一种利用高油型诱导系诱导玉米单倍体和多胚体的方法

摘要

本发明公开了一种利用高油型诱导系诱导玉米单倍体和多胚体的方法。本发明所提供的诱导玉米单倍体和多胚体的方法，是用高油型玉米单倍体诱导系作父本给母本授粉，收获杂交当代籽粒，得到玉米单倍体和多胚体。该方法不仅具有传统单倍体育种的优点如简化育种程序、加快育种进程、提高品种的纯度等，还能利用油分的遗传效应提高单倍体的鉴别效率，同时也提高了多胚体的诱导率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用高油型玉米孤雌生殖诱导系诱导玉米单倍体和多胚体的方法。

背景技术

玉米是雌雄同株异花、进行有性生殖的作物。玉米育种工作中主要是利用玉米有性生殖的方式选育玉米自交系、配制玉米组合、繁制玉米杂交种。但是在培育玉米自交系的过程中，必须经过多代的自交和选择。通常选育一个品种需要上十年的时间，需要消耗大量的人力、物力和财力。因此如何缩短育种进程、提高育种效率是育种家们一直追求的目标。

玉米单倍体是配子体无融合生殖的产物，包括孤雄生殖和孤雌生殖两大类。对获得的单倍体进行人工加倍，只需一个世代就可以获得纯合二倍体，大大缩短育种年限。自从1964年(Guha S，Maheshwari S C.In vitro production of embryos from antherof Dature[J].Nature，1964，204：497)经过花药培养单倍体而揭示了通过实验途径可以获得单倍体后，通过组培途径选育自交系的方法被认为很有希望的方法。但是由于花药培养难度大，技术操作复杂，并且基因型依赖性很强，并且选育出的自交系不一定是优良的自交系，因此难以在育种上规模化利用。

孤雌生殖单倍体可以通过生物诱导和非生物诱导如化学诱导等途径产生，但非生物诱导的问题与花药组培一样存在很多困难，限制其在育种上的应用。生物诱导就是利用生物诱导材料使诱导对象产生单倍体。Coe(Coe E H.A line of maize withhigh haploid frequency[J].Am Nat，1959，93：381-382)在1959年发现了玉米孤雌生殖诱导系Stock6。后来在其基础上不断改造导入Navajo(ACR-nj)遗传标记基因，通过籽粒颜色和植株颜色能较为简便快捷地鉴定出单倍体，从而使生物诱导单倍体进行单倍体育种成为了可能。但是在实践应用中也发现，Stock6的诱导率仍然很低(约为1％)，并且存在很多严重的缺陷，如雄花对温度敏感，自交结实性差，穗粒腐病严重，Navajo遗传标记较弱。因此，选育更高诱导率的新型诱导系是生物导单倍体技术的关键。

生物诱导单倍体技术的另一个限制是单倍体的鉴定效率。目前单倍体的鉴定主要依赖于A1A2C1C2BP1R-nj显性标记系统，即根据胚乳、胚、植株颜色来判断。它首先根据籽粒Navajo标记性状(由A1A2C1C2R-nj基因控制)分拣出可能的单倍体籽粒，再经过苗期植株颜色(由A1A2BP1基因控制)来确定单倍体植株的真伪。但是在实践中发现，该标记系统的基因型选择性比较强，不同的材料标记表达差别很大，有的材料几乎不能用籽粒Navajo标记鉴定；而且不同的环境条件对标记的表达影响也很大。因此开发出新的标记以高效鉴定单倍体对单倍体育种也很重要。

正常的种子只有一个种胚，而多胚种子则可以在一粒种子上着生两个乃至更多的胚芽，如孪生胚等，种植后形成双胚苗或者三胚苗等。多胚种子源自玉米的无融合生殖，此类材料可以用于遗传育种研究，如研究玉米生殖遗传学及其杂种优势利用等。但是，多胚种苗自发产生的频率相当低，杨文鹏等曾对不同类型的玉米进行发芽统计，玉米自发产生多胚种苗的频率仅为0.058％(杨文鹏，柏晓光、陈泽惠，玉米双胚苗的初步观察，[J]贵州农业科学，1991年第6期)。后来人们用药物(如二甲基亚砜)、离子辐照等方法进行多胚种苗的诱导，但效果都不理想。通过杂交诱导以获得大量多胚种苗的方法鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种程序简单、速度快，并且能大量诱导出玉米单倍体和多胚体的方法。

