1,3－丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala及其用途

摘要

1，3－丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala及其用途，利用易错PCR技术介导的随机突变，筛选获得1，3－丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因，该基因中编码第202位的谷氨酰胺的密码子CAG突变为丙氨酸的密码子GCG，得到1，3－丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala。该变体基因核苷酸序列为SEQID No.1，可编码1，3－丙二醇氧化还原酶同工变体酶。将该变体基因Gln202Ala通过基因工程技术重组表达1，3－丙二醇氧化还原酶同工变体酶，用于催化3－羟基丙醛生成1，3－丙二醇，在测定的一例中活性提高了1.5－2倍，为生物转化生产化工原料1，3－丙二醇提供了广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工中的基因工程菌生产1，3-丙二醇化工原料的技术领域，具体涉及1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala及其用途。

背景技术

1，3-丙二醇是重要的溶剂和化工原料，以其作为单体可用来合成性能优良的聚酯、聚氨酯等缩聚物。近来，由于以1，3-丙二醇和对苯二甲酸为单体合成的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)具有非常独特的性质，所以受到国外许多研究机构的重视。目前，化学法合成1，3-丙二醇专利由荷兰壳牌(Shell)化学公司和德国Degussa拥有。而生物转化合成1，3-丙二醇专利则由美国杜邦(DuPont)公司和德国国家生物技术中心获得。如1999年杜邦公司与世界第二大工业酶生产商Genencor公司联合申请了以葡萄糖为底物用基因工程菌直接生产1，3-丙二醇的专利。生物转化法具有耗能低，可利用可再生资源、清洁生产、成本低等优点，但由于在微生物代谢途径中与合成1，3-丙二醇相关的酶的催化效率低下，迄今为止，生物合成1，3-丙二醇的产量仍无法与化学合成法的产量相比。在生物转化甘油合成1，3-丙二醇的代谢途径中，需要甘油脱水酶和1，3-丙二醇氧化还原酶，其中甘油脱水酶负责将甘油转化成中间产物3-羟基丙醛，而1，3-丙二醇氧化还原酶则负责将3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。由于1，3-丙二醇氧化还原酶在催化过程中催化活性很差，严重制约了生物转化合成1，3-丙二醇的大规模生产。最近发现在大肠杆菌K12体内存在一个1，3-丙二醇氧化还原酶的同工酶(其对应基因为yqhD)，是甘油代谢途径中可代替1，3-丙二醇氧化还原酶催化中间产物3-羟基丙醛生成1，3-丙二醇另一关键酶，由其代替1，3-丙二醇氧化还原酶的催化效率明显高于1，3-丙二醇氧化还原酶的催化效率。但目前1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的催化能力还不够高，大规模产业化生物合成1，3-丙二醇还有一定困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala及其用途，克服现有1，3-丙二醇氧化还原酶在催化过程中催化活性差，严重制约了生物转化合成1，3-丙二醇大规模生产的缺点。

1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala及其用途，其特征在于：利用易错PCR技术介导的随机突变，通过一定的筛选获得1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因，该1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶基因中编码第202位的谷氨酰胺的密码子CAG突变为丙氨酸的密码子GCG，得到1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala.该变体基因核苷酸序列为SEQID No.1，可编码1，3-丙二醇氧化还原酶同工变体酶。

所述的1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala通过基因工程技术重组表达1，3-丙二醇氧化还原酶同工变体酶，可用于催化3-羟基丙醛生成1，3-丙二醇。

本发明采用易错PCR定向进化技术进化1，3-丙二醇还原酶同工酶，根据1，3-丙二醇还原酶同工酶的基因设计一对引物，通过降低传统PCR中一种或者两种dATP dGTP dCTP dTTP的浓度并且加入一定量的MnCl₂，同时采用低保真度的TaqDNA聚合酶，使基因在扩增时在一定程度上随机错误引入获得突变基因文库，并通过一定的筛选方法获得一种变体基因，按此设计思想，以pET28α(+)yqhD作为模板DNA，采用易错PCR定向进化技术获得易错PCR扩增产物，经NheI-BamHI双酶切易错PCR扩增产物后，提取大小约为1164bp的基因产物并与同样的酶双酶切后的大小大约为5300bp的线性质粒pET28α进行连接反应，连接完毕后将连接产物转化E.Coli Novablue中，涂布到到含有40μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。从突变体库中挑取克隆接种到300μL含有40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取40μL该过夜培养液加入到一个新的800μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的1.2mL容积的96微孔板中，在37℃培养至OD₆₀₀为0.5～0.7时，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导并在30℃继续培养28h，4000r/min离心半个小时收获细胞，用300μL的pH7.5磷酸盐裂解缓冲液重悬细胞，在37℃培育30min后，立即置于-80℃冷冻30min，室温解冻，4000r/min离心30min，吸取300μL上清液到一个新的96微孔分析板中，加入2μL200mmol/L 3-羟基丙醛底物(3-羟基丙醛溶解在DMSO中)，在室温下培育10min，然后加20μL 2mg/mL的NADPH启动反应，在340nm处在线监控吸收值的变化5min，筛选出酶活力高于原酶的菌株并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为Gln202Ala。

本发明的优点是创造了一种对3-羟基丙醛具有更高催化活力的1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因，其突变位点为Gln202Ala，与1，3-丙二醇还原酶同工酶基因相比较，在测定的一例中活性提高了1.5-2倍。该变体基因的获得为生物合成化工原料1，3-丙二醇的生物生产提供了广阔的应用前景。

