人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途

摘要

本发明涉及人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒，及其生产方法和用途，在生产中使用了对N端改造的主要衣壳蛋白基因和C末端融合改造的大肠杆菌热不稳定肠毒素LTK63的次要衣壳蛋白L2融合基因；在杆状病毒一昆虫细胞表达体系中生产L1NVLPs、L1N/L2VLPs和L1N/L2－LTK63嵌合病毒样颗粒(cVLPs)。源自HPV16L1N基因的病毒样颗粒产量高；本发明还涉及所述病毒样颗粒在制备疫苗中的应用，该疫苗免疫原性好，可预防HPV16感染及相关病变。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是采用基因分子生物学技术及基因工程蛋白技术，获得一种修饰后的，具有高度组装成病毒样颗粒(VLPs)能力的，病毒衣壳蛋白基因；及其表达出来的重组蛋白，即病毒样颗粒。本发明还涉及该病毒样颗粒的疫苗及其用途。

发明背景

人乳头瘤病毒是一类无胞膜的小DNA病毒，现已发现100多型，主要感染人的粘膜上皮，引起上皮组织的良恶性增生。研究发现有十五种HPV亚型的感染可引起宫颈癌前病变及宫颈癌，这些亚型被定义为高危型如HPV16，18，31，33，45，等。大量的研究结果表明慢性持续性高危型人乳头瘤病毒感染是妇女宫颈癌的明确诱因，其中由HPV16感染诱发的宫颈癌占宫颈癌发病总数的50％以上。研究发现我国宫颈癌患者HPV16的阳性率高达79.6％(Wu Y，et.al.Association ofhigh-risk HPV types and viral load with cervical cancer in China.J Clin.Virol.2006；35(3)：264-269)。动物实验及临床试验结果表明，利用基因工程重组技术表达的病毒外壳蛋白L1或L1及L2，体外可自组装成空的病毒颗粒(Virus-likeparticles，VLPs)，VLPs除了不含病毒核酸，不具致病性之外，但可经病毒的感染相关受体高效率的进入宿主细胞，包括抗原递呈细胞，其它特性如外形、空间构象以及免疫原性几乎与天然病毒颗粒完全一样，VLPs免疫后可诱发机体产生高滴度的中和抗体，保护机体免受同一型别病毒的攻击或自然感染。目前国际上VLPs疫苗的表达体系主要有两种：杆状病毒-昆虫细胞表达体系及啤酒酵母表达体系，两种表达体系生产的VLPs均在欧美等地区进行了临床试验，结果表明VLPs疫苗安全性好，在性活跃期及性活跃期前妇女接种HPV16及HPV18VLPs疫苗三次后，通过迄今5-6年随访观察发现，接种疫苗可以明确高效的预防宫颈HPV感染、宫颈管内上皮不典型增生及早期宫颈癌的发病率。现有技术中，人们研制的利用酵母表达体系获得的HPV16、HPV18、HPV6、HPV11L1VLPs宫颈癌预防疫苗“Gardasil”已经上市。还有人利用杆状病毒-昆虫细胞表达体系获得的HPV16L1VLPs、HPV18L1VLPs疫苗也在世界许多国家及地区进行临床试验，结果表明疫苗接种3次后对宫颈HPV16、18病毒感染、宫颈癌前病变及宫颈癌的预防保护效果在5年期以上(Harper DM，et.al.Efficacy of a bivalent L1 virus-likeparticle vaccine in prevention of infection with human papillomavirus types 16 and 18in young women：a randomised controlled trial.Lancet.2004；364：1757-1765；Harper DMet.al.Sustained efficacy up to 4.5 years of a bivalent L1 virus-like particle vaccineagainst human papillomavirus 16 and 18：follow-up from a randomised control trial.Thelancet.2006；Internet：1-9.)。因此病毒样颗粒疫苗市场开发前景广阔。特别是广大的贫困落后地区是宫颈癌的高发区，急需研发具有使用价值的VLPs疫苗，降低疫苗的成本，提高人群的免疫保护效率。

目前，现有技术中开发的L1VLPs疫苗采用的L1基因均为源自病人标本的野生型L1基因。Collier B等的研究结果表明HPV16野生型L1基因N端点存在RNA转录抑制元件，同意突变改造HPV16L1基因编码区N端前514bp后可以消除其转录抑制元件。研究发现与野生型基因相比，以N端改造后的HPV16L1基因构建的真核表达质粒瞬时转染细胞后，L1基因的转录和表达水平显著加强，以该基因的表达质粒作为DNA疫苗，免疫小鼠后，诱发产生的免疫反应较野生型L1基因疫苗诱发的免疫反应显著增强。(Collier B，et.al.Specific inactivation of inhibitorysequences in the 5′end of the human papillomavirus type 16 L1 open reading frameresults in production of high levels of L1 protein in human epithelial cells.J Virol 2002，76：2739-2752；Rollman E，et.al.HPV-16 L1 genes with inactivated negative RNAelements induce potent immune responses.Virology 2004，322：182-189.)。目前尚无以消除HPV16L1N端RNA抑制元件的HPV16L1基因用于体外表达生产基因工程重组蛋白疫苗的研究。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，一方面，本发明涉及一种病毒样颗粒，该病毒样颗粒由选自序列为SEQ ID NO.1的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或核苷酸序列为SEQ ID NO.2的HPV16L1N/L2-LTK63嵌合基因所编码，该病毒样颗粒由下列步骤获得：

1)使用pFastBacDual-HPV16L1N、pFastBacDual-HPV16L1N/L2或pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63 linkB重组质粒分别转化感受态大肠杆菌DH10Bac；

2)筛选鉴定获得分别重组有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组Bacmid；

3)将所述重组Bacmid转染对数生长期的昆虫细胞，转染后收集上清，获得含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒；

4)用所述含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63linkB基因的重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，使重组杆状病毒在感染细胞内分别表达导入的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63基因；

5)裂解感染有含HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒的细胞，纯化获得HPV16L1NVLPs、HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63嵌合病毒样颗粒。

另一方面，本发明还涉及同时将HPV16L2基因重组入pFastBacDual-HPV16L1N双表达载体的P10启动子的下游，获得重组质粒pFastBacDual-HPV16L1N/L2。该重组质粒于2006年9月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC ID NO.1802。

另外，本发明还涉及将L2-LTK63基因插入pFastBacDual-HPV16L1N的P10启动子的下游，获得pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63 linkB重组质粒。该重组质粒于2006年9月7日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号别为CGMCC ID NO.1803。