本发明所提供的诱导玉米单倍体和多胚体的方法，是用高油型玉米单倍体诱导系作父本给母本授粉，收获杂交当代籽粒，得到玉米单倍体和多胚体。

其中，所述玉米单倍体可按照如下方法鉴定：对所述杂交当代籽粒借助于颜色标记和油份的花粉直感效应以及利用测定单个籽粒的油分含量相结合鉴定单倍体。具体方法如下：所述杂交当代籽粒中，糊粉层为紫色、胚芽部位无紫色标记、且油份含量低于所述母本自交一代的油份含量的籽粒为单倍体籽粒。

所述多胚体可按照如下方法鉴定：对所述杂交当代籽粒进行种胚筛查和发芽鉴定多胚体。

所述母本可为符合育种目标的自交系、基础群体或杂交种。

上述方法中所述的基础群体指由多个自交系或品种按一定方式混合授粉后形成的玉米群体。

上述方法中所述的杂交种指单交种、三交种或者双交种。

所述多胚体是指籽粒具有多胚因而发芽后出现一粒种子长出两株或两株以上的苗。

所述高油型单倍体诱导系父本指油分含量高于6％以上的高油型单倍体诱导系如农大高诱系等，可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得。

所述步骤(2)中，按照如下方法鉴定单倍体：所述步骤(1)所收获的籽粒中，糊粉层为紫色、胚芽部位无紫色标记、且油份含量低于所述母本自交籽粒油份含量的籽粒为单倍体籽粒。

本发明所用的高油型诱导系具有较Stock6更加明显的Navajo标记，而且保持了ABP1紫色植株标记。除此之外，其含油量较高(6％以上)，具有显著的花粉直感效应，父本效应值可以达到0.38。因此结合籽粒颜色、籽粒油份、植株颜色三个标记能很容易地鉴定单倍体。

与传统生物诱导孤雌生殖生产单倍体的育种程序相比，本发明具有(1)利用所选高油型单倍体诱导系的单倍体诱导率较高(平均6％，部分材料可高达11％)；(2)除色素外，油分可以作为新的遗传标记，一般油分含量比较稳定且具有明显的花粉直感效应，杂交当代籽粒胚面较大，单倍体籽粒胚面相对较小，有利于目测识别单倍体；(3)可以利用单粒油分测定仪器如核磁共振仪(NMR)、近红外仪(NIR)等测定油分含量，单倍体由于油分含量低于杂交籽粒，因而可以被鉴别出来。本方法在提高单倍体诱导率的同时，也将籽粒颜色、籽粒油份、植株颜色等三种单倍体鉴别标记结合起来，提高了单倍体鉴别效率。同时，本发明的方法还提高了多胚体的诱导频率，使多胚突变体的诱导频率高达0.1％-0.21％。

附图说明

图1为本发明所用的的高油型单倍体诱导系选育过程示意图

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、利用高油型单倍体诱导系诱导玉米单倍体

一、实验材料

高油型单倍体诱导系可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得。

以高油型单倍体诱导系农大高油诱2号为例，其选育方法如图1所示：

Stock6引自美国玉米遗传合作社。北农大高油(BHO)是一个高油改良群体，胚面很大，在田间曾发现过自发产生的单倍体。1995年选择BHO群体中数十个单株与Stock6进行杂交，选择其中籽粒Navajo标记最深的一个杂交果穗作为选系的原始组合。利用这一组合再与Stock6回交1-2次，形成F₁自交、一次回交(BC₁)、两次回交(BC₂)3个选系基础群体。后代处理按系谱法进行，连续进行6个世代的自交、测交选育。各个世代选择的重点为：单倍体诱导率、籽粒Navajo标记、植株ABP1标记、籽粒大胚性状、花粉量、结实性及抗病性等，以后结合核磁共振油分测定，进一步对油分和诱导率进行选择。最终选育成诱导率高、标记性状好、农艺性状优良的诱导系农大高油诱2号，含油量达到7％以上。该系具有较Stock6更加明显的Navajo标记，而且保持了ABP1紫色植株标记，并且花粉量大，抗病性好。油分的花粉直感效应明显，效应值可以达到0.38。

对高油诱2号和Stock6进行诱导率的比较，选用综695作为母本，用高油诱2号和Stock6分别做父本进行诱导，杂交10穗统计诱导率，结果表明高油诱2号的诱导率是8％，而Stock6的诱导率只有0.9％。另外高油诱2号的标记也明显优于Stock6。