具体实施方式

下面是本发明的实施例：

1.易错PCR引物的设计和PCR扩增产物的获得：

根据1，3-丙二醇还原酶同工酶的基因设计的，为了方便以后的操作，在引物的5′端分别引入BamHI和NheI位点。

向500μl的eppendorf管中加入100pmol的dNTPs，上游引物，下游引物各20pmol，大约1ng pET28α(+)yqhD作为模板DNA，以及最终浓度为0.05mM MnCl₂，2.5uTaqDNA聚合酶，5μl的PCR缓冲液，12.5μl 25mM的MgCl₂，然后加无菌的蒸馏水至总体积50μl。反应参数是通过95℃变性5分钟后，在95℃ 1min，54℃ 2min，72℃ 1min，经过35个循环，然后72℃延伸2min，得到PCR扩增产物。

2.突变文库的构建：

易错PCR扩增产物经NheI-BamHI双酶切后提取大小约为1164bp的基因产物，并与同样的酶双酶切后的大小约为5300bp的线性质粒pET28α(+)进行连接反应，连接完毕后将连接产物转化E.Coli Novablue中，涂布到到含有40μg/ml卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到相应的突变体库。

酶切时质粒pET28α(+)和质粒pET28α(+)yqhD以及限制酶的用量比：

质粒pET28α(+)yqhD/质粒pET28α(+)    5μl

NheI(10u/μl)                        1μl

BamHI(10u/μl)                       1μl

Buffer(10X)                          5μl

无菌水                               8μl

                                                                

总体积                               20μl

质粒pET28α(+)-yqhD连接时连接酶和质粒的配比：

质粒DNA pET28α(+)片断    2μl

基因yqhD片断              4μl

T4DNA连接酶               1μl

T4DNA连接酶Buffer(10X)    2μl

无菌水                    11μl

                                               

总体积                    20μl

3.一种对3-羟基丙醛具有高催化活性的变体基因的筛选

从突变体库中挑取克隆接种到300μL含有40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的96微孔板中，37℃过夜培养，取40μL该过夜培养液加入到一个新的800μL含有30μg/mL卡那霉素的LB液体培养基的1.2mL容积的96微孔板中，在37℃培养至OD₆₀₀为0.5～0.7时，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)诱导并在30℃继续培养28h，4000r/min离心半个小时收获细胞，用300μL的pH7.5磷酸盐裂解缓冲液重悬细胞，在37℃培育30min后，立即置于-80℃冷冻30min，室温解冻，4000r/min离心30min，吸取300μL的含有1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶的上清液到一个新的96微孔分析板中，加入2μL200 mmol/L 3-羟基丙醛底物(3-羟基丙醛溶解在DMSO中)，在室温下培育10min，然后加20μL 2mg/mL的NADPH启动反应，在340nm处在线监控吸收值的变化5min，筛选出酶活力高于原酶的菌株并提取质粒进行全自动DNA测序，发现突变位点为Gln202Ala。

通过酶动力学曲线的测定，与1，3-丙二醇还原酶同工酶基因相比较，在测定的一例中活性提高了1.5-2倍。

4.重组大肠杆菌发酵生产1，3-丙二醇

a)挑取含有该1，3-丙二醇还原酶同工酶变体基因Gln202Ala的阳性克隆接入到含有30μg/ml卡那霉素的种子培养基中，180r/min，37℃摇床过夜培养12h。将种子液按2％(v/v)的接种量接入到含有40μg/mL卡那霉素的发酵培养基中，180r/min，37℃摇床培养至菌体OD₆₀₀约为0.7-0.9，加IPTG至终浓度0.4mmol/L，并添加25g/L浓度底物3-羟基丙醛，于25℃，120r/min发酵培养培养10小时。

b)收集发酵液，在3000-5000r/min离心15-30分钟，收集上清液.加入等体积的有机溶剂氯仿，提取1，3-丙二醇，然后用旋转增发浓缩提取液用于气相色谱分析。

c)1，3-丙二醇产量采用气相色谱法测定。气相色谱条件为：FID检测器，2m×Φ3m不锈钢填充柱，填料为国产高分子微球GDX2401(110目)，载气为N₂，进样口温度250℃，柱温220℃，检测器温度250℃。使用外标法定量发酵液中产物，进样量为2μl。实验结果显示，当添加底物3-羟基丙醛的初始浓度为25g/L时，用含有1，3-丙二醇还原酶同工酶变体基因Gln202Ala重组大肠杆菌进行发酵生产1，3-丙二醇，1，3-丙二醇产量可达到15.7 g/L，证明了用含有该1，3-丙二醇还原酶同工酶变体基因Gln202Ala重组大肠杆菌的确能高效表达1，3-丙二醇氧化还原酶同工变体酶，并用来发酵生产1，3-丙二醇。

SEQUENCE LISTING

<110>上海理工大学

<120>1，3-丙二醇氧化还原酶同工酶变体基因Gln202Ala及其用途

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1164

<212>DNA

<213>大肠杆菌K12

<220>

<223>编码第202位的谷氨酰胺的密码子CAG突变为丙氨酸的密码子GCG

<400>1

1   atgaacaact ttaatctgca caccccaacc cgcattctgt ttggtaaagg cgcaatcgct

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