本发明进一步涉及序列号为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的HPV16L1N基因；以及融合基因L2-LTK63，该基因由改造后大肠杆菌热不稳定毒素基因(LTK63)与人乳头瘤病毒16型的L2基因融合而成，用于提高人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒疫苗的免疫活性。该基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明涉及含有位于PH启动子下游的HPV16L1N基因的pFastBacDual-HPV16L1N重组表达质粒；含有位于P10启动子下游的HPV16L2基因的pFastBacDual-HPV16L1N/L2重组质粒和含有位于P10启动子下游的L2-LTK63基因的pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63 linkerB重组质粒。

另外，本发明涉及含有HPV16L1N基因，HPV16L1N/L2基因和HPV16L1N/L2-LTK63 linkerB基因的重组Bacmid。

另一方面，本发明涉及含有上述重组Bacmid的大肠杆菌DH10Bac菌株。

本发明涉及含有所述的重组Bacmid的昆虫Sf9细胞。

另一方面，本发明还进一步涉及所述的病毒样颗粒在制备用于预防HPV16病毒的感染以及感染诱发的宫颈或外阴部位的癌前病变及恶性肿瘤的疫苗中的应用，特别是预防与HPV16感染相关的宫颈癌。

本发明也包括利用HPV16L1N和L2-LTK63基因以DNA疫苗和其他形式用于疫苗方面的研究；最后本发明还包括将HPV16L1N和L2-LTK63基因或重组蛋白在制备药物、药物组合物，特别是免疫治疗领域的应用。本发明具有重要的经济及社会意义。

本发明还涉及一种制备所述的病毒样颗粒的方法，其步骤包括：

1)使用pFastBacDual-HPV16L1N、pFastBacDual-HPV16L1N/L2或pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63 linkB重组质粒分别转化感受态大肠杆菌DH10Bac；

2)筛选鉴定获得分别重组有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组Bacmid；

3)将所述重组Bacmid转染对数生长期的昆虫细胞，转染后收集上清，获得含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒；

4)用所述含有HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63linkB基因的重组杆状病毒感染对数生长期的Sf9昆虫细胞，使重组杆状病毒在感染细胞内分别表达导入的HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63基因；

5)裂解感染有含HPV16L1N基因、HPV16L1N/L2基因或HPV16L1N/L2-LTK63 linkB基因的重组杆状病毒的细胞，纯化获得HPV16L1NVLPs、HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63嵌合病毒样颗粒。

本发明利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统生产的上述VLPs具有和天然病毒粒子一样的类似的大小和结构特征，同时具有和天然病毒颗粒一样的凝集小鼠红细胞的生物学特性。与用野生性的HPV16L1基因生产的VLPs疫苗相比，HPV16L1N基因用于VLPs疫苗生产的优势在于，可显著提高VLPs疫苗的产量；另外用L2-LTK63基因生产cVLPs疫苗的有益之处在于，L2C末端融合LTK63基因后不影响L1N/L2-LTK63 cVLPs的组装及表达量，与HPV16L1N/L2VLPs疫苗相比，HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs疫苗可显著提高疫苗的免疫原性，包括显著提高HPV16L1N/L2 VLPs特异的血清抗体滴度、淋巴细胞增殖指数及CD4⁺/IL-4⁺及CD4⁺/IFN-γ⁺的数目。

附图说明

图1显示其中插入了HPV16L1N基因的重组质粒“pFastBacDual-HPV16L1N”结构简图。

图2显示其中插入了HPV16L1N基因和HPV16L2基因的重组质粒“pFastBacDual-HPV16L1N/L2”结构简图。

图3显示其中插入了HPV16L1N基因和HPV16L2-LTK63融合基因的重组质粒“pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63 linkerB”结构简图。

图4显示了纯化后病毒样颗粒的SDS-PAGE电泳考马斯亮兰染色结果。在图中，1代表HPV16L1N VLPs，2代表HPV16L1N/L2VLPs，3代表HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs。

图5显示了纯化后HPV16L1N/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs进行western blot鉴定的结果。在图中1代表HPV16L1N/L2VLPs，2代表HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs。图5A为用Cam-vir-1单抗杂交的结果，图5B为用抗HPV16L2兔多抗杂交的结果，图5C为用抗LTB兔多抗杂交的结果。

图6显示了纯化后病毒样颗粒的透射电镜结果。其中图6A为HPV16L1N/L2VLPs透射电镜照片，图6B为HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs透射电镜照片。

图7显示了HPV16L1N/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs诱导小鼠红细胞发生凝集反应的实验结果。

图8显示了在不同时间点，用ELISA法测定的用HPV16L1N/L2VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠血清中和抗体的滴度。在图中，箭头表示的是免疫的时间点，星号表示的是HPV16L1N/L2VLPs免疫小鼠血清中和抗体的滴度与HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs的有明显的统计学差异。

图9显示了HPV16L1N/L2VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠血清中和抗体的构象依赖特性实验结果。

图10显示了在第三次免疫后3周，HPV16L1N/L2VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠脾细胞增殖实验结果。

图11显示了在第三次免疫后6周，HPV16L1N/L2VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠CD4⁺/IFN-γ⁺T细胞的流式细胞检测结果。其中图11A为PBS对照组小鼠的CD4/IFN-γ双染色的流式细胞图，图11B为HPV16L1N/L2VLPs免疫组小鼠的CD4/IFN-γ双染色的流式细胞图，图11C为HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫组小鼠的CD4/IFN-γ双染色的流式细胞图，图11D为汇总的直方图。

图12显示了在第三次免疫后6周，HPV16L1N/L2VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠CD4⁺/IL-4⁺T细胞的流式细胞检测结果。其中图12A为PBS对照组小鼠的CD4/IL-4双染色的流式细胞图，图12B为HPV16L1N/L2VLPs免疫组小鼠的CD4/IL-4双染色的流式细胞图，图12C为HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫组小鼠的CD4/IL-4双染色的流式细胞图，图12D为汇总的直方图。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明进行详细说明，其中实施例仅仅是说明而非限定的作用，本领域技术人员完全可以在以下披露的具体实施例的技术上作出改进，但是不超过本发明权利要求的范围或者本发明精神之内所作出的改进都会落入本发明的保护范围。

实施例1.组织基因组DNA的提取

将鲍温氏病活检标本剪碎后，加入适量抽提缓冲液(10mmol/L Tris.Cl pH 8.0，0.1mol/L EDTA pH 8.0，20μg/ml RNA酶，0.5％SDS)，充分研磨裂解后，转入到50ml离心管，加入蛋白酶K，终难浓度为100μg/ml，充分混匀，50℃水浴，其间不时轻微振动试管，直至组织完全溶解(约1.5h)，以等体积酚、酚-氯仿-异戊醇、氯仿-异戊醇各抽提一次，上清中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和两倍体积无水乙醇，混匀，-20℃沉淀过夜，12000r/min离心，弃上清，70％乙醇洗沉淀两次，沉淀于空气中适当干燥后，溶于25μl TE(RNase 20μg/ml)中，测OD260并计算DNA浓度，样品贮存于4℃备用。

