牛分枝杆菌Mce4E蛋白、其制备方法及应用

摘要

本发明提供了牛分枝杆菌Mce4E蛋白，其具有序列表SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，或者该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供了制备Mce4E的方法，包括构建基因工程菌、体外诱导表达、分离纯化以及复性等步骤。本发明还进一步提供了一种用于体外制备Mce4E的基因工程菌PET30/Mce4E CGMCC No.1865。本发明的Mce4E蛋白与牛分枝杆菌阳性血清能发生特异性血清学反应，从而进一步可以利用Mce4E蛋白作为抗原来开发检测试剂盒；并且利用本发明的制备方法，Mce4E蛋白的产量可达20mg/L培养基。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及牛分枝杆菌Mce4E蛋白、其体外制备方法及应用。

背景技术

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种慢性、消耗性人兽共患传染病。目前全国有活动性肺结核患者约450万人，每年新发活动性肺结核患者约145万人，每年约有13万人死于结核病，其中15％左右的人是感染牛分枝杆菌引起的。我国牛结核病的发病率呈现上升趋势，一些省区已达到10％的阳性率；目前发现很多野生动物(如獾、水牛、狮子、羚羊、白尾鹿等)都能感染牛分枝杆菌，这对控制和根除牛结核构成严重的威胁。

当前，我国对牛结核的控制措施主要是淘汰结核阳性牛，因此，对牛结核进行准确的诊断就显得尤为重要。传统的单一结核菌素试验的敏感性和特异性比较低，在临床上会造成误诊，从而会直接危害人类生命健康，同时给生产带来经济损失，并且这种方法费时、费力、而且不易操作。

分枝杆菌哺乳动物细胞侵入蛋白(Mammalian cell-entryproteins，Mce)家族蛋白质能使分枝杆菌侵入哺乳动物细胞，主要与分枝杆菌进入宿主细胞和在其内部存活有关。分枝杆菌中有4个mce操纵子(mce1、mce2、mce3、mce4)，每个操纵子编码6个蛋白，在牛分枝杆菌中没有mce3操纵子。结核分枝杆菌mce1 A蛋白能够使无致病性的大肠杆菌进入非吞噬细胞，用该蛋白包被的微磁珠能够进入非吞噬性的HeLa细胞，并使HeLa细胞的细胞膜骨架发生重排。Ahmad等研究表明，重组的Mce3E蛋白能够与93％的结核病人血清发生反应，可以用来诊断自然感染结核病病人。

目前，国内外尚未见到有关牛分枝杆菌Mce4E蛋白的研究及应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供牛分枝杆菌Mce4E蛋白；

本发明的另一个目的在于提供牛分枝杆菌Mce4E蛋白体外制备的方法；

本发明的再一个目的在于提供用于制备Mce4E的基因工程菌。

本发明所述的Mce4E蛋白具有序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或者是该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该蛋白的分子大小为45KDa，等电点为4.65，在第345个氨基酸处具有一个糖基化位点，通过圆二色谱(CD谱)测定表明其为典型的α螺旋型结构，经Yang-Chen氏公式计算，α螺旋含量为39.1％，β-折叠含量为0％，无规卷曲含量为60.9％，转角含量为0％。

本发明利用mce4E(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示)基因构建表达载体，转化宿主菌，经过筛选得到转化子PET30/Mce4E；转化体经发酵培养后，破碎菌体，分离纯化Mce4E，经复性，得到活性蛋白Mce4E。

具体地说本发明包括如下步骤：

1、基因工程菌的构建

根据mce4E基因(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，该序列即是成熟蛋白的编码区段)设计合成扩增其成熟蛋白的PCR引物(末端分别带有Sac I和Kpn I的酶切位点)，以牛分枝杆菌染色体DNA为模板，进行PCR扩增；扩增产物经琼脂糖电泳，回收1000bp左右DNA片段，与pGEM-T easy载体连接，转化DH5α感受态细胞；纯化重组质粒，用EcoR I酶切鉴定，并测序，测序正确的阳性质粒经SacI/Kpn I双酶切后，与用经过Sac I/Kpn I双酶切的pET 30a(+)连接后，转化到BL21(DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR，筛选阳性克隆，得到含有表达载体的宿主菌(转化子)。

