200μl的通过上述方法获得的人类肺细胞 系的调制的细胞培养上清液。在不使动物镇定的情况下每两天给药另 一剂量的上清液，直到移植后14天。

为了证实附加的调制的效果，比较组也接受了相应的细胞级份， 但是没有给药细胞培养上清液。

3.人类嵌合现象以及免疫系统的功能性的特征定性

作为在小鼠中重建的人类造血系统对照，从移植后第14天开始， 每两周通过穿刺尾部静脉或用解剖刀轻轻划开尾部静脉从每只小鼠获 取大约75μl血样。为了防止凝结，在样品中加入肝素钠，然后将样品 充分混合。在移植后8周时，杀死小鼠以确定人类的长期移植，并分 离动物的外周血、脾脏、骨髓和肝脏。分别从固体器官通过机械方法 生产单个细胞悬浮液。如果需要，通过尼龙滤膜进行过滤来分离细胞 的结缔组织。红细胞使用蒸馏水或含有氯化铵的缓冲液来裂解。为了 研究移植的特征，使用了直接结合的人类特异性抗体，该抗体在分析 前已经测试了其与鼠类抗原的可能的交叉反应性。下列的人类特异性 抗体可以使用：CD45、CD3、CD19、CD56、CD14、CD16、CD34、 HLA-DR、抗谱系鸡尾酒、CD11c、CD123(Becton Dickinson，Heidelberg， DE)。此外，为了进行特异性对照，用鼠特异性CD45抗体(IQ Products， Oldenburg，DE)进行了标记。每个株系对应的数据是基于人类CD45 阳性细胞的相对比例。标记的样品通过FACS Calibur(Becton Dickinson) 进行分析。当受体的人类CD45阳性细胞的含量≥0.1％时，表现出人 类嵌合现象。

在利用调制的细胞培养上清液移植了脐带血的5×10⁶和10×10⁶个单核细胞后，所有的动物都显示出人类嵌合现象。动物的死亡率是 大约10％。

图1显示了给药了调制的上清液的移植后8周时，移植受体 NOD/SCID动物中的外周血、脾脏和骨髓的流式细胞分析结果。点状图 显示了用人类特异性抗体例如CD19(通用B细胞标记物)、CD3(通 用T细胞标记物)、CD34(干细胞标记物，主要包括造血干细胞以及 株系特征性前体细胞)鉴定的活细胞对用CD45(通用淋巴细胞标记物) 的作图。

正如图1所显示的那样，人类T淋巴细胞和人类B淋巴细胞以及 人类造血干细胞被产生。此外，人类单核细胞和人类NK细胞以及人类 粒细胞被检测到。前述的细胞种群可以在所有造血器官例如外周血、 脾脏和骨髓中检测到。

图2a显示了给药调制的上清液的移植后8周时，移植受体 NOD/SCID动物中的骨髓(代表了脾脏和外周血)的流式细胞分析结果。 点状图显示了通过人类特异性抗原例如HLA-DR、CD11c(右图，R5 区)或CD123(左图，R4区)的表达，以及在包含在抗谱系鸡尾酒抗 体混合物中的株系特异性抗原例如CD3(通用T细胞标记物)、CD16 (嗜中性粒细胞标记物、检测NK细胞亚群以及单核细胞、巨噬细胞)、 CD19和CD20(通用B细胞标记物)、CD14(单核细胞标记物，检 测巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞)以及CD56(通用NK细胞标 记物，T细胞亚群)不存在所鉴定的人类树突状细胞。

在图2a中表明活细胞没有或只少量表达株系特异性抗原。这些细 胞含有两种人类树突状细胞种群。

类浆(plasmoidic)树突状细胞种群通过CD123以及HLA-DR的表 达鉴定(图2a，左图，R4区)。在嵌合动物的骨髓中，中值为0.21％ 的细胞是类浆树突状细胞。在全身给药LPS(10μg/小鼠)后，与全身 性细菌感染相似，类浆树突状细胞的比例增加到2.4％。

髓样树突状细胞种群在细胞表面表达CD11c以及HLA-DR(图2a， 右图，R5区)。在嵌合动物的骨髓中，中值为0.17％的细胞是髓样 树突状细胞。在全身给药LPS(10μg/小鼠)后，与全身性细菌感染 相似，髓样树突状细胞的比例增加到2.1％。

