一种编码双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列及其氨基酸序列与应用

摘要

本发明涉及一种编码双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列及其氨基酸序列以及利用该基因生产的重组蛋白的抗虫活性，所述的基因序列和编码蛋白的氨基酸序列分别如序列表中序列1和序列2所示，其中编码双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因的核苷酸序列长333bp，编码的双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的氨基酸序列全长110个氨基酸残基，重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有明显的抗虫活性，属于农业生物技术领域。根据本发明的沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因，可以从双齿围沙蚕的cDNA文库中克隆半胱氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因，通过基因重组技术可将半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因导入植物以培育抗虫植物，也可以在其它细胞中表达该基因生产具有抗虫活性的重组沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂，重组蛋白可作为新型的生物农药，防治农业虫害。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种编码双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因及其氨基酸序列以及应用该基因生产的重组蛋白的抗虫活性，属于农业生物技术领域。

背景技术：

蛋白酶抑制剂是一类能够抑制蛋白酶水解活性的物质，广泛存在于动物、植物、微生物和人体内。它们通过与蛋白酶的活性部位和变构部位结合，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶。体内这类蛋白在调控蛋白的降解、免疫反应以及肿瘤转移等方面发挥着重要的作用。很多植物的蛋白酶抑制剂还通过抑制昆虫体内蛋白酶的活性，发挥防御功能。根据其作用底物及其性质的不同，蛋白酶抑制剂可分为丝氨酸蛋白酶抑制剂、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂，其中，丝氨酸蛋白酶抑制剂可抑制消化道内以丝氨酸蛋白酶为主要蛋白酶的昆虫的发育；而半胱氨酸蛋白酶抑制剂则对以半胱氨酸蛋白酶为主要消化酶的鞘翅目的昆虫的防治有价值。这两类蛋白酶抑制剂在抗虫谱上具有互补性。

目前编码多种生物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因已被克隆。白俊杰等(2002)报道了从中华鲟和史氏鲟中分别克隆了一个半胱氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因，其中中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因全长635bp，史氏鲟的基因全长序列为629bp，两个基因均编码由112个氨基酸组成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。Abrahamson等(1987)报道了人的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的基因序列，Colella等(1989)克隆了鸡蛋清中半胱氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因，并对该蛋白在不同组织中的分布进行了研究。Yamashita等(1996)从大麻哈鱼中克隆了半胱氨酸蛋白酶抑制的基因，并研究了在不同组织中的表达情况，探讨了其可能的生物学活性。徐安龙等在其专利(专利号：03126567.7)中公开了一种一种水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因及其表达与应用，该基因全长396bp，编码的蛋白酶抑制剂全长含有131个氨基酸残基，包括18氨基酸的信号肽和118个氨基酸的成熟蛋白，重组蛋白具有典型的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的活性，对木瓜蛋白酶具有明显的抑制作用。

双齿围沙蚕是我国海岸广泛分布的一种海洋环节动物，其中的一种小肽(沙蚕毒素)已成功地用作生物农药，但目前国内外尚未有沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂及其编码基因的研究报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种新的双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列与其编码蛋白的氨基酸序列，以及应用该基因制备的重组蛋白的抗虫活性。该技术对于通过转基因技术培育抗虫植物，或者通过在基因重组技术构建工程菌生产重组沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂，制备新型的生物农药方面有良好的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明构建了双齿围沙蚕的cDNA文库：首先提取了双齿围沙蚕的mRNA，反转录成cDNA后克隆到质粒pAP3neo上，转化E.coli DH10B构建了cDNA文库。

本发明通过对双齿围沙蚕的cDNA文库的序列进行测定，从中筛选到了半胱氨酸蛋白酶抑制剂的cDNA，该cDNA含有333bp的开放读框，编码110氨基酸组成蛋白。

本发明将双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆到表达载体pET-15b上，重组质粒转化E.coliBL21(DE3)构建了工程菌，IPTG诱导该基因的表达，表达的重组蛋白经Ni²⁺树脂亲和层析，获得了电泳纯的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

本发明获得的重组蛋白对属于半胱氨酸蛋白酶的木瓜蛋白酶有抑制作用，对属于鞘翅目的昆虫华北大黑鳃金龟有明显的抗虫活性，可制备具有抗虫活性的新型生物农药。

一种具有溶栓活性的双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列，该序列如下：

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一种具有溶栓活性的双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列，其编码的氨基酸序列如下：

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根据本发明的沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因，可以从双齿围沙蚕的cDNA文库中克隆半胱氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因，通过基因重组技术可将半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因导入植物以培育抗虫植物，也可以在其它细胞中表达该基因生产具有抗虫活性的重组沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂，重组蛋白可作为新型的生物农药，防治农业虫害。

附图说明：

图1为表达质粒pET-15bI的酶切鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂的纯化的SDS-PAGE分析图。

图3为重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制作用活性分析图。

图4为重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抗虫活性测定图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：双齿围沙蚕cDNA文库的构建与编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆

1、以2g双齿围沙蚕活体组织为材料，使用RNAiso Reagent(TaKaRa Code No.D312)提取总RNA。

2、使用Oligotex-dT30mRNA纯化试剂盒(TaKaRa Code No.9086)提取mRNA。

3、以5μg mRNA为模板，使用TaKaRa cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库，具体包括以下步骤：

(1)利用反转录酶M-MLV和Oligo(dT)锚定引物合成cDNA的第一条链，合成时使用5-甲基dCTP；

(2)利用RNaseH、大肠杆菌DNA聚合酶以及DNA连接酶合成cDNA的第二条链；

(3)利用T4DNA聚合酶使双链cDNA末端平滑化；

(4)与含有NotI识别序列的接头连接，再用NotI进行酶切；

(5)使用DNA回收试剂盒(TaKaRa Code No.9092)去除短链cDNA；

(6)与质粒pAP3neo进行连接，得20μl连接产物；

(7)取2μl连接产物转化E.coli DH10B，构建cDNA文库，库容量为：7.8×10⁵；

(8)利用ABI DNA序列分析仪，对cDNA文库进行序列分析，从中筛选编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂的cDNA，共得到阳性克隆2个，两个序列相同。

结果如下：

一种具有溶栓活性的双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列，该序列如下：

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一种具有溶栓活性的双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列，其编码的氨基酸序列如下：

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实施例2：半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因在大肠杆菌中的表达与表达产物的纯化

1、根据获得的cDNA序列，设计一对引物，

引物1：5’ACATGACTACATATGGAGTCGGCAC 3’；引物2：5’ACCCTCGAGCTAATTATTATTA 3’以双齿围沙蚕蛋白酶的cDNA为模板，利用Taq DNA聚合酶扩增半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，扩增条件：94℃变性45sec，50℃退火45sec，72℃延伸45sec。得到330bp片段(图1中：1.pET-15bI/XbaI，XhoI；2.λDNA/EcoRI，HindIII)。

2、用NdeI和XhoI切割后克隆到表达载体pET-15b上，构建表达载体pET-15bI，将表达载体转化E.coliBL21(DE3)，构建工程菌。

3、挑取工程菌单菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，30℃振荡培养12h，转接到2L同样培养基中同样条件下继续培养4h，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至1.0mM，继续培养8h，8000×g离心收集菌体。

4、菌体重悬与100ml Tris-Cl缓冲液(20mM，pH8.0，5mM咪唑，0.5MNaCl)，超声波破碎细胞。

5、诱导表达的工程菌经超声波破碎细胞后的裂解液，4℃，15000×g离心30min，取上清液。

6、上清液流过Ni²⁺树脂柱(2.6×8cm)，用100ml洗涤液(20mM，pH8.0，50mM咪唑，0.5MNaCl)。

7、用洗脱缓冲液(20mM，pH8.0，500mM咪唑，0.5MNaCl)洗脱结合蛋白，得重组双齿围沙蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂，重组蛋白的分子量为14kDa。图2中：1.半胱氨酸蛋白酶抑制剂；2.中分子量标准蛋白(从下到上依次为14，25，45，67，94kDa)。

实施例3：重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制作用

将木瓜蛋白酶与不同摩尔比的重组蛋白在缓冲溶液中混合，25℃保温15min后测定木瓜蛋白酶的活性，所用的缓冲溶液为Tris-Cl缓冲溶液(50mM，pH7.0，2mM二硫苏糖醇，50mMNaCl)。测定时在4.5ml的Tris-Cl缓冲溶液(50mM，pH7.0，2mM二硫苏糖醇，50mMNaCl)加入50μl未处理或用重组蛋白处理的木瓜蛋白酶(0.1mg/ml)及100μl的L-BAPNA(半胱氨酸蛋白酶的显色底物，2.0mg/ml)，37℃保温10min后加入10％盐酸溶液350μl以终止反应，于405nm波长处测定吸光度值确定木瓜蛋白酶的相对活性。以木瓜蛋白酶的相对活性(％)为纵坐标，重组蛋白与木瓜蛋白酶的摩尔比为横坐标绘图，结果如图3所示，随着重组蛋白摩尔比的增加，木瓜蛋白酶的活性逐渐降低，当木瓜蛋白酶与重组蛋白的摩尔比为1∶2时，木瓜蛋白酶的活性仅剩6％。说明纯化的重组蛋白确实是半胱氨酸蛋白酶抑制剂。

实施例4：重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂的抗虫活性实验

灯诱采集华北大黑鳃金龟于饲养笼内，每组50只，25℃，避光饲养，以新鲜苹果叶饲喂。重组蛋白对磷酸缓冲溶液(20mM，pH7.0)透析，然后在饲料的表面喷施一定浓度的重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂，以喷施磷酸缓冲溶液(20mM，pH7.0)为对照，饲养3天，统计各组华北大黑鳃金龟的死亡率。以死亡率(％)为纵坐标，重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂(mg/ml)为横坐标绘图，结果如图4所示，随着重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂浓度的提高，昆虫死亡率逐渐提高，施以2mg/ml重组蛋白的一组，死亡率达到90％。

序列表