2、重组蛋白的表达及纯化

将含有表达载体的宿主菌接种到LB液体培养基，经扩大培养，加入IPTG诱导表达，取出菌液离心，菌体用裂解缓冲液重悬，在冰浴条件下超声破碎，离心，沉淀即为包涵体，可以将上清和沉淀用SDS-PAGE电泳检测其分离是否成功。将获得的包涵体蛋白用低浓度变性剂和/或温和去垢剂TritonX-100洗涤，然后用变性缓冲液溶解，离心，取上清，将上清加入经pH7.8的8mol/L变性缓冲液平衡的Ni-NTA琼脂糖柱，4℃条件下，结合30min，然后依次用10～20倍柱床体积的pH7.8～5.0梯度缓冲液由大到小洗涤Ni-NTA柱，洗去杂蛋白，最后用pH4.0洗脱缓冲液洗脱含有His-tag的重组蛋白，分管收集，洗脱流速控制在5～7mL/h。

3、复性

常用的复性方法有透析复性、稀释复性和超滤复性。本发明采用透析复性，具体操作是，将洗脱的蛋白放入透析袋，依次用含有0～8mol/L浓度梯度的尿素的基础缓冲液(50mmol/L Tris HCl，1mmol/L EDTA，1mmol/L GSSG，5mmol/L GSH，10％甘油，10mmol/L PMSF)按浓度梯度由大到小，进行透析复性，每个浓度在4℃透析4～8h，最后在pH7.4的PBS缓冲液中透析过夜。这个缓冲液可以减缓蛋白折叠的速度，从而提高蛋白的复性率，是蛋白在复兴的过程中沉淀减少。

本发明还提供了一种可高效表达Mce4E的基因工程菌Esherichia coli PET30/Mce4E(其已于2006年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.1865)。该菌具有kana抗性，对人体无害，且在IPTG的诱导下，能够大量表达Mce4E蛋白。

本发明还将获得的Mce4E蛋白按《分子克隆》所述方法进行Western-blotting。一抗为兔抗牛分枝杆菌阳性血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的抗体，显色剂为3，3-二氨基联苯胺(DAB)。结果显示Mce4E能与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性血清学反应。

进而本发明开发了以牛分枝杆菌Mce4E蛋白作为抗原的诊断试剂盒。所述试剂盒包括包被抗原的酶标板；酶标记物；洗涤液；底物液；终止液以及标准阳性血清和阴性血清。

其中，所述的酶标记物可以为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛抗体；

其中，所述洗涤液可以是含0.05％(v/v)Tween-20的0.05mol/L的PBS缓冲液；

其中所述底物液分为A液和B液，A为底物缓冲液其配方为：每10ml含0.05mol/L柠檬酸4.86mL、0.1mol/L磷酸氢二钠5.14mL，pH5.0；B液的配方为：每毫升含10mg TMB的二甲基甲酞胺溶液(冷藏)。用时取B溶液75μl，加10mL底物缓冲液和10μl H₂O₂。

其中所述终止液可以是：2mol/L硫酸。

本发明进一步克隆了牛结核分枝杆菌RpfC基因，构建表达载体并得到了牛结核分枝杆菌Rpfc蛋白。进而，本发明将牛分枝杆菌Mce4E蛋白以及Rpfc蛋白和MPB83蛋白(李晶晶，赵德明，徐广贤，周向梅，尹晓敏.牛分枝杆菌MPB83基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达[J].中国农业大学学报，2006，(06)2.郝俊峰，赵德明.牛结核分支杆菌MB1916c基因的克隆和原核表达[J].中国农业大学学报，2006，(06))共同作为包被抗原，用于构建诊断牛分枝杆菌引起的病症。

本发明应用基因工程技术，首次在体外表达并获得了具有活性的牛分枝杆菌Mce4E蛋白，并且建立了纯化、复性的方法；利用本发明的方法，Mce4E蛋白的表达量可达20mg/L培养基。

本发明揭示了牛分枝杆菌Mce4E蛋白能够与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性血清学反应，进而应用牛分枝杆菌Mce4E蛋白作为抗原开发了牛结核病的诊断试剂盒。本发明进一步将Mce4E与Rpfc和MPB83蛋白共同作为包被抗原，实验表明，用三种抗原包被，比用单个抗原包被的特异性和敏感性要高，大大提高了检测的特异性与敏感性。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性强，操作简单，使用方便，检测快速，重复性好，为牛结核病的诊断提供了有力的手段。

