采用基因cyp71av1和cpr共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法

摘要

本发明是一种基因工程技术领域的采用基因cyp71av1和cpr共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆紫穗槐二烯氧化酶CYP71AV1基因cyp71av1和细胞色素P450还原酶CPR基因cpr，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将cyp71av1和cpr基因同时导入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因cyp71av1和cpr的整合情况，高效液相色谱－蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的1.82倍。

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种基因工程技术领域的方法，特别是一种采用双关键酶基因cyp71av1和cpr共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法。

背景技术

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿属的一年生草本植物。青蒿素是从其地上部分分离的一种含有过氧桥结构的倍半萜内酯化合物，是目前世界上公认的最有效的治疗疟疾的药物，特别是对于脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。目前，世界卫生组织推荐的最有效的治疗疟疾的方法就是青蒿素联合疗法(ACTs)。另外，随着对青蒿素药理研究的逐步深入，科学家发现青蒿素及其衍生物还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能。可见青蒿素是一种极具潜力的天然药物。

目前青蒿素的主要来源是从青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低(0.01％-1％)，使得这种药物的大规模商业化生产受到了限制。由于青蒿素结构复杂，人工合成难度大，产量低，成本高，不具有可行性。有人尝试用组织培养和细胞工程的方法来生产青蒿素，然而青蒿素在愈伤组织中含量低于干重的0.1％，在芽中最高也只有干重的0.16％，而大多数研究在根中没有检测到青蒿素。因此利用组织培养及细胞工程来生产青蒿素的可行性也不高。

经对现有技术文献检索发现，Dahua Chen等在《Plant Science》(《植物科学》，2000年155期179-185页)发表了题为“Expression of a chimericfarnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L.transgenic plantsvia Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation”(“通过农杆菌介导转化在青蒿植株中表达法尼基焦磷酸合酶基因”)的论文，报道通过过量表达法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，FPS)，使转基因青蒿中青蒿素的含量提高了2-3倍，但仍然只有1％左右。不过，代谢工程为提高青蒿中青蒿素的含量提供了一条可行的方法。

现有技术中紫穗槐二烯氧化酶(amorpha-4，11-diene C-12 oxidase，CYP71AV1)是青蒿素合成途径中的一个关键酶，而细胞色素P450还原酶(cytochrome P450 reductase，CPR)是紫穗槐二烯氧化酶的氧化还原伴体。采用基因工程手段，用关键酶基因cyp71av1及其伴体cpr共转化青蒿，将打破青蒿素生物合成限速瓶颈，从而获得青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供一条新途径。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用基因cyp71av1和cpr共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、青蒿素提取及含量测定用于本发明，建立了提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。

本发明是通过以下技术方案实现的：本发明从青蒿中克隆cyp71av1和cpr基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将cyp71av1和cpr基因同时导入青蒿并再生出植株；PCR检测外源目的基因cyp71av1和cpr的整合情况，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定青蒿中青蒿素含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。

本发明包括如下具体步骤：

(1)采用基因克隆方法获得青蒿关键酶基因cyp71av1和cpr；

(2)把cyp71av1和cpr基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含cyp71av1和cpr基因的植物表达载体；

(3)将含cyp71av1和cpr基因的植物表达载体转化根癌农杆菌(为市场有公开出售的生物材料，可以从多家公司如澳大利亚CAMBIA公司购得)，获得用于转化青蒿的含cyp71av1和cpr基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株；

(4)利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株；

(5)对获得的转基因青蒿中青蒿素含量进行HPLC-ELSD测定，筛选获得青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株。

所述的经PCR检测的转基因青蒿植株是指，分别设计合成cyp71av1和cpr基因的检测引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性植株即为转基因青蒿植株。

所述的HPLC-ELSD测定青蒿中青蒿素含量，方法如下：色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5bar。

本发明的cyp71av1和cpr共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法，采用基因工程方法，将关键酶基因cyp71av1和cpr导入青蒿植株中，获得了青蒿素含量显著提高的转基因青蒿植株，共转cyp71av1和cpr基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到18.2mg/g DW，是非转化普通青蒿(10mg/g DW)的1.82倍，该发明对于为青蒿素规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

青蒿cyp71av1和cpr基因的克隆

1.青蒿基因组总RNA的提取

取少量青蒿(采用产于重庆酉阳青蒿素含量较高的青蒿品种)幼嫩叶片，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCOBRL，USA)的1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，于4℃、7,500g离心5min；室温干燥15-20min后溶于适量(30-50μL)RNAase-free水中；用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