树突状细胞是抗原呈递细胞的重要代表，形成了产生适应性免疫 反应的基础。此外，它们极大地参与了发展免疫耐受的过程。细胞的 功能性反应性源自用LPS全身刺激后树突状细胞比例的增加。

此外，也检测到了人类嗜碱性细胞(I型过敏性反应的效应器细胞) (图2a，左图，R3区)。

图2b显示了给药调制的上清液的人源化NOD/SCID小鼠在LPS 刺激(10μg/小鼠，白色的条)后分离的骨髓细胞释放的细胞因子与 没有进行刺激的对照(黑色的条)的比较。

为了测试人类细胞的活性，重建的NOD/SCID小鼠的骨髓细胞在 体外用LPS进行刺激以模拟感染。也进行没有刺激的对照试验。在刺 激后24小时和48小时，通过BD细胞测量珠阵列分析在FACS-Scan (Becton Dickinson)上进行培养上清液中人类特异性细胞因子例如 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70以及TNF-α的测定。

基于可诱导的细胞因子强烈的释放，清楚地证实了人类树突状细 胞的反应性(图2b)。在刺激后24小时和48小时，细胞产生了细胞 因子例如IL-1β(超过1,000pg/ml)、IL-6(超过5,000pg/ml)、TNV-α (超过90pg/ml)和IL-10(超过100pg/ml)。细胞因子IL-8已经被 组成型分泌。细胞因子的分布情况可以与人类中感染事件的细胞因子 分布情况相比。此外，基于在对照培养物中细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10、 TNF-α和IL-12p70的分泌不存在或很少，可以说明骨髓的细胞在刺激 前不在重建小鼠中显示出炎症事件的指征。

图3a和3b显示了使用调制的细胞培养上清液对移植受体小鼠脾 脏中人类T淋巴细胞和B淋巴细胞的分布的影响。图3a显示了不给药 调制的上清液的对照，图3b显示的是给药调制的上清液的情况。提供 了每个细胞系系相应的数据(中值，黑色三角形，数字在条的右边) 作为人类CD45阳性细胞的相对比例。条形代表了试验动物中的分布(2 个四分位数和2个极值)。

作为与对照的比较，调制对于T淋巴细胞和B淋巴细胞的分布的 影响被显示在图3中。在不给药调制的细胞培养上清液时(图3a)， 人源化动物主要产生B细胞(中值：62％的CD19阳性细胞)，其可 以在血液、脾脏和骨髓中检测到。动物仅具有中值为1.6％的T-细胞 (CD3阳性细胞)。

另一方面，在使用了调制的细胞培养上清液后(图3b)，形成了 均衡量的T细胞(29％的CD3阳性细胞)和B细胞(20％的CD19 阳性细胞)。这些动物中分布有中值为1％的单核细胞/巨噬细胞(CD14 阳性细胞)、4％的CD16阳性细胞(NK细胞、粒细胞、单核细胞亚 群)以及0.7％的CD34阳性干细胞或特征性前体细胞。在B淋巴细胞 和T淋巴细胞均衡分布的基础上，提供了产生特异性免疫反应、特别 是T细胞依赖性免疫反应的先决条件。所有的嵌合动物，在给药了调 制的细胞培养上清液后，都在特别是骨髓中定殖了CD34阳性干细胞种 群。通过这种方式，在动物中保证了永久的造血功能。因此，通过将 选定的嵌合动物的骨髓移植到其它受体中，可以进行选定条件下的增 殖。

检测到了各种人类细胞类型(图1、2、3)，为适应性免疫系统 特定的功能性反应性提供了先决条件。

图4a和4b显示了通过使用调制的上清液在人类单核细胞移植后 产生人类嵌合现象的动力学。含有的人类CD45阳性细胞的含量大于等 于全部细胞0.1％的受体表现出人类嵌合现象。

在这个方面，图4a显示了在所有已经移植了5×10⁶MNC的动物 (黑色的带有菱形的线)的血液中人类CD45阳性细胞的中值含量，以 及相对于14天时(白色条)人类CD45阳性细胞含量的增加。