附图说明

图1是mce4E的PCR扩增产物的电泳图，M为Mark，1和2为扩增产物；

图2是pGEM-T easy-mce4E重组载体的EcoR I酶切电泳图，M为Mark，1～3为重组载体；

图3是pET 30a-mce4E重组载体的Sac I/Kpn I双酶切电泳图，M为Mark，1为重组载体；

图4是转化子经IPTG诱导pET 30a-mce4E蛋白表达的电泳图，1为空载体对照，M为蛋白Mark，2～6为0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L浓度的IPTG诱导表达；

图5是纯化后的Mce4E电泳图，其中M为蛋白Mark，1～6为不同的收集管；

图6是Mce4E蛋白经Western blotting显影后的图，其中M为蛋白Mark，1～3为表达蛋白，4为空载体对照。

图7是纯化后Rpfc的电泳图，其中M为蛋白Mark，1～6为不同的收集管；

图8是Rpfc蛋白经Western blotting显影后的图，其中M为蛋白Mark，1、2为表达蛋白。

图9是阴性血清S/P值分布图。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1基因工程菌的构建

根据GeneBank中H37Rv株和Mycobacterium bovis AF2122/97株(NO：NC_002945，NC_000962)的mce4E基因序列设计合成一对扩增该成熟蛋白基因的PCR引物(由上海生工生物公司合成)。mce4E-S：5′-ATATGGTACCGCAGTGCTGACTTATCTTTCGT-3′(下划线处为Kpn I酶切位点)。mce4E-AS：5′-TTAAGAGCTCTCAGAAGTCGTCCCGTTCCGCG-3(横线为Sac I酶切位点)。采用CTAB方法提取牛分枝杆菌基因组DNA。以牛分枝杆菌染色体DNA为模板，以mce4E-S、mce4E-AS为引物，参照TaKaRa Ex Taq PCR试剂盒说明书对mce4E成熟蛋白基因进行PCR扩增。PCR反应总体积为50μL，模板DNA添加量为5μg。PCR程序：98℃热变性8min，加入Ex Taq酶；再94℃热变性1min、然后62℃退火1min、72℃延伸1.5min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物全长1098bp，编码365个氨基酸，在氨基酸序列345处含有一个糖基化位点。

反应产物经1％琼脂糖电泳(图1)，用EZ-10 Spin Colunm DNA GelExtraction试剂盒回收1000bp左右DNA片段后，与pGEM-T easy载体连接，转化DH5α感受态细胞；再用Plasmid Rapid Isolation试剂盒(博大泰克公司)纯化重组质粒，用EcoR I酶切鉴定(图2)，并测序，测序正确的阳性质粒经Sac I/Kpn I双酶切后，与用经过Sac I/Kpn I双酶切的pET 30a(+)连接过夜，转化到BL21(DE3)菌株，用上述PCR引物做菌落PCR，快速筛选克隆，所得克隆再经Sac I/Kpn I双酶切(图3)及DNA测序鉴定。经上述筛选获得Esherichia coli PET30/Mce4E。

实施例2重组蛋白的表达及纯化

将含有表达载体的宿主菌接种到LB液体培养基，待菌生长到A₆₀₀约0.8时，加终浓度为0.2mmol/L IPTG，26℃诱导6h后，取出菌液离心，菌体用裂解缓冲液(50mmol/L Tris HCl，0.5mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，5％甘油，pH＝8.0)重悬，在冰浴条件下超声破碎，8000-10000rpm/min，离心10min，沉淀即为包涵体，上清和沉淀用SDS-PAGE电泳检测(图4)。结果在预期的45ku处出现特异的、大量表达的蛋白条带，表达量占菌体总蛋白53.3％。

将获得的包涵体蛋白依次用洗涤液I(含10mmol/L Tris HCl，0.2mol/L尿素，0.5％Triton X-100，10mmol/L EDTA，pH8.0)和洗涤液II(10mmol/L Tris HCl，0.5％Triton X-100，10mmol/L EDTA，pH8.0)洗涤。然后用变性缓冲液(8mol/L尿素，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris HCl，pH7.8)溶解，离心，取上清，将上清加入经pH7.8的8mol/L变性缓冲液平衡的Ni-NTA琼脂糖柱，4℃条件下，结合30min，然后依次用10～20倍柱床体积的pH7.8、pH6.0、pH5.3缓冲液洗涤Ni-NTA柱，洗去杂蛋白，最后用pH4.0洗脱缓冲液洗脱含有His-tag的重组蛋白，分管收集，洗脱流速控制在5～7mL/h，得到纯化的Mce4E蛋白。如图5所示，纯化的蛋白在45ku处出现单一的条带，纯化率在95％以上。N末端氨基酸序列分析表明所得的蛋白质确实为Mce4E。Mce4E蛋白的产量可达10-20mg/L培养基。