实施例2.人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆

从GeneBank上检索得到人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因序列，根据此序列设计引物，上游引物为5’-GCACTAGATCTAATATGTCTTTTGGCTGCCTAG-3’，下游引物为5’-TCGAGCAGATCTTTACAGCTTAGTTTTTTGC G-3’。上下游引物中均包含BglII酶切位点。以从鲍温氏病活检组织提取的基因组DNA为模板，用pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，58℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.5kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后，对片段进行加A处理，反应体系为：PCR片段200ng，dATP20μM，Tap酶10U，总体积为20μl，72℃反应15分钟。对加A产物进行琼脂糖凝胶电泳回收后，进行定量。按4∶1的摩尔比加入加A处理后的PCR片段和pGEM-T载体，T4DNA连接酶，于16℃连接过夜，连接物转化DH5α感受态细胞，挑取白色克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用BglII单酶切后能释放出大小为1.5kb的片断，与GenBank上的HPV16L1基因大小吻合。送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果显示：与原型HPV16L1比较，从鲍温氏病活检组织获得的HPV16L1存在三个错义突变：His202Asp、Thr266Ala、Ala316Thr，另外还有三个同意突变，分别位于L1基因序列的993(T to A)、1029(Ato T)、1188(C to T)。该基因命名为HPV16L1N。

实施例3.人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的优化与克隆

由于在野生型人乳头瘤病毒16型L1基因的5’端存在着抑制性序列，为了提高HPV16L1蛋白的表达量，对这些抑制性序列进行突变失活，将优化后的HPV16L1基因命名为HPV16L1N。

以含有野生型HPV16L1基因的重组载体pGEM-T-HPV16L1 wild为模板，用突变引物1 5’-CCACGCTGGTACCTCCCGCCTGCTGGCAGTTGGACATCCCTATTTTCC  -3’和下游引物5’-CCCAAGCTTTTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGCAG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，61℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.4kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后，进行定量。然后以回收的PCR片段为模板(约50ng)，用突变引物25’-GTGTCCACCGACGAGTACGTGGCTCGCACCAACATCTACTACCACGCTGGTACCTCCCG-3’和下游引物5’-CCCAAGCTTTTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGCAG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，62℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.45kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后，进行定量。然后以回收的PCR片段为模板(约50ng)，用突变引物35’-AGGCCACCGTGTACCTGCCCCCCGTGCCCGTGTCCAAGGTGGTGTCCACCGACGAGTAC-3’和下游引物5’-CCCAAGCTTTTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGCAG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，61℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.5kb的特异性扩增片段。凝胶回收PCR片段后，进行定量。然后以回收的PCR片段为模板(约50ng)，用突变引物45’-CTAGTCTAGAGCCGCCACCATGTCCCTGTGGCTGCCCTCCGAGGCCACCGTGTACCTGC-3’和下游引物5’-CCCAAGCTTTTACAGCTTACGTTTTTTGCGTTTAGCAG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，61℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.5kb的特异性扩增片段，对此片段进行回收。由于在突变引物4和下游引物中分别含有XbaI和HindIII酶切位点，用XbaI和HindIII双酶切回收的最终PCR片段以及杆状病毒-昆虫细胞双表达载体pFastBacDual(Invitrogen公司)，37℃酶切6小时，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，定量后，按4∶1的摩尔比加入酶切后的PCR片段和pFastBacDual载体，T4DNA连接酶，于16℃连接过夜，连接物转化DH5α感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用XbaI和HindIII双酶切后能释放出大小约为1.5kb的片段，与HPV16L1N大小吻合，保种，送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果显示，优化突变的序列完全正确。序列与SEQ IDNO.1所示序列一致，并位于pFastBacDual双表达载体的PH启动子的下游。与HPV16野生型基因序列相比，该HPV16L1N基因的前129bp进行了同义突变改造，与Collier B等报道的所改造的HPV16L1基因的N端514bp存在13处碱基差异，主要是由于Ser Ala Arg Gly氨基酸密码子的选择不同所致；另外本发明的HPV16L1N基因的mRNA起始区的特征是位于伸展在外部的开环区，而Collier B等报道的N端优化的HPV16L1基因的mRNA起始区的特征是位于伸展在外部的茎区，因此相比较于上述现有技术，本发明的16L1N基因的mRNA起始区的特征是位于伸展在外部的开环区，因而比HPV16L1的mRNA起始区的二级结构较低，更易于RNA聚合酶的识别，利于提高基因的转录及表达水平。获得pFastBacDual-HPV16L1N重组质粒。

实施例4.人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L2基因的克隆

从GeneBank上检索得到人乳头瘤病毒16型次要衣壳蛋白L2基因序列，根据此序列设计引物，上游引物为5’-CATGGCTAGCACCATGCGACACAAACGTTCTGCAAAACG-3’，下游引物为5’-ACGTGCATGCTFAGGCAGCCAAAGAGACATCTG-3’。上下游引物中分别包含NheI和SphI酶切位点。以HPV16野生型基因组DNA为模板，用pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，59℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.4kb的特异性扩增片段，回收此特异性片段。用NheI和SphI对PCR回收产物和含有HPV16L1的重组载体pFastBacDual-HPV16L1N进行双酶切，37℃酶切6小时，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，定量后，按4∶1的摩尔比加入酶切后的L2 PCR片段和pFastBacDual-HPV16L1N载体，T4DNA连接酶，于16℃连接过夜，连接物转化DH5α感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用NheI和SphI双酶切后能释放出大小约为1.4kb的片段，与HPV16L2大小吻合，保种，送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果与genebank上的HPV16L2序列比较显示第33位氨基酸由Glu变为Asp，其余的与野生型一致。获得双表达HPV16L1N和HPV16L2的质粒pFastBacDual-HPV16L1N/L2。

实施例5.大肠杆菌热不稳定肠毒素LTK63基因的克隆

大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)由A和B两个亚基组成。由于野生型大肠杆菌热不稳定肠毒素，具有较强的毒性，所以不适合做疫苗佐剂。而LTK63是LT蛋白的一种突变体，它的63位氨基酸由野生型的丝氨酸突变为赖氨酸，突变后的LTK63完全消除了野生型LT的毒性，可作为病毒样颗粒疫苗的佐剂。LT A亚基DNA序列的3’端与B亚基DNA序列的5’端有4个碱基的重叠，其中包括A亚基的终止密码子。在大肠杆菌中A和B两个亚基的开放阅读框可以被通读，而在真核细胞中A亚基的终止密码子将终止B亚基的表达。为了在昆虫细胞中表达完整的大肠杆菌热不稳定肠毒素，需消除A亚基的终止密码子，将A和B两亚基融合表达。为此本研究将融合表达AB两亚基的大肠杆菌热不稳定肠毒素即LTK63与HPV16L2融合，使其以嵌合的形式表达在组装后的VLPs上。首先需获得大肠杆菌热不稳定肠毒素LTK63基因，为了尽量减小LTK63融合对病毒样颗粒组装效率的影响，去除LTA亚基的N端的信号肽序列，具体措施如下：