玉米自交系1145为高抗青枯病自交系，可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得；

玉米自交系Y331为高感青枯病自交系，可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得；

玉米自交系178可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得；

玉米自交系8701可以从河南农业大学获得；

二、诱导玉米单倍体

实验采用随机区组设计，该实验包括12个处理。

实验设五个单倍体诱导处理，每个单倍体诱导处理的父本均为高油诱2号，单倍体诱导处理1的母本为玉米杂交种1145×Y331，单倍体诱导处理2的母本为玉米自交系178，单倍体诱导处理3的母本为玉米自交系8701，单倍体诱导处理4的母本为玉米自交系Y331，单倍体诱导处理5的母本为玉米自交系1145。用高油诱2号分别给上述每个处理的10株母本材料授粉，收获籽粒。

实验设五个对照处理，对照处理1为玉米杂交种1145×Y331进行自交，对照处理2为玉米自交系178进行自交，对照处理3为玉米自交系8701进行自交，对照处理4为玉米自交系Y331进行自交，对照处理5为玉米自交系1145进行自交。收获籽粒。每个对照处理5株。

在单倍体诱导处理的杂交果穗中包括杂合籽粒和单倍体。单倍体的鉴定分别采用两种方法，即标记法和油份测定法。标记法就是依据杂交当代籽粒胚芽的Navajo标记来进行鉴别，糊粉层为紫色、紫色胚芽的杂交当代籽粒为杂合籽粒，糊粉层为紫色、无紫色胚芽的杂交当代籽粒为单倍体。油分测定法就是结合籽粒的含油量来判断单倍体，糊粉层为紫色、胚芽部位无紫色，且籽粒含油量低于母本自交籽粒的为单倍体。由于试验用高诱系含油量高，具有较强的花粉直感效应，因此以自交籽粒的含油量为标准，高于自交籽粒即为双受精籽粒，低于自交籽粒即为单倍体。

在对照处理的自交果穗只出现一种籽粒类型，即糊粉层为黄色。

对照处理1至5这5个处理中，每个处理取50粒自交后代籽粒。将所选籽粒用核磁共振仪进行按照宋同明描述的方法进行油份测定(宋同明，脉冲核磁共震仪对作物种子含油量的快速测定，作物学报，1989，15(2)：160-166)。

为了验证上述鉴定单倍体方法的可靠性，将每个单倍体诱导处理中的单倍体籽粒种植于营养钵中，出苗后根据植株颜色和形态进行诱导率统计，其中单倍体为绿色，植株矮小，叶片较上冲；非单倍体为紫色，植株高大。单倍体诱导率＝单倍体籽粒数/(单倍体籽粒数+杂合籽粒数)×100％。为了进一步鉴定，从中抽查了30个样本进行根尖压片，在显微镜下观察细胞染色体的数目。验证结果表明，在所有组合诱导的7695粒杂交籽粒中，共获得545粒单倍体，平均诱导率为7.08％。

验证结果表明单倍体诱导处理1共获得10个杂交果穗，共计3000粒紫色糊粉层籽粒，其中单倍体180粒。应用标记法鉴定有212粒单倍体(糊粉层为紫色、无紫色胚芽的杂交当代籽粒)，鉴定效率85％。将该用标记法鉴定的212粒单倍体用核磁共振仪进行油份测定；对照处理1取50粒自交后代籽粒用核磁共振仪进行油份测定。结果表明对照处理1自交籽粒的油份含量为3.85％±0.15％(平均值±SD)，用该标记法鉴定的212粒单倍体中，籽粒油分含量有194粒低于4％，这194粒籽粒的油分含量为3.36％±0.27％(平均值±SD)。说明油份标记法的鉴定效率为93％。

验证结果表明单倍体诱导处理2共获得10个杂交果穗，共计700粒紫色糊粉层籽粒，其中35粒单倍体。应用标记法鉴定有50粒单倍体，鉴定效率70％。将该用标记法鉴定的50粒单倍体用核磁共振仪进行油份测定；对照处理2取50粒自交后代籽粒用核磁共振仪进行油份测定。结果表明对照处理2自交籽粒的油份含量为4.13％±0.13％(平均值±SD)，用该标记法鉴定的50粒单倍体中，籽粒油分含量有39粒低于4.26％，这39粒籽粒的油分含量为3.63％±0.32％(平均值±SD)。说明油份标记法的鉴定效率为90％。