实施例3蛋白质的透析复性

将洗脱的蛋白放入透析袋依次在加有8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L尿素的基础缓冲液(50mmol/L Tris HCl，1mmol/LEDTA，1mmol/L GSSG，5mmol/L GSH，10％甘油，10mmol/L PMSF)中进行透析复性，每个浓度在4℃透析4～8h，最后在pH7.4的PBS缓冲液中透析过夜。复兴结束后，在4℃，10000rpm/min离心10min，弃去沉淀，上清即为复兴好的蛋白。

实施例4 Western-blotting鉴定

Western-blotting按《分子克隆》所述方法进行。一抗为兔抗牛分枝杆菌阳性血清，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的抗体，显色剂为3，3-二氨基联苯胺(DAB)。结果发现Mce4E能与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性血清学反应。如图6所示。具体操作步骤如下：

SDS-PAGE结束后，取出凝胶，在转移缓冲液中浸泡30min，将浸泡过的与胶同样大小的NC膜和滤纸，按纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-纤维垫的结构，装入转印夹。转印时凝胶侧接负极，NC膜侧接正极，电泳槽冰浴，200mA恒流转印1h。转印结束后，剪下分子量标准的膜条用氨基黑染色。其余部分置于封闭液中室温振摇封闭1h；取出NC膜置于用封闭液稀释好的兔抗牛分枝杆菌阳性血清内，室温振摇2h；TBS洗涤3次，每次5min；置于用封闭液稀释好的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔的抗体溶液中，室温振摇1h；TBS洗涤3次，每次5min；最后将NC膜浸入DAB溶液中显色，用蒸馏水冲洗终止反应。

实施例5牛分枝杆菌Rpfc蛋白的制备

Rpfc基因的序列如序列表SEQ ID No.3所示，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示。按照实施例1和2的方法，构建基因工程菌，诱导表达(28℃)，并分离纯化得到Rpfc蛋白。如图7所示，纯化的蛋白在28KDa处出现单一的条带。参照实施例4的方法，进行Western-blotting鉴定，结果发现Rpfc能与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性血清学反应(图8)，N端氨基酸序列分析表明，其确为Rpfc蛋白。(Rpfc基因序列是根据GeneBank发表的序列设计，登录号：NC_002945.)

实施例6试剂盒的组建

试剂盒的组成：

①包被抗原的酶标板；(抗原为牛分枝杆菌Mce4E蛋白以及Rpfc蛋白和MPB83蛋白，按照相同比例包被，包被浓度为25～30μg/mL)

②20×洗涤液一瓶(20mL)：PBS-T，含0.1％(v/v)Tween-20的0.1mol/L PBS

③酶标抗体一支；辣根过氧化物酶标记兔抗牛二抗。

④标准阳性、阴性血清各一只支；(标准阳性血清：牛结核变态反应阳性，涂片镜检或细菌分离培养呈阳性和分子生物学检测阳性；阴性血清：牛结核变态反应阴性，细菌学检查呈阴性和分子生物学检测阴性血清)(浓度为1∶200)

⑤TMB底物一支；

⑥底物A液和B液共两瓶；

⑦终止液一瓶(20mL)；(2mol/L硫酸)

实施例7试剂盒操作方法

待测样品经前处理后，用PBST定容备用。拆开真空包装袋并取出酶标板，在室温下平衡5分钟。将处理后的样品每孔加入100μl，做4个重复，37℃温育60min；倾出孔中的液体，用稀释好的洗涤液洗涤3次每次3min；加入按1∶5000稀释好的酶标二抗100μl，37℃温育60min；倾出孔中的液体，用稀释好的洗涤液洗涤3次每次3min，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；然后每孔加入100μl底物液，避光作用10min；加入50μl终止液终止反应。以酶联免疫检测仪，以波长490nm条件下测定OD值，每板同时设标准阴性，标准阳性及空白对照。

判定标准

50份牛结核病阴性血样中S/P值主要分布在0.056～0.125，占61％，以阴性血清S/P值为横坐标，分8组，以各组血清份数为纵坐标，得到无抗牛结核病血清S/P值分布图。(如图9)