以含有LT基因序列的pLT质粒为模板，用LTA上游引物(含有BamHI酶切位点)5’-CGCGGATCCACCATGAAAAATATAACTTTCA-3’，LT A下游引物5’-TAATTCATCCCGAATTCTGT TATATATG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，扩增编码A亚基的基因。反应条件为：94℃变性60s，54℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约800bp的特异性扩增片段，对此片段进行回收。

以含有LT基因序列的pLT质粒为模板，用LT B上游引物5’-GAATTCGGGATGAATTAATGAATAAAGTAAAATG-3’，LT B下游引物(含有XhoI酶切位点)5’-CCGCTCGAGCTAGTTTTCCATACTGATTG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，扩增编码B亚基的基因。反应条件为：94℃变性60s，53.5℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约370bp的特异性扩增片段，对此片段进行回收。得到的B片段的5’端有17个碱基对与A片段是重叠的GAATTCGGGATGAATTA。

利用overlapPCR法，以A片段及B片段PCR产物为模板(各50ng)，用LTA上游引物和LT B下游引物，pfu高保真酶进行overlap PCR反应，扩增LT A+B基因。反应条件为：94℃变性60s，53℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.1kp的特异性扩增片段，回收后。对片段进行加A处理，反应体系为：PCR片段200ng，dATP20μM，Tap酶10U，总体积为20μl，72℃反应15分钟。对加A产物进行琼脂糖凝胶电泳回收后，进行定量。按4∶1的摩尔比加入加A处理后的PCR片段和pGEM-T载体，T4DNA连接酶，于16℃连接过夜，连接物转化DH5α感受态细胞，挑取白色克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，BamHI和XhoI双酶切后，能释放出大小约为1.1kb的片段，与LT A+B大小吻合保种，送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果显示，编码A和B量亚基的基因已正确融合，序列正确。获得pGEM-T-LT A+B重组载体。

以pGEM-T-LT A+B为载体，用上游引物1(含有BamHI酶切位点)5’-CGCGGATCCACCATGAATGGCGACAGATTATACC-3’和下游引物1(含有突变位点)5’-AACTAAGCTTAGTGGAAACATATCCGTCATC-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，扩增片段1。反应条件为：94℃变性60s，56℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约200bp的特异性扩增片段，对此片段进行回收。然后，以pGEM-T-LT A+B为载体，用上游引物25’-ATGTTTCCACTAAGCTTAGTTTGAGAAGTGCTC-3’和下游引物2(含有XhoI酶切位点)5’-CCGCTCGAGCTAGT TTTCCATACTGATTG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，扩增片段2。反应条件为：94℃变性60s，54℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约900bp的特异性扩增片段，对此片段进行回收。由于片段1和片段2之间有ATGTTTCCACTAAGCTTAGTT 21个碱基对的重叠，利用overlapPCR法，以片段1(40ng)和片段2为模板(80ng)，用上游引物1和下游引物2，pfu高保真酶进行overlap PCR反应，扩增LT K63基因。反应条件为：94℃变性60s，54℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.1kp的特异性扩增片段，回收后。对片段进行加A处理，反应体系为：PCR片段200ng，dATP20μM，Tap酶10U，总体积为20μl，72℃反应15分钟。对加A产物进行琼脂糖凝胶电泳回收后，定量。按4∶1的摩尔比加入加A处理后的PCR片段和pGEM-T载体，T4DNA连接酶，于16℃连接过夜，连接物转化DH5α感受态细胞，挑取白色克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，BamHI和XhoI双酶切后，能释放出大小约为1.1kb的片段，与LTK63大小吻合保种，保种，送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果显示，LTK63基因序列正确。获得pGEM-T-LTK63重组质粒。

实施例6.双表达HPV16L1N和HPV16L2-LTK63融合基因重组质粒的构建

突变后的LTK63完全消除了野生型LT的毒性，可作为病毒样颗粒疫苗的佐剂。为了尽可能的减小LTK63对病毒样颗粒组装的影响，将LTK63通过一个(GlyGlyGlyGlySer)×3的柔性linkB与去除终止密码的HPV16L2 C末端融合。首先PCR扩增不含终止密码子的HPV16L2基因：以HPV16野生型基因组DNA为模板，用上游引物(含有XhoI酶切位点)5’-CCGCTCGAGGC CGCCACCATGCGACACAAACGTTCTGC-3’和下游引物(含有NheI酶切位点)5’-CATGGCTAGCGGCAGCCAAAGAGACATCTG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，61℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.4kb的特异性扩增片段，回收此特异性片段。用XhoI和NheI对PCR回收产物和含有HPV16L1的重组载体pFastBacDual-HPV16L1N进行双酶切，37℃酶切6小时，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，定量后，按4∶1的摩尔比加入酶切后的L2 PCR片段和pFastBacDual-HPV16L1N载体，T4DNA连接酶，于16℃连接过夜，连接物转化DH5α感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用XhoI和NheI双酶切后能释放出大小约为1.4kb的片段，与HPV16L2大小吻合，保种，获得双表达HPV16L1N和HPV16L2 LackTAA的载体pFastBacDual-HPV16L1N/L2LackTAA。

以pGEM-T-LTK63重组质粒为模板，用上游引物15’-GGTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTGGCTCCACCATGAATGGCGACAGATTA-3’和下游引物(含有SphI酶切位点)5’-ACGTGCATGCCTAGTTTTCCATACTGATTGCCGCAATTG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，61℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.1kb的特异性扩增片段，回收此特异性片段。然后以此回收的PCR片段为模板，用上游引物2(含有NheI酶切位点)5’-CATGGCTAGCGGCGGTGGCGGTTCCGGTGGCGGTGGCTCCGGTGGCGGTGGCTCC-3’和下游引物(含有SphI酶切位点)5’-ACGTGCATGCCTAGTTTTCCATACTGATTGCCGCAATTG-3’，pfu高保真酶进行PCR反应，反应条件为：94℃变性60s，61℃复性60s，72℃延伸120s，循环30次，最后72℃延伸300s。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见约1.1kb的特异性扩增片段，回收此特异性片段。用NheI和SphI对回收的PCR片段和pFastBacDual-HPV16L1N/L2 LackTAA重组质粒进行双酶切，37℃酶切6小时，琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，定量后，按4∶1的摩尔比加入酶切后的PCR片段和pFastBacDual-HPV16L1N/L2 LackTAA载体，T4DNA连接酶，于16℃连接过夜，连接物转化DH5α感受态细胞，挑克隆，进行PCR鉴定。将阳性克隆进行质粒小提，用NheI和SphI双酶切后能释放出大小约为1.1kb的片段，与添加有linker的LTK63大小吻合，保种，送Invitrogen公司采用Applied Biosystem双脱氧核苷酸终止法进行测序。测序结果显示，HPV16L2-LTK63融合基因序列正确。序列与SEQ ID NO.2所示的序列一致。获得双表达HPV16L1N和HPV16L2-LTK63融合基因的重组质粒pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63linkB。