图4b显示了已经移植了5×10⁶MNC的动物的血液中人类CD45 阳性细胞的平均含量相对于人类移植发展的函数。基于“低”响应者 (与第14天相比CD45阳性细胞的相对比例的增加＜1，n＝9[9只动 物])与“高”响应者(与第14天相比CD45阳性细胞的相对比例的增 加＞1，n＝12[12只动物])对动物进行分组。

“低”响应者的数据(倒三角形)由带有圆圈的黑色线和黑色条 代表。“高”响应者的数据(正三角形)由带有方块的黑色线和白色 条代表。

表面分子CD45被所有白细胞表达。因此，人类CD45阳性细胞 的含量代表了人类造血系统在宿主中的发育。

所有动物在给药5×10⁶个细胞后都显示出可以在任何时间点被检 测到的人类移植(人类CD45阳性细胞的含量大于等于全细胞的0.1％)。 如同图4a中显示的那样，从移植后14天开始，血液中CD45阳性细胞 的比例连续地增加，直到第56天。在第56天时，可以检测到平均增 加了13倍。所有移植动物的血液中人类CD45阳性细胞的平均含量是 10.5％。但是在试验动物组中可以发现好的和坏的反应者亚类，它们可 以在较早时期通过测定CD45细胞的含量来确定。可以通过确定所有第 14天后血液中人类CD45阳性细胞含量相对于第14天时含量的增加来 认识到该亚分类。值大于1被确定为“高”反应者，值小于1被确定 为“低”反应者。因此，在移植后第28天，更可靠在第42天，可以 对每个动物的重建能力做出清楚的说明(图4b)。“高”反应者在移 植后第56天在血液中含有平均18％的人类CD45阳性细胞，而“低” 反应者平均仅为0.7％。

图5显示了给药调制的上清液后在人源化小鼠的淋巴器官中(移 植后第56天)人类CD45阳性细胞的相对中值含量作为低和高移植的 函数的图。动物的分组的实现依据图4b中的描述，分为“高”反应者 (图5的左侧-“高”，n＝12[12个动物])和“低”反应者(图5的右 侧-“低”，n＝9[9个动物])。

外周血中人类CD45阳性细胞的相对含量的测定在很大程度上与 脾脏和骨髓(BM)中人类细胞的含量相关(图5)。因此，“高”反 应者在骨髓中含有中值(图5中的黑色三角形)为36.5％的人类CD45 阳性细胞，而另一方面，“低”反应者仅有0.6％。对比条件反映在脾 脏中的细胞分布中(18.4％对1.3％)。

因此，测定外周血中人类CD45阳性细胞的含量的增加，使得可 以早期选择具有低的个体间差异的测试动物组用于进一步的实验。图 示的结果也证实了所有的造血器官都是从人类细胞形成集群的。

图6显示了移植8周后人源化小鼠的骨髓中人类CD45阳性细胞 的中值相对含量作为使用的MNC数量、因此也是其中包含的干细胞的 数量的函数的图，作为使用了调制的上清液以及使用支持细胞的函数 的图。中值以菱形图示，相应的数值分别显示在条形的右边。脐带血 单核细胞的AC133阴性细胞级分被用作支持细胞。AC133是表面分子， 具体来说在造血干细胞(这些细胞中的大部分反过来带有CD34)以及 神经元干细胞和胰腺细胞前体细胞上表达。在对照实验中该细胞级份 其本身没有造血移植。

嵌合的水平依赖于使用的细胞的数量(图6)。在不用调制的上 清液对受体进行额外的调制的情况下，在使用1×10⁶个脐带血单核 细胞(MNC)后仅有几个动物表现出极其低水平的嵌合(n＝7[7个动 物]，左边的列)。人类CD45阳性细胞的相对比例中值为0.01％，因 此低于成功移植的定义值。

通过使用调制的细胞培养上清液(n＝4[4个动物]，从左数第二 列)，动物表达了中值为0.02％的人类CD45阳性细胞。

但是，当给药1×10⁶个MCN和4×10⁶个支持细胞(脐带血的 AC133阴性MNC)并加入调制的上清液时，动物可以成功地表达人类 嵌合(n＝5[5个动物]，从左数第三列)。CD45阳性细胞的中值相对 比例是9.8％。