根据统计学处理，样品平均值和标准差分别为X＝0.087，S＝0.038，得到置信区间上限X+3S＝0.201，我们把0.20作为牛结核病阴性血清的上限；X+2S＝0.163，我们把0.16定为可疑的界限。根据统计学原理，S/P≥X+3S时，可以在99.9％的水平上判定为阳性。因此，我们得出间接ELISA判定标准，即S/P＞0.2者判为阳性，S/P＜0.16者判为阴性；对介于0.2和0.16之间的血样重新检测。标准阳性阴性血清之差小于0.75时，试验无效。

S/P＝(样品OD值一阴性OD值)/(阳性OD值一阴性OD值)

实施例8特异性试验

1阻断试验

阳性牛血清经过牛分枝杆菌干粉吸收后，OD值下降至接近标准阴性牛血清的OD值，经过草分枝杆菌干粉吸收后，其OD值几乎没有变化。

2交叉试验

用患有牛副结核病的病牛血清做ELISA试验结果显示：患副结核病的病牛牛血清不呈现阳性反应。

3符合性试验

取已知牛结核血清ELISA阴性的牛血清50份，做牛血清ELISA试验，结果有2可疑，特异性为96.0％。

实施例9重复性试验

1、批内重复试验

5份血清在批内经8次重复性试验结果经统计学分析，其变异系数在2.1～5.6％，小于10％，说明同一样品在同一批试验中变异程度很小，具有较好的重复性。

表1批内重复试验

2批间重复试验

用同一批包被抗原对5份血清在6个日期重复性试验结果经统计学分析，其变异系数在2.4～6.9％之间，小于10％，说明同一样品在不同批次试验中变异程度很小，具有较好的重复性。

表2批间重复试验

实施例10稳定性及保存期试验

抗原包被板的保存期试验

将存放于4℃和-20℃冰箱的抗原包被板于15天、30天、60天、90天、150天取出按间接ELISA程序检测，从ELISA检测结果可见抗原包被板存放于-20℃直到180天时所测OD值与新制备的抗原包被板检测能力相同；而存放于4℃的抗原包被板到30天时与新制备的反应板所测OD值出现差异，以阴性血清OD值变化最为明显。因此，-20℃存放快诊板180天可作为反应板的保存环境和保存期。

ELISA洗液稳定性及保存试验

试验发现1×PEST于4℃贮存到20天时瓶底出现絮状沉淀，贮存于4℃的10×PBST到60天时出现沉淀，而20×PBST一直未见变化，稀释成工作浓度于150天的检测结果与新配制的PBST结果未见明显变化。因此确定20倍浓缩洗涤液于4℃作为其保存条件。

酶标抗体稳定性及保存试验

酶标抗体工作液于-20℃存放到120天时，较新配制的试剂在检测时标准阳性血清的OD值明显下降，标准阴性血清OD值变化不大。因此在试剂盒中我们将购买的酶标抗体仅作分装贮存于-20℃。

底物液稳定性和保存试验

底物第I组和第II组贮存液于4℃保存到14天时颜色变黄，不能用于试验。因此只将底物A，B液分两瓶贮存于4℃，试验时按比例加入H₂O₂和OPD配制底物。

阴性、阳性血清的稳定性试验

将牛结核阴、阳性牛血清分别冻融1次、2次、3次，根据本法做ELISA试验，结果显示：冻融对牛血清中抗体影响很小。

将牛结核阴、阳性牛血清分别加热至65℃持续30min、至74℃持续10min后，与未加热的阴阳性牛血清进行对照，经过比较前两者的阴、阳性OD值差异不显著。

实施例11不同包被抗原的敏感性及特异性比较

按照间接ELISA试剂盒操作程序，对50头份已知牛结核阳性血清，稀释200倍后进行检测。每份血清重复2孔，同时设置一个空白孔、两个阳性血清对照和两个阴性血清对照。

检测试剂盒分别是以含有Mce4、RpfC、MPB83、PPD和Mce4+RpfC+MPB83蛋白作为诊断抗原，研制的间接ELISA试剂盒。

实验操作步骤同前面，结果判定参照间接ELISA判定标准，即S/P＞0.2者判为阳性，S/P＜0.16者判为阴性；对介于0.2和0.16之间的血样重新检测。标准阳性阴性血清之差小于0.75时，试验无效。

S/P＝(样品OD值一阴性OD值)/(阳性OD值一阴性OD值)

表3不同包被原试剂盒的敏感性及特异性实验结果

如表3所示，结果表明，用Mce4E或Rpfc或MPB83蛋白作为包被抗原，试剂盒的敏感性和特异性都比较低，与传统的检测方法相比，这三个蛋白组合以后可以大大的增强检测的敏感性和特异性。