2.青蒿cyp71av1和cpr基因的克隆

将所获的青蒿基因组总RNA通过反转录酶XL(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述青蒿cyp71av1基因的编码序列(序列表中的序列1)和cpr基因的编码序列(序列表中的序列2)，分别设计扩增出完整编码框的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后进行测序。DNA序列测定由上海英骏生物技术服务有限公司采用3730自动测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与GenBank中所报道的青蒿cyp71av1基因(序列表中的序列1)和cpr基因(序列表中的序列2)的编码序列一致。

本实施例采用基因克隆方法从青蒿中获得序列正确的青蒿素生物合成关键酶基因cyp71av1和cpr，为通过双关键酶基因共转化策略提高青蒿中青蒿素含量提供了两个重要关键酶基因。

实施例2

含cyp71av1和cpr基因的植物双元表达载体的构建

1.中间载体pMD18-T::p35S-gfp*gus-nos的构建

选用pMD18-T和pCAMBIA1304为基本元件，构建中间载体pMD18-T::p35S-gfp*gus-nos。具体地，根据pCAMBIA1304上p35S-gfp*gus-nos的序列设计一对引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点，以便构建表达载体。以pCAMBIA1304质粒为模版，PCR扩增gfp*gus融合基因表达盒，连接到pMD18-T载体，转化筛选，挑取单克隆测序确认无误。

2.中间载体pMD18-T::p35S-cyp71av1-nos和pMD18-T::p35S-cpr-nos的构建

以所述的pMD18-T::p35S-gfp*gus-nos为基础，用实施例1中cyp71av1和cpr基因分别替换其上的gfp*gus融合基因。具体地，SpeI/BstEII双酶切pMD18-T::cyp71av1，pMD18-T::cpr和pMD18-T::p35S-gfp*gus-nos，回收cyp71av1，cpr以及pMD18-T::p35S-gfp*gus-nos大片段，cyp71av1和cpr分别与大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

3.植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus的构建

以所述的pMD18-T::p35S-gfp*gus-nos为基础，将含有gfp*gus融合基因的表达盒置于植物双元表达载体pCAMBIA2300中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus。具体操作如下：用SmaI和PstI双酶切pCAMBIA2300，回收大片段，用SwaI和PstI双酶切pMD18-T::p35S-gfp*gus-nos，回收gfp*gus的表达盒。将gfp*gus表达盒与pCAMBIA2300大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

4.植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus-cyp71av1的构建

以所述的pMD18-T::p35S-cyp71av1-nos为基础，将含有cyp71av1基因的表达盒插入植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus-cyp71av1。具体操作如下：用SmaI和PstI双酶切pCAMBIA2300::gfp*gus，回收大片段，用SwaI和PstI双酶切pMD18-T::p35S-cyp71av1-nos，回收cyp71av1基因的表达盒。将cyp71av1基因的表达盒与pCAMBIA2300::gfp*gus大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

5.植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus-cyp71av1-cpr的构建

以所述的pMD18-T::p35S-cpr-nos为基础，将含有cpr基因的表达盒插入植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus-cyp71av1中，构建成植物双元表达载体pCAMBIA2300::gfp*gus-cyp71ay1-cpr。具体操作如下：用SmaI和PstI双酶切pCAMBIA2300::gfp*gus-cyp71av1，回收大片段，用SwaI和PstI双酶切pMD18-T::p35S-cpr-nos，回收cpr基因的表达盒。将cpr基因的表达盒与pCAMBIA2300::gfp*gus-cyp71av1大片段连接，转化大肠杆菌，挑取单克隆，提取质粒做PCR检测和酶切验证。

本实施例将青蒿素生物合成途径关键酶基因cyp71av1和cpr可操作性地连接于表达调控序列，形成含cyp71av1和cpr基因的植物表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高青蒿中青蒿素的含量。

实施例3

根癌农杆菌介导cyp71av1和cpr基因遗传转化青蒿获得转基因青蒿植株

1.含cyp71av1和cpr基因双元植物表达载体根癌农杆菌工程菌的获得

将实施例2中含cyp71av1和cpr基因的植物双元表达载体转入根癌农杆菌(如EHA105，为市场有公开出售的生物材料，可以从澳大利亚CAMBIA公司购得，菌株编号为Gambar1)，并进行PCR验证。结果表明，含cyp71av1和cpr基因植物双元表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株。

2.根癌农杆菌介导cyp71av1和cpr基因转化青蒿

2.1.外植体的预培养

青蒿种子用75％乙醇浸泡1min，再用20％NaClO浸泡20min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、16h/8h(light/dark)光照培养，即可获得青蒿无菌苗。待苗长至5cm左右后，剪取无菌苗叶片外植体用于转化。