验证结果表明单倍体诱导处理3共获得10个杂交果穗，共计928粒紫色糊粉层籽粒，其中80粒单倍体。应用标记法鉴定有100粒单倍体，鉴定效率80％。将该用标记法鉴定的100粒单倍体用核磁共振仪进行油份测定；对照处理3取50粒自交后代籽粒用核磁共振仪进行油份测定。结果表明对照处理3自交籽粒的油份含量为3.75％±0.18％(平均值±SD)，用该标记法鉴定的100粒单倍体中，籽粒油分含量有91粒低于3.93％，这91粒籽粒的油分含量为3.29％±0.37％(平均值±SD)。说明油份标记法的鉴定效率为88％。

验证结果表明单倍体诱导处理4共获得10个杂交果穗，共计994粒紫色糊粉层籽粒，其中50粒单倍体。应用标记法鉴定有79粒单倍体，鉴定效率63％。将该用标记法鉴定的79粒单倍体用核磁共振仪进行油份测定；对照处理4取50粒自交后代籽粒用核磁共振仪进行油份测定。结果表明对照处理4自交籽粒的油份含量为3.28％±0.16％(平均值±SD)，用该标记法鉴定的79粒单倍体中，籽粒油分含量有53粒低于3.44％，这53粒籽粒的油分含量为2.98％±0.21％(平均值±SD)。说明油份标记法的鉴定效率为94％。

验证结果表明单倍体诱导处理5共获得10个杂交果穗，共计2073粒紫色糊粉层籽粒，其中200粒单倍体。应用标记法鉴定有250粒单倍体，鉴定效率80％。将该用标记法鉴定的250粒单倍体用核磁共振仪进行油份测定；对照处理6取50粒自交后代籽粒用核磁共振仪进行油份测定。结果表明对照处理6自交籽粒的油份含量为4.01％±0.21％(平均值±SD)，用该标记法鉴定的250粒单倍体中，籽粒油分含量有222粒低于4.22％，这222粒籽粒的油分含量为3.53％±0.32％(平均值±SD)。说明油份标记法的鉴定效率为90％。

油份结果表明在杂交当代Navajo标记表现明显的材料，利用标记挑选单倍体的准确率达到85％以上，但测油法比标记法更高，高达94％，二者相差9％。Y331等的Navajo标记颜色表现较浅，因此通过胚芽颜色来挑选单倍体就受到一定限制，准确率只有63.23％，而油分测定法由于目标在于胚的含油量，不受颜色深浅的影响，所以与强标记背景上的准确率接近，超过标记法近30％。可见，测油法可以克服标记不稳定所带来的缺点，在各种条件下均有较高的准确率。这表明油分测定法是鉴别弱标记材料的有效方法。

实施例2、利用高油型诱导系诱导玉米多胚体

一、试验材料

高油诱2号可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得；

高油杂交种5598可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得；

杂交种农大108可以从中国农业大学获得；

郑单958可以从河南农业科学院获得。

二、试验处理

试验设6个处理，完全随机区组设计。

试验处理设三个多胚种苗诱导处理，每个多胚种苗诱导处理的父本为高油诱2号，多胚种苗诱导处理1的母本为杂交种5598，多胚种苗诱导处理2的母本为杂交种农大108，多胚种苗诱导处理3的母本为郑单958。用高油诱2号分别给上述每个处理的10株母本授粉，收获籽粒。

试验处理设3个对照处理，对照处理1为5598自交，对照处理2为农大108自交，对照处理3为郑单958自交。每个处理自交10株，收获籽粒。

对收获后的籽粒进行发芽。

多胚种苗诱导处理1共获得10个果穗，共计5157粒，发芽后统计多胚种苗有11株，诱导多胚种苗频率为0.21％，其中10株为双胚苗，1株为三胚苗；多胚种苗诱导处理2共获得10个果穗，共计4000粒，发芽后统计多胚种苗有4株，全为双胚苗，诱导多胚种苗的频率为0.1％；多胚种苗诱导处理3共诱导10穗3194粒，发芽后统计多胚种苗为4株，全为双胚苗，诱导多胚种苗的频率为0.15％。

对照处理1共获得10穗，共计5000粒，发芽后没有发现多胚种苗；对照处理2共获得10穗，共计3900粒，发芽后没有发现多胚种苗；对照处理3共获得10穗，共计3500粒，发芽后没有发现多胚种苗。

从诱导处理和对照处理来看，高油型诱导系能大大地提高多胚种苗的诱导频率。