序列表

<110>中国农业大学

<120>牛分枝杆菌Mce4E蛋白、其制备方法及应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1098

<212>DNA

<213>牛分枝杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1095)

<400>1

ggc tgt cag ttt ggc ggg ctg aac tcg ctg ccg ctg cct ggc acc gcc    48

Gly Cys Gln Phe Gly Gly Leu Asn Ser Leu Pro Leu Pro Gly Thr Ala

1               5                   10                  15

ggg cac ggt gaa ggt gcc tac tcg gtc acc gtc gaa atg gct gat gtg    96

Gly His Gly Glu Gly Ala Tyr Ser Val Thr Val Glu Met Ala Asp Val

            20                  25                  30

gcg acg ttg ccg cag aac tca ccg gtc atg gtc gat gac gtc acc gtc    144

Ala Thr Leu Pro Gln Asn Ser Pro Val Met Val Asp Asp Val Thr Val

        35                  40                  45

ggc agc gtg gcc ggc att gtc gcg gtc caa cga ccc gac gga tcc ttt    192

Gly Ser Val Ala Gly Ile Val Ala Val Gln Arg Pro Asp Gly Ser Phe

    50                  55                  60

tat gcc gcc gtg aag ctg gac ctg gac aag aat gtg ttg ctg ccg gcc    240

Tyr Ala Ala Val Lys Leu Asp Leu Asp Lys Asn Val Leu Leu Pro Ala

65                  70                  75                  80

aac gcc gtg gcg aag gtc tcc cag acc tcg ctg ctg ggt tcg tta cat    288

Asn Ala Val Ala Lys Val Ser Gln Thr Ser Leu Leu Gly Ser Leu His

                85                  90                  95

gta gag ctg gcg cca ccg acg gac cgc ccg ccg acc ggg agg ttg gtt    336

Val Glu Leu Ala Pro Pro Thr Asp Arg Pro Pro Thr Gly Arg Leu Val

            100                 105                 110

gac ggc tcg aga atc acc gag gcc aac acc gac cga ttc ccc acc acc    384

Asp Gly Ser Arg Ile Thr Glu Ala Asn Thr Asp Arg Phe Pro Thr Thr

        115                 120                 125

gag gag gtt ttc tcg gcg ctg ggg gtg gtg gtc aac aag ggt aac gtc 432

Glu Glu Val Phe Ser Ala Leu Gly Val Val Val Asn Lys Gly Asn Val

    130                 135                 140

ggt gcg ttg gaa gag atc att gac gag acc cac cag gcg gtg gcg ggt    480

Gly Ala Leu Glu Glu Ile Ile Asp Glu Thr His Gln Ala Val Ala Gly

145                 150                 155                 160

cgg cag gcc cag ttc gtc aac ctg gtc ccc agg ctc gcg gag ttg acg    528

Arg Gln Ala Gln Phe Val Asn Leu Val Pro Arg Leu Ala Glu Leu Thr

                165                 170                 175

gcg ggc ctg aac cgg cag gtt cac gac atc atc gat gcg ttg gat ggg    576

Ala Gly Leu Asn Arg Gln Val His Asp Ile Ile Asp Ala Leu Asp Gly

            180                 185                 190

ctg aac cga gtc tcc gcg atc ctg gca cgt gac aag gac aac ctg ggc    624

Leu Asn Arg Val Ser Ala Ile Leu Ala Arg Asp Lys Asp Asn Leu Gly

        195                 200                 205

cga gca ctg gac acg ctg ccc gac gcg gtt cgc gtg ctc aac cag aac    672

Arg Ala Leu Asp Thr Leu Pro Asp Ala Val Arg Val Leu Asn Gln Asn

    210                 215                 220

cgg gac cac atc gtc gac gcg ttc gcc gcg ctc aaa agg ttg acg atg    720

Arg Asp His Ile Val Asp Ala Phe Ala Ala Leu Lys Arg Leu Thr Met

225                 230                 235                 240

gtc acg tcg cac gtg ctg gcc gag acc aag gtg gat ttc ggt gaa gac    768

Val Thr Ser His Val Leu Ala Glu Thr Lys Val Asp Phe Gly Glu Asp

                245                 250                 255

ctc aaa gac ctc tac tcg atc gtc aag gcc ctc aac gac gac cga aag    816

Leu Lys Asp Leu Tyr Ser Ile Val Lys Ala Leu Asn Asp Asp Arg Lys

            260                 265                 270

gat ttc gtc acc tcg ctg cag ctg ttg ctg acg ttc cca ttt ccc aac    864

Asp Phe Val Thr Ser Leu Gln Leu Leu Leu Thr Phe Pro Phe Pro Asn

        275                 280                 285

ttc ggt atc aag cag gcg gtg cgc ggc gac tat ctt aac gtg ttc acc    912

Phe Gly Ile Lys Gln Ala Val Arg Gly Asp Tyr Leu Asn Val Phe Thr