使用5×10⁶个支持细胞(脐带血的AC133阴性MNC)不显示出 人类移植(n＝5[5个动物]，从右数第二列)。额外给药调制的上清液 没有增加人类CD45阳性细胞的形成(0.01％的CD45阳性细胞，n＝ 2[2个动物]，右边的列)。

然而，值得注意的是在不使用上清液进行调制的情况下，在给药 10×10⁶个细胞后，在动物中产生了显著的嵌合(43.4％的CD45阳性 细胞，n＝9[9个动物]，中间的列)。

但是，在使用细胞培养上清液对受体进行调制的情况下，在使用 10×10⁶个细胞后以非常高的水平(46.4％，CD45阳性细胞，n＝5[5 个动物]，从右数第三列)产生的嵌合的极其低的变异性是显著的。这 种非常低的变异性以及以非常高的水平存在的稳定的人类嵌合是人源 化小鼠的进一步使用(例如用于病原研究)的理想的先决条件。

为了测试在小鼠中形成的人类B细胞的正常功能，通过ELISA测 定了血清中的人类免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)。测 试显示与鼠免疫球蛋白没有交叉反应性。检测极限是20ng/ml免疫球 蛋白。

通过人类特异性免疫球蛋白(Ig)测定，证实了移植5×10⁶个细 胞后嵌合体中B细胞的体外反应性。从第49天开始检测到IgG的生产， 为752ng/ml，其后连续增加，在第56天时达到6,728ng/ml的水平， 伴随着IgM的产生。

为了测试人类适应性免疫系统的正常功能，使用破伤风类毒素 (TT)对人源化NOD/SCID动物进行了T细胞依赖性免疫。通过ELISA 使用人类特异的TT特异性抗体分析(IgG、IgM)分析了免疫反应性 (图7)。

实验在按照解释过的方法已经发展出完整的人类免疫系统的动物 中进行，该发展出的人类免疫系统的相对T细胞比例＞20％(移植后 56天时血液中的CD3阳性细胞的相对比例，n＝2；图7中左边的T细 胞组)。作为对照组，使用了血液中相对人类T细胞比例＜2％的动物 (图7中右边的B细胞组，n＝6)。免疫通过分别在第0天(免疫的 第0天对应于移植后第56天)、第14天、第28天和第42天腹膜内 注射50μg GERBU佐剂10(Gerbu，Gaiberg)中的破伤风类毒素来实 现。在免疫后第42天(对应于移植后第112天)。

图7显示了在用破伤风类毒素(TT)免疫后，在具有已建立的人 类免疫系统的小鼠中实现了IgM和IgG形式的抗原特异性免疫反应。 在免疫(Imm)后第42天(D42)，在具有高T细胞含量的动物(T 细胞组，白色的条)中可以检测到破伤风类毒素特异性人类IgM (hu-TT-IgM)和IgG(hu-TT-IgG)抗体。在具有低的相对T细胞比 例(B细胞组，黑色的条)的嵌合动物中没有产生TT特异性抗体。

在小鼠中产生的人类免疫系统是稳定的，在移植后远远超过3个 月后仍然是有功能的，正如基于人类抗体形式的T细胞依赖性免疫反 应(图7)所证实的那样。

引用的文献列表：

(1)Tornell J，Snaith M.Transgenic systems in drug discovery：from target identification to humanized mice.(药物发现中的转基因系统：从 靶的鉴定到人源化小鼠)Drug Discovery Today 2002；7(8)：461-470.

(2)Bolon B.Genetically engineered animals in drug discovery and development：A maturing resource for toxicologic research.(药物发现和 开发中的遗传工程动物：用于毒理学研究的日臻成熟的资源)Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology 2004；95(4)：154-161.

(3)Igney FH，Asadullah K，Zollner TM.Techniques：Species′finest blend-humanized mouse models in inflammatory skin disease research. (技术：物种的最精细的混合-炎症性皮肤病研究中的人源化小鼠模型) Trends in Pharmacological Sciences 2004；25(10)：543-549.

(4)Traggiai E，Chicha L，Mazzucchelli L，Bronz L，Piffaretti JC， Lanzavecchia A et al.Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice.(在脐带血细胞移植小鼠中人类适 应性免疫系统的发生)Science 2004；304(5667)：104-107.