实施例7.重组Bacmid的获得

取三支100μl CaCl₂方法制备的感受态大肠杆菌DH10Bac(Invitrogen货号10361012)，分别加入pFastBacDual-HPV16L1N，pFastBacDual-HPV16L1N/L2和pFastBacDual-HPV16L1N/L2-LTK63 linkerB质粒各50ng，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克45s，置冰上冷却2min后加入不含抗生素SOC培养基900μl，37℃振荡培养(225rpm)4h。取适量菌液涂于含卡那霉素、庆大霉素、四环素和Blue-gal的LB平板上，37℃培养24～48h，白斑为阳性克隆。对阳性克隆进行2～3次蓝白斑分化筛选及PCR鉴定。对真阳性克隆进行保种。

将阳性菌接种于5ml含卡那、庆大、四环素三种抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养(250rpm)18～24h。收集1.5ml菌液于EP管内，10000g×30s，弃上清，加溶液I[15mMTris-HCL(pH8.0)，10mMEDTA，100μg/ml RNase A]0.3ml重悬菌体，加溶液II(0.2N NaOH，1％SDS)0.3ml，轻轻混匀，室温放置5min，加溶液III(3M KAc，pH 5.5)0.3ml，混匀，冰上放置10min，离心14000g×10min，吸上清于另一支EP管中，加异丙醇0.8ml，-20℃放置过夜，室温离心14000g×10min，70％乙醇洗两次。用无菌的50μl TE(pH 8.0)溶解。OD260/280测定重组Bacmid纯度及浓度。

实施例8.昆虫细胞sf-9的培养

从Invitrogen公司购买sf-9细胞(货号11496015)，接种于T75培养瓶，接种密度为5×10⁶/T75培养瓶，用SF-900II SFM培养基(Invitrogen货号10902088)于27℃恒温培养箱中培养，当细胞密度达到90％融合时，用巴斯特吸管轻轻将细胞吹下，进行传代。当细胞数量及活力打到悬浮培养要求时，从T75培养瓶小心地将细胞吹下后，台盼兰染色测定细胞活力在90％以上，按照5×10⁵细胞/ml的密度接种于悬浮培养瓶中，转速为50rpm，于27℃恒温培养箱中培养，每天测定细胞的密度与活力，当细胞密度达到2.5×10⁶细胞/ml时进行传代。

实施例9.重组杆状病毒的获得与扩增

于35mm平皿中接种培养2～3天(处于对数生长期)的Sf9细胞8×10⁵个，27℃培养2～4h。准备溶液A(1μg Bacmid DNA稀释于100μl Grace培养基(Invitrogen货号11595030))和溶液B(6μl Cellfectin转染试剂(Invitrogen货号10362010)稀释于100μl Grace培养基(Invitrogen货号11595030))，将溶液A和B合并，轻轻混匀，室温放置25min。用2ml Grace培养基洗涤细胞2次，缓慢向平皿中加入上述混合的DNA脂质体复合物，轻轻混匀，再中加入800μl Grace培养基，平皿置于27℃培养5h。移去转染培养基，添加2ml SF-900II SFM培养基(Invitrogen货号10902088)培养，继续培养至72h。收集上清，即为重组杆状病毒原液P1，加入胎牛血清，终浓度为2％，于4℃避光保存。

对数生长期的sf-9细胞按照3×10⁵细胞/5ml/T25培养瓶接种，27℃培养2～4h，细胞贴壁后，加入150μl重组杆状病毒原液P1，27℃继续培养48h，收集上清，离心去除细胞残渣，得到的为第二代重组杆状病毒液P2，加入胎牛血清，终浓度为2％，于4℃避光保存。

对数生长期的sf-9细胞按照9×10⁵细胞/15ml/T75培养瓶接种，27℃培养2～4h，细胞贴壁后，加入800μl第二代重组杆状病毒液P2，27℃继续培养48h，收集上清，离心去除细胞残渣，得到的为第三代重组杆状病毒液P3，加入胎牛血清，终浓度为2％，于4℃避光保存。其滴度可达1×10⁸～1×10⁹pfu/ml。得到的第三代重组杆状病毒用于人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的表达。

实施例10.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒在昆虫细胞sf-9细胞中的表达

sf-9细胞悬浮培养到密度为2～2.5×10⁶细胞/ml时，从摇瓶中取出5×10⁸细胞，1500rpm离心5min，去除上清，加入20ml SF-900II SFM重悬细胞，加入5ml第三代重组杆状病毒(MOI为2～5)，室温感染1-1.5h。往直径为150mm的平皿中接种已感染病毒的细胞，晃动平皿以铺匀细胞，在27℃培养箱中培养，待细胞有明显的病变时，用细胞刮收集细胞，5000rpm，4℃离心后，约2×10⁹细胞用10ml昆虫细胞裂解液重悬，-80℃冻存。

实施例11.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的纯化

1).将样品置于50ml离心管中，冰浴，用Fisher550超声波破碎仪，Speed 4.5，超声5分钟，每次25秒，间隔10秒。

2).将超声处理后的样品于4℃，10,000rpm离心15min。留取上清。

3).向离心管(Beckman)中先加8mlCsCl，然后沿着管壁慢慢加入8ml 40％蔗糖，使其形成明显的界面。

4).用1000μl加样器慢慢滴加21ml含有VLP的样品，然后于10℃，27,000rpm离心2.5h。

5).用吸管从上部吸去液体，直至蔗糖/CsCl交界处的云雾状区带。

6).用10ml注射器，收集上述管内的液体，然后将其加入离心管内(BeckmanQuick-Seal管)；最后吸取裂解液补足体积至颈口下少许，平衡后于20℃，50,000rpm离心16h。