    290                 295                 300

acc ttc gac ctc acc ctg cgc cgg att ggt gag acg ttc ttc acc acg    960

Thr Phe Asp Leu Thr Leu Arg Arg Ile Gly Glu Thr Phe Phe Thr Thr

305                 310                 315                 320

gcg tac ttc gac ccg aac atg gcg cac atg gac gag atc ctc aac ccg    1008

Ala Tyr Phe Asp Pro Asn Met Ala His Met Asp Glu Ile Leu Asn Pro

                325                 330                 335

ccc gac ttc ctg att ggc gaa ctg gcc aac ctg tcc ggg caa gcg gcc    1056

Pro Asp Phe Leu Ile Gly Glu Leu Ala Asn Leu Ser Gly Gln Ala Ala

            340                 345                 350

gac cca ttt aag att cca ccc ggt acg gcg tcg gga cag tag            1098

Asp Pro Phe Lys Ile Pro Pro Gly Thr Ala Ser Gly Gln

        355                 360                 365

<210>2

<211>365

<212>PRT

<213>牛分枝杆菌

<400>2

Gly Cys Gln Phe Gly Gly Leu Asn Ser Leu Pro Leu Pro Gly Thr Ala

1               5                   10                  15

Gly His Gly Glu Gly Ala Tyr Ser Val Thr Val Glu Met Ala Asp Val

            20                  25                  30

Ala Thr Leu Pro Gln Asn Ser Pro Val Met Val Asp Asp Val Thr Val

        35                  40                  45

Gly Ser Val Ala Gly Ile Val Ala Val Gln Arg Pro Asp Gly Ser Phe

    50                  55                  60

Tyr Ala Ala Val Lys Leu Asp Leu Asp Lys Asn Val Leu Leu Pro Ala

65                  70                  75                  80

Asn Ala Val Ala Lys Val Ser Gln Thr Ser Leu Leu Gly Ser Leu His

                85                  90                  95

Val Glu Leu Ala Pro Pro Thr Asp Arg Pro Pro Thr Gly Arg Leu Val

            100                 105                 110

Asp Gly Ser Arg Ile Thr Glu Ala Asn Thr Asp Arg Phe Pro Thr Thr

        115                 120                 125

Glu Glu Val Phe Ser Ala Leu Gly Val Val Val Asn Lys Gly Asn Val

    130                 135                 140

Gly Ala Leu Glu Glu Ile Ile Asp Glu Thr His Gln Ala Val Ala Gly

145                 150                 155                 160

Arg Gln Ala Gln Phe Val Asn Leu Val Pro Arg Leu Ala Glu Leu Thr

                165                 170                 175

Ala Gly Leu Asn Arg Gln Val His Asp Ile Ile Asp Ala Leu Asp Gly

            180                 185                 190

Leu Asn Arg Val Ser Ala Ile Leu Ala Arg Asp Lys Asp Asn Leu Gly

        195                 200                 205

Arg Ala Leu Asp Thr Leu Pro Asp Ala Val Arg Val Leu Asn Gln Asn

    210                 215                 220

Arg Asp His Ile Val Asp Ala Phe Ala Ala Leu Lys Arg Leu Thr Met

225                 230                 235                 240

Val Thr Ser His Val Leu Ala Glu Thr Lys Val Asp Phe Gly Glu Asp

                245                 250                 255

Leu Lys Asp Leu Tyr Ser Ile Val Lys Ala Leu Asn Asp Asp Arg Lys

            260                 265                 270

Asp Phe Val Thr Ser Leu Gln Leu Leu Leu Thr Phe Pro Phe Pro Asn

        275                 280                 285

Phe Gly Ile Lys Gln Ala Val Arg Gly Asp Tyr Leu Asn Val Phe Thr

    290                 295                 300

Thr Phe Asp Leu Thr Leu Arg Arg Ile Gly Glu Thr Phe Phe Thr Thr

305                 310                 315                 320

Ala Tyr Phe Asp Pro Asn Met Ala His Met Asp Glu Ile Leu Asn Pro

                325                 330                 335

Pro Asp Phe Leu Ile Gly Glu Leu Ala Asn Leu Ser Gly Gln Ala Ala

            340                 345                 350

Asp Pro Phe Lys Ile Pro Pro Gly Thr Ala Ser Gly Gln

        355                 360                 365

<210>3

<211>531

<212>DNA

<213>牛分枝杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(528)