(5)Kollet O，Peled A，Byk T，Ben Hur H，Greiner D，Shultz L et al. beta 2 microglobulin-deficient(B2m(null))NOD/SCID mice are excellent recipients for studying human stem cell function.(β2微球蛋白缺陷 (B2m(null))的NOD/SCID小鼠是研究人类干细胞功能的优良受体) Blood 2000；95(10)：3102-3105.

(6)Rossi MID，Medina KL，Garrett K，Kolar G，Comp PC，Shultz LD et al.Relatively normal human lymphopoiesis but rapid turnover of newly formed B cells in transplanted nonobese diabetic/SCID mice.(在移 植的非肥胖型糖尿病/SCID小鼠中人类淋巴细胞生成相对正常，但新形 成的B细胞快速更新)Journal of Immunology 2001；167(6)：3033-3042.

(7)Kolar GR，Yokota T，Rossi MID，Nath SK，Capra JD.Human fetal，cord blood，and adult lymphocyte progenitors have similar potential for generating B cells with a diverse immunoglobulin repertoire.(人类胎 儿、脐带血和成年人的淋巴细胞祖细胞具有同样的潜力来产生具有多 样化的免疫球蛋白库的B细胞)Blood 2004；104(9)：2981-2987.

(8)Samira S，Ferrand C，Peled A，Nagler A，Tovbin Y，Ben Hur H et al.Tumor Necrosis Factor Promotes Human T-Cell Development in Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficient Mice.(肿瘤坏死 因子在非肥胖型糖尿病/严重合并免疫缺陷小鼠中促进人类T细胞的发 育)Stem Cells 2004；22(6)：1085-1100.

(9)Vallet V，Mauray S，Kindler V，Aubry D，Ruegg M，Cherpillod J et al.Human tonsil implants xenotransplanted in SCID mice display broad lymphocytic diversity and cellular activation profile similar to those in the original lymphoid organ.(异体移植在SCID小鼠中的人类扁桃体植入 物表现出与原初淋巴器官中类似的广阔的淋巴细胞多样性和细胞活化 情况)Xenotransplantation 2005；12(1)：38-48.

(10)Nobuyoshi M，Kusunoki Y，Seyama T，Kodama K，Kimura A， Kyoizumi S.Arrest of human dendritic cells at the CD34(-)/CD4(+)/HLA-DR+ stage in the bone marrow of NOD/SCID-human chimeric mice.(在NOD/SCID-人类嵌合小鼠的骨 髓中使人类树突状细胞停留在CD34(-)/CD4(+)/HLA-DR+阶段)Blood 2001；97(11)：3655-3657.

(11)Cravens PD，Melkus MW，Padgett-Thomas A，Islas-Ohlmayer M， del M，Garcia JV.Development and Activation of Human Dendritic Cells In Vivo in a Xenograft Model of Human Hematopoiesis.(在人类造血功能 的异体移植模型中人类树突状细胞的体内发育和活化)Stem Cells 2005；23(2)：264-278.

缩写表：

在本发明的说明书和附图中使用了下列缩写：

ANG     血管生成素

APC     别藻蓝素

bFGF    基本成纤维细胞生长因子

CD      分化簇

CFSE    羧基荧光素琥珀酰亚胺酯

DSZM    Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und

        Zellkulturen GmbH(德国微生物和细胞培养物保藏中 心)

EBV     Epstein-Barr病毒

ELISA   酶联免疫吸附分析

HLA     人类白细胞抗原

HIV     人类免疫缺陷病毒

HSV     人类口腔炎病毒

hu      人类

IGF     胰岛素样生长因子

IL      白细胞介素

IP-10   干扰素诱导的蛋白10

BM      骨髓

LPS     脂多糖

MCP-1   单核细胞趋化物蛋白-1

MIG     干扰素诱导的单核因子

MNC     单核细胞

NOD     非肥胖型糖尿病

NK      自然杀伤细胞

PC7     藻蓝蛋白  7

PE      藻红蛋白

PerCP   多甲藻素叶绿素蛋白

RANTES  活化调节的、T细胞正常表达和分泌的

sCD40L      可溶性CD40-配体

SCID        严重合并的免疫缺陷

sP selectin 可溶性血小板选择素

sVCAM-1     血管细胞粘附分子-1

TNF-α      肿瘤坏死因子-α

tPA         组织特异性血纤维溶酶原活化剂

VEGF        血管内皮细胞生长因子