7).离心后可见云雾状VLP区带。用18-19G针头从离心管底部刺破收集云雾状VLP区带。

8).Western blot对每个收集组分进行鉴定。

9).将阳性收集组分用10mM HEPES(pH 7.2)4℃透析2～6小时。透析后用BCA试剂盒(PIERCE)进行蛋白定量。定量后再进行透射电镜分析。

根据BCA定量结果，可以计算出每升密度为2～2.5×10⁶细胞/ml的sf-9细胞通过杆状病毒表达系统表达后，可纯化得到8～10mg的HPV16L1N VLPs，HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs。

实施例12.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的SDS-PAGE考马斯亮兰染色及western blot检测

各取5μg纯化后的HPV16L1N VLPs，HPV16L1N/L2 VLPs及HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs，加入终浓度为10mmol/L DTT，70℃变性5min，用8％SDS-PAGE进行电泳，电泳完后用考马斯亮蓝R-250染色液(45ml甲醇+45ml蒸馏水+10ml冰乙酸+0.25g考马斯亮蓝R250)室温染色2h，再于脱色液(45ml甲醇+45ml蒸馏水+10ml冰乙酸)中脱色数小时，至染色条带清晰可见为止。结果如图4所示，HPV16L1N VLPs，HPV16L1N/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63cVLPs三种VLPs的纯度均在90％以上。三个泳道中位于55kD的带为HPV16L1N蛋白，第二泳道中位于90kD的带为HPV16L2蛋白，第三泳道中位于130kD的带为HPV16L2-LTK63融合蛋白。

各取0.5μg纯化后的HPV16L1N/L2 VLPs及HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs，加入终浓度为10mmol/L DTF，70℃变性5min，用8％SDS-PAGE进行电泳，转膜，5％BSA-PBST室温封闭2h后分别用Cam-vir-1单抗，抗HPV16L2兔多抗以及抗LT B亚单位兔多抗以1∶3000稀释后4℃孵育过夜。洗涤后分别加入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG或羊抗兔IgG二抗，室温孵育1h，充分洗涤后，加入化学发光底物试剂(PIERCE，货号34079)，室温孵育5min，暗示显影、定影。结果如图5A，图5B和图5C所示。图5A所示，用Cam-vir-1孵育后，HPV16L1N/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs均在55kD大小处出现特异性的L1N条带，图5B所示，用抗HPV16L2兔多抗孵育后HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs分别在90kD和130kD处出现特异条带，在特异性条带下有一些非特异的带，可能是L2或者L2-LTK63的降解物，图5C所示，用抗LT B兔多抗孵育后HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs 130kD处出现特异性条带，而HPV16L1N/L2 VLPs则没有任何条带。Western blot结果显示HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs的组成成分正确。

实施例13.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的透射电镜观察

将20μl透析后的病毒样颗粒样品滴在铜网上，静置1min，用去离子水洗铜网。然后用100μl的1％醋酸铀对铜网负染30s，用滤纸吸干剩余的醋酸铀染液，在空气中干燥后。将铜网装入JEM1010电子显微镜，放大倍率为50,000倍，观察，照相。结果如图6A和图6B所示，HPV16L1N/L2VLPs直径约为55nm，大小均匀，形状规则。而HPV16L1N/L2-LTK63cVLPs存在一些比天然病毒大的颗粒，这样的颗粒直径约为70nm，而且形状不规则，同时存在一些比较规则，直径约为55nm，大小均匀的病毒样颗粒。在50,000倍放大倍数的透射电镜视野中，其中HPV16L1NVLPs每视野可见86个VLPs，HPV16L1N/L2 VLPs每视野可见119个VLPs，HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs每视野可见112个VLPs，而用同系统表达野生型HPV16L1基因获得的VLP每个视野可见72个VLPs(王立良人乳头瘤病毒16型L1结构基因的克隆、表达以及表达蛋白的结构与功能的研究，中国协和医科大学博士论文)，结果表明：

1.优化后的HPV16L1 N基因可显著提高VLPs的产量；

2.嵌合LTK63后不影响蛋白的表达水平及VLPs的组装效率。

因此，以优化后HPV16L1基因作为VLPs疫苗生产的抗原基因极具应用开发前景。

实施例14.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒诱发小鼠红细胞发生凝集反应的实验

1).从小鼠颈动脉取血至装有109mM柠檬酸钠(m/v)的EP管中(血∶柠檬酸钠＝9∶1)。

2).4℃，1000g离心5分钟。

3).弃上清，将红细胞用含有1mg/ml BSA的PBS重悬，终浓度为1％(vol/vol)。

4).4℃，1000g离心5分钟后，弃上清，用含有1mg/ml BSA的PBS洗红细胞两遍，并将终浓度调节为1％(vol/vol)。

5).将经过10mM HEPES(pH 7.2)透析后的VLP用含有1mg/ml BSA的PBS调节浓度为4ng/μl。向96孔U型板中加入50μl PBS(含1mg/ml BSA)/孔，再向第一个孔中加入50μl浓度为4ng/μl的VLP溶液，混匀后做倍比稀释。

6).向每个孔中加入50μl浓度为1％的红细胞溶液，充分混匀。于4℃孵育3小时后，照相。

结果如图7所示，HPV16L1N/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63cVLPs均能有效的诱导小鼠红细胞发生凝集反应。

实施例15.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒的小鼠免疫实验

取4-6周龄的BALB/c小鼠，随机分为三组，分别用PBS，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs进行免疫，肌肉注射，每次10μg/100μl/小鼠，对照组用100μl PBS代替，于第0，2，4周免疫，共三次。

实施例16.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒诱导血清中和抗体滴度的测定

在第0天，第13天，第27天，第42天和第64天尾静脉取血，分离血清，用间接ELISA法测定中和抗体的滴度。方法如下：

1).用PBS稀释HPV16 L1N VLPs，浓度为0.2μg/100μl。向96孔ELISA板加入100μl HPV16 L1N VLPs包被液/孔，4℃过夜。

2).吸去包被液后，用0.05％PBST洗涤三遍。

3).每个孔加入200μl 5％BSA in 0.05％PBST，室温2小时。

4).吸去封闭液后，用0.05％PBST洗涤三遍。

5).用1％BSA in 0.05％PBST将待测免疫血清用不同比率进行稀释，每孔加入100μl稀释样品，室温2h。

6).吸去样品后，用0.05％PBST洗涤三遍。

7).每孔中加入100μl用1％BSA in 0.05％PBST以1/3000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1h。

8).吸去二抗后，用0.05％PBST洗涤五遍。

9).每孔中加入邻苯二胺(OPD)底物溶液100μl，37℃孵育5min(避光)。

底物用磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)