2.2.农杆菌与外植体的共培养

将所述的叶片外植体，转到共培养培养基(1/2 MS+AS 100μmol/L)中，滴加含活化好的所述含cyp71av1和cpr基因植物双元表达载体的根癌农杆菌工程菌的1/2MS悬液，使外植体与菌液充分接触，28℃暗培养3d。以滴加在不带有目的基因的根癌农杆菌的1/2MS液体培养基悬液的叶片外植体为对照。

2.3.抗性再生植株的筛选

将所述的共培养3d的青蒿外植体转入到发芽筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于25℃、16h/8h光照培养，每两周继代培养一次，经过2-3次继代后即可获得Kan抗性丛生芽。将生长良好的抗性丛生芽剪下转入生根培养基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培养至生根，从而获得Kan抗性再生青蒿植株。

3.转基因青蒿植株的PCR检测

根据CaMV 35S的序列设计正向引物，根据cyp71av1和cpr基因的序列分别设计反向引物对目的基因进行检测。结果表明，用CaMV 35S正向引物和cyp71av1反向引物以及CaMV 35S正向引物和cpr反向引物能分别扩增出580bp和2584bp的特异DNA片段。而以非转化青蒿基因组DNA为模板时，没有扩增出任何片段。

本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化青蒿的含cyp71av1和cpr基因植物表达载体的根癌农杆菌菌株，利用所构建的根癌农杆菌菌株转化青蒿，获得经PCR检测的转基因青蒿植株。

实施例4

利用HPLC-ELSD测定转基因青蒿中青蒿素含量

1.HPLC-ELSD条件及系统适用性以及标准溶液的配制

HPLC：采用water alliance 2695系统，色谱柱为C-18反相硅胶柱(SymmetryShieldTM C18，5μm，250×4.6mm，Waters)，流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度(AUFS＝1.0)，理论塔板数按青蒿素峰计算不低于2000。

ELSD：采用water alliance 2420系统，蒸发光散射检测器漂移管温度40℃，放大系数(gain)为7，载气压力5 bar；

精密称取青蒿素标准品(Sigma公司)2.0mg用1mL甲醇完全溶解，得到2mg/mL青蒿素标准品溶液，保存于-20℃备用。

本发明中流动相为甲醇∶水，甲醇∶水的体积比为70∶30时，青蒿素的保留时间为5.1min，峰型良好。理论塔板数按青蒿素计算不低于2000。

2.标准曲线的制作

将所述对照品溶液在相应色谱条件下分别进样2μL，4μL，6μL，8μL，10μL记录图谱及色谱参数，分别以峰面积(Y)对标准品含量(X，μg)进行回归分析。通过研究，本发明中青蒿素在4-20μg范围内呈现良好的log-log线性关系。青蒿素对照品的log-log线性回归方程为：Y＝1.28e+000X+4.71e+000，R＝0.979546。

3.样品的制备和青蒿素含量的测定

青蒿素的提取过程基于Van Nieuwerburgh et al.(2006)中报道的方法：取少量新鲜的青蒿叶片(1-2g鲜重)，于50ml试管中将其浸没在10ml氯仿中摇荡1分钟，将浸出液倒入新的试管中使氯仿挥发完全，取3ml无水乙醇充分溶解提取物，用于HPLC检测。同时，氯仿提取后的叶片收集放入60度烘箱进行烘干，称重(计算青蒿叶片的干重)；

采用HPLC-ELSD测定青蒿素含量，样品进样体积为20μL，根据峰面积代入线形回归方程计算出样品中的青蒿素含量(mg)，再除以样品的青蒿叶干重(g)，从而计算出青蒿植株中青蒿素的含量。

在本发明中共转cyp71av1和cpr基因显著提高了青蒿中青蒿素含量。共转cyp71av1和cpr基因青蒿中青蒿素的含量最高可达到18.2mg/g DW，是非转化普通青蒿(10mg/g DW)的1.82倍。

本实施例采用HPLC-ELSD法测定了转基因青蒿中青蒿素含量，采用共转化cyp71av1和cpr基因的代谢工程策略获得了青蒿素高产的青蒿植株，为规模化生产青蒿素提供了一种理想方法。

本发明涉及的序列表：

<110>上海交通大学

<120>采用基因cyp71av1和cpr共转化提高青蒿中青蒿素含量的方法

<160>2

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1488

<212>DNA

<213>青蒿(Artemisia annua)

<400>1

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<210>2

<211>2115

<212>DNA

<213>青蒿(Artemisia annua)

<400>2

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