<400>3

gtg cat cct ttg ccg gcc gac cac ggc cgg tcg cgg tgc aat aga cac    48

Val His Pro Leu Pro Ala Asp His Gly Arg Ser Arg Cys Asn Arg His

1               5                   10                  15

ccg atc tca cca ctc tct cta atc ggt aac gct tcg gcc act tcc ggc    96

Pro Ile Ser Pro Leu Ser Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ala Thr Ser Gly

            20                  25                  30

gat atg tcg agc atg aca aga atc gcc aag ccg ctc atc aag tcc gcc    144

Asp Met Ser Ser Met Thr Arg Ile Ala Lys Pro Leu Ile Lys Ser Ala

        35                  40                  45

atg gcc gca gga ctc gtc acg gca tcc atg tcg ctc tcc acc gcc gtt    192

Met Ala Ala Gly Leu Val Thr Ala Ser Met Ser Leu Ser Thr Ala Val

    50                  55                  60

gcc cac gcc ggt ccc agc ccg aac tgg gac gcc gtc gcg cag tgc gaa    240

Ala His Ala Gly Pro Ser Pro Asn Trp Asp Ala Val Ala Gln Cys Glu

65                  70                  75                  80

tcc ggg ggc aac tgg gcg gcc aac acc gga aac ggc aaa tac ggc gga    288

Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Lys Tyr Gly Gly

                85                  90                  95

ctg cag ttc aag ccg gcc acc tgg gcc gca ttc ggc ggt gtc ggc aac    336

Leu Gln Phe Lys Pro Ala Thr Trp Ala Ala Phe Gly Gly Val Gly Asn

            100                 105                 110

cca gca gct gcc tct cgg gaa caa caa atc gca gtt gcc aat cgg gtt    384

Pro Ala Ala Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile Ala Val Ala Asn Arg Val

        115                 120                 125

ctc gcc gaa cag gga ttg gac gcg tgg ccg acg tgc ggc gcc gcc tct    432

Leu Ala Glu Gln Gly Leu Asp Ala Trp Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ser

    130                 135                 140

ggc ctt ccg atc gca ctg tgg tcg aaa ccc gcg cag ggc atc aag caa    480

Gly Leu Pro Ile Ala Leu Trp Ser Lys Pro Ala Gln Gly Ile Lys Gln

145                 150                 155                 160

atc atc aac gag atc att tgg gca ggc att cag gca agt att ccg cgc    528

Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Ala Gly Ile Gln Ala Ser Ile Pro Arg

                165                 170                 175

tga                                                                531

<210>4

<211>176

<212>PRT

<213>牛分枝杆菌

<400>4

Val His Pro Leu Pro Ala Asp His Gly Arg Ser Arg Cys Asn Arg His

1               5                   10                  15

Pro Ile Ser Pro Leu Ser Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ala Thr Ser Gly

            20                  25                  30

Asp Met Ser Ser Met Thr Arg Ile Ala Lys Pro Leu Ile Lys Ser Ala

        35                  40                  45

Met Ala Ala Gly Leu Val Thr Ala Ser Met Ser Leu Ser Thr Ala Val

    50                  55                  60

Ala His Ala Gly Pro Ser Pro Asn Trp Asp Ala Val Ala Gln Cys Glu

65                  70                  75                  80

Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Lys Tyr Gly Gly

                85                  90                  95

Leu Gln Phe Lys Pro Ala Thr Trp Ala Ala Phe Gly Gly Val Gly Asn

            100                 105                 110

Pro Ala Ala Ala Ser Arg Glu Gln Gln Ile Ala Val Ala Asn Arg Val

        115                 120                 125

Leu Ala Glu Gln Gly Leu Asp Ala Trp Pro Thr Cys Gly Ala Ala Ser

    130                 135                 140

Gly Leu Pro Ile Ala Leu Trp Ser Lys Pro Ala Gln Gly Ile Lys Gln

145                 150                 155                 160

Ile Ile Asn Glu Ile Ile Trp Ala Gly Ile Gln Ala Ser Ile Pro Arg

                165                 170                 175