A液：柠檬酸1.92g加ddH₂O到100ml

B液：Na₂HPO₄·12H₂O 7.16g加ddH₂O到100ml

取2.43ml(A)+2.57ml(B)+5ml ddH₂O混合即为所需溶液。

加底物前新鲜配制：30％H₂O₂ 15μl+邻苯二胺4mg+9.985ml磷酸-柠檬酸缓冲液。

10).加入50μl 2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪测波长490nm处的光密度(OD)。

11).抗体滴度定义为：OD值是同比稀释度对照血清的2倍以上，而且OD值大于0.2。

结果如图8所示，HPV16L1N/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs均能有效的诱发小鼠产生高滴度的中和抗体，其中第三次免疫后两周，HPV16L1N/L2VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠的平均中和抗体滴度为507500和900000，第三次免疫后5周，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠的平均中和抗体滴度为289000和677500。HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs诱发中和抗体的长效保护水平正在监测中。与HPV16L1N/L2VLPs疫苗相比，含有L2-LTK63基因的L1N/L2-LTK63 VLPs疫苗可显著提高HPV16L1N/L2 VLPs特异的血清抗体滴度。

实施例17.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒诱导产生构象依赖的中和抗体的检测

用PBS稀释天然的HPV16 L1 VLPs和变性的HPV16 L1 VLPs(100℃变性5min)，浓度为0.2μg/100μl。向96孔ELISA板加入100μl天然的HPV16 L1 VLPs包被液/孔或变性的HPV16L1 VLPs包被液/孔，4℃过夜。用0.05％PBST洗涤三遍后用5％BSA-0.05％PBST封闭，加入1∶3000稀释的小鼠抗血清，室温孵育2h。0.05％PBST洗涤三遍后，加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1h。0.05％PBST洗涤五遍。每孔中加入邻苯二胺(OPD)底物溶液100μl，37℃孵育5min(避光)。加入50μl 2M H₂SO₄终止反应。用酶标仪测波长490nm处的光密度(OD)。

结果如图9所示，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs诱发产生的中和抗体均为构象依赖的，这些中和抗体能有效的结合天然的病毒样颗粒，而对变性的病毒样颗粒的结合能力很低。

实施例18.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒免疫小鼠脾细胞的制备

1).将小鼠引颈处死后，用70％酒精对小鼠进行消毒，取小鼠脾脏，放入装有3ml DMEM-5(DMEM，5％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，2mM L-glutamine)的直径为24mm的平皿中，用无菌的剪子将脾脏剪成小块，用注射器后柄以旋转方式将脾脏碾碎。

2).1500rpm离心10分钟，用10mlDMEM-5将细胞沉淀吹匀。垂直静置5～10分钟，吸取上层细胞悬液，以去除残留的结缔组织。

3).1500rpm离心10分钟后，加入4ml ACK(NH₄Cl 4g，KH₂PO₄ 0.05g，加ddH₂O至500ml)红细胞裂解液/脾脏，吹匀后，37℃孵育5mins，加入10ml DMEM-5。

4).1500rpm离心10分钟。如仍有红细胞，重复步骤3后离心。

5).用DMEM-5洗涤三遍，用10mlDMEM-5重悬细胞，计数。

实施例19.人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒免疫小鼠脾细胞的增殖试验

1).第三次免疫后3周，分离免疫小鼠的脾细胞。

2).实验于U型96孔板中进行：加入3×10⁵脾细胞/200μl/孔，刺激孔每孔加入2μg HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs，阴性对照孔不加VLPs，每个处理设3个重复。

3).37℃孵育72h后每孔加入50μl含有HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs和³H-TdR的完全培养基吹匀后，使得³H-TdR的量为1μCi/well，继续培养18h。

4).用多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，室温凉干，放于盛有5ml闪烁液(闪烁液：5g PPO+0.5g POPOP，溶于1000ml二甲苯中)的闪烁杯内，β闪烁计数仪测定cpm值。刺激指数(stimulating index，SI)的计算：SI＝抗原刺激管cpm均值/培养基对照管cpm均值。

结果如图10所示，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫小鼠的脾细胞在HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs刺激下能有效的发生增殖，平均刺激指数分别为3.950和6.241，均明显高于PBS对照组(平均刺激指数为1.037)，HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs与HPV16L1N/L2 VLPs相比能跟有效的诱导特异性脾淋巴细胞增殖。

实施例20.流式细胞术检测人乳头瘤病毒16型病毒样颗粒免疫小鼠的抗原特异性Th细胞

1).第三次免疫后6周，分离免疫小鼠的脾细胞。于96孔U型板中，加入1.2×10⁶脾细胞/200μl/孔，每孔加入2μg HPV16L1N/L2 VLPs或HPV16L1N/L2-LTK63cVLPs，每组设四个孔，其中两个孔用于检测CD4⁺/IL-4⁺Th细胞，另两个用于检测CD4⁺/IFN-γ⁺Th细胞。

2).37℃孵育72h后，每孔加入4μl经过1∶30稀释后的BD GolgiStop(BDBiosciences，货号554724)，37℃继续培养6-12h。

3).将细胞收于流式管中，用1ml staining buffer(PBS，1％胎牛血清)洗细胞一次，4℃，1500×g离心10min，将细胞重悬于200μl staining buffer。

4).每管加入4μl 0.5μg/μl 2.4G2(BD Biosciences.货号553142)，混匀后，冰浴30min。

5).用1ml staining buffer洗细胞一次，4℃，1500×g离心10min，将细胞重悬于100μl staining buffer。双阴性对照管细胞悬于500μl staining buffer，放置于4℃，等待上机检测。

6).在CD4单染，CD4/IL-4双染以及CD4/IFN-γ双染的100μl细胞悬液中加入4μl 0.5μg/μl FITC标记的大鼠抗小鼠CD4单抗(BD Biosciences.货号553651)，在IL-4单染和IFN-γ单染的100μl细胞悬液中加入4μl 0.5μg/μl FITC标记的大鼠IgG_2a，k同型对照抗体(BD Biosciences.货号554688)，混匀后，冰浴避光孵育30min。

7).用1ml staining buffer洗细胞两次，每次于4℃，1500×g离心10min。

8).离心后，用振荡仪将细胞块振荡分散，每管中加入250μl BDCytofix/Cytoperm溶液，混匀后，冰浴避光孵育30min。

9).用1ml 1×Perm/Wash溶液(将10×BD Perm/Wash溶液(货号554728)储存液用蒸馏水1∶10稀释)洗细胞两次，每次于4℃，1500×g离心10min。

10).离心后，用50μl 1×Perm/Wash溶液重悬细胞。CD4单染的50μl细胞悬液中加入5μl 0.2μg/μl PE标记的大鼠IgG1同型对照抗体(BD Biosciences.货号554685)，IFN-γ单染和CD4/IFN-γ双染的50μl细胞悬液中加入5μl 0.2μg/μl PE标记的大鼠抗小鼠IFN-γ单抗(BD Biosciences.货号554412)，IL-4单染和CD4/IL-4双染的50μl细胞悬液中加入5μl 0.2μg/μl PE标记的大鼠抗小鼠IL-4单抗(BD Biosciences.货号554435)。混匀后，冰浴避光孵育30min。

11).用1ml 1×Perm/Wash溶液洗细胞两次，每次于4℃，1500×g离心10min。

12).离心后将细胞重悬于500μl staining buffer，上机检测。

结果如图11和图12所示，HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫组CD4⁺/IFN-γ⁺Th1细胞分别为9300/3×10⁵脾细胞和13500/3×10⁵脾细胞，明显高于PBS对照组；同样HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫组CD4⁺/IL-4⁺ Th2细胞分别为1800/3×10⁵脾细胞和7500/3×10⁵脾细胞，明显高于PBS对照组。这说明HPV16L1N/L2 VLPs和HPV16L1N/L2-LTK63 cVLPs免疫后均能有效的诱发产生抗原特异性CD4⁺/IFN-γ⁺和CD4⁺/IL-4⁺的T细胞。与HPV16L1N/L2 VLPs疫苗相比，含有L2-LTK63基因的L1N/L2-LTK63 cVLPs疫苗可显著提高HPV16L1N/L2 VLPs特异CD4⁺/IFN-γ⁺和CD4⁺/IL-4⁺的T细胞数目。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>人乳头瘤病毒16型外壳蛋白病毒样颗粒及其制备方法和用途

<130>

<160>3

<170>Patent In version 3.3

<210>1

<211>1518

<212>DNA

<213>人乳头瘤病毒16型(HPV16L1N)

<400>1

atgtccctgt ggctgccctc cgaggccacc gtgtacctgc cccccgtgcc cgtgtccaag    60

gtggtgtcca ccgacgagta cgtggctcgc accaacatct actaccacgc tggtacctcc    120

cgcctgctgg cagttggaca tccctatttt cctattaaaa aacctaacaa taacaaaata    180

ttagttccta aagtatcagg attacaatac agggtattta gaatacattt acctgacccc    240

aataagtttg gttttcctga cacctcattt tataatccag atacacagcg gctggtttgg    300

gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat tagtggccat    360

cctttattaa ataaattgga tgacacagaa aatgctagtg cttatgcagc aaatgcaggt    420

gtggataata gagaatgtat atctatggat tacaaacaaa cacaattgtg tttaattggt    480

tgcaaaccac ctatagggga acactggggc aaaggatccc catgtaccaa tgttgcagta    540

aatccaggtg attgtccacc attagagtta ataaacacag ttattcagga tggtgatatg    600

gttgatactg gctttggtgc tatggacttt actacattac aggctaacaa aagtgaagtt    660

ccactggata tttgtacatc tatttgcaaa tatccagatt atattaaaat ggtgtcagaa    720

ccatatggcg acagcttatt tttttattta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta    780

tttaataggg ctggtgctgt tggtgaaaat gtaccagacg atttatacat taaaggctct    840

gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt    900

acctctgatg cccaaatatt caataaacct tattggttac aacgagcaca gggccacaat    960

aatggcattt gttggggtaa ccaactattt gttactgttg ttgatactac acgcagtaca    1020

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cgtgttaatt ttggtgtgat tgatgaacga ttacatcgta acagggaata tagagaccgg    1920

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ccggatcacc aagcttggag agaagaaccc tggattcatc atgcaccaca aggttgtgga    2040

aattcatcaa gaacaatcac aggtgatact tgtaatgagg agacccagaa tctgagcaca    2100

atatatctca gggaatatca atcaaaagtt aagaggcaga tattttcaga ctatcagtca    2160

gaggttgaca tatataacag aattcgggat gaattaatga acaaagtaaa atgttatgtt    2220

ttatttacgg cgttactatc ctctctatat gcacacggag ctccccagac tattacagaa    2280

ctatgttcgg aatatcgcaa cacacaaata tatacgataa atgacaagat actatcatat    2340

acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg gttatcatta catttaagag cggcgaaaca    2400

tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat atagactccc agaaaaaagc cattgaaagg    2460

atgaaggaca cattaagaat cacatatctg accgagacca aaattgataa attatgtgta    2520

tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg gcaatcagta tggaaaacta a             2571

<210>3

<211>856

<212>PRT

<213>融合蛋白L2-LTK63

<400>3

MRHKRSAKRT KRASATQLYK TCKQAGTCPP DIIPKVEGKT IADQILQYGS MGVFFGGLGI     60

GTGSGTGGRT GYIPLGTRPP TATDTLAPVR PPLTVDPVGP SDPSIVSLVE ETSFIDAGAP    120

TSVPSIPPDV SGFSITTSTD TTPAILDINN TVTTVTTHNN PTFTDPSVLQ PPTPAETGGH    180

FTLSSSTIST HNYEEIPMDT FIVSTNPNTV TSSTPIPGSR PVARLGLYSR TTQQVKVVDP    240

AFVTTPTKLI TYDNPAYEGI DVDNTLYFSS NDNSINIAPD PDFLDIVALH RPALTSRRTG    300

IRYSRIGNKQ TLRTRSGKSI GAKVHYYYDL STIDPAEEIE LQTITPSTYT TTSHAASPTS    360

INNGLYDIYA DDFITDTSTT PVPSVPSTSL SGYIPANTTI PFGGAYNIPL VSGPDIPINI    420

TDQAPSLIPI VPGSPQYTII ADAGDFYLHP SYYMLRKRRK RLPYFFSDVS LAAASGGGGS    480

GGGGSGGGGS TMNGDRLYRA DSRPPDEIKR SGGLMPRGHN EYFDRGTQMN INLYDHARGT    540

QTGFVRYDDG YVSTKLSLRS AHLAGQSILS GYSTYYIYVI ATAPNMFNVN DVLGVYSPHP    600

YEQEVSALGG IPYSQIYGWY RVNFGVIDER LHRNREYRDR YYRNLNIAPA EDGYRLAGFP    660

PDHQAWREEP WIHHAPQGCG NSSRTITGDT CNEETQNLST IYLREYQSKV KRQIFSDYQS    720

EVDIYNRIRD ELMNKVKCYV LFTALLSSLY AHGAPQTITE LCSEYRNTQI YTINDKILSY    780

TESMAGKREM VIITFKSGET FQVEVPGSQH IDSQKKAIER MKDTLRITYL TETKIDKLCV    840

WNNKTPNSIA AISMEN                                                    856。