超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂及其制备

摘要

本发明涉及超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，包括由超顺磁性的四氧化三铁纳米颗粒外包葡聚糖构成载体及c－erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段，所述反义寡核苷酸与所述载体中的葡聚糖以共价键连接。本发明还涉及制备所述对比剂的方法。本发明将分子生物学领域的反义基因技术用于影像诊断学中，把两种先进技术的优点和特异性结合起来，最大限度地增加探针的靶/非靶比值，经过磁共振扫描可显示出肿瘤的大小、部位和与相邻结构的解剖关系，从而建立起一种基因水平的早期、特异性诊断肿瘤的成像新方法。本发明对比剂可以用于多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌和头颈部鳞癌的早期影像诊断。

说明书

技术领域

本发明涉及医疗检测试剂技术领域，尤其是涉及一种在磁共振成像中能特异性使肿瘤成像的癌基因靶向对比剂及其制备方法。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类健康的常见病及多发病，并呈逐年上升趋势，而对恶性肿瘤的早期、特异性诊断是提高患者生存率、改善生活质量的关键所在。传统的影像诊断方法，主要针对肿瘤形成实质性肿块后的成像，但此时患者已经处于临床中晚期阶段，治疗效果不佳，预后差；此外，目前用于磁共振成像的对比剂钆离子属于细胞外非特异性对比剂，在人体内停留时间短，不能针对只有癌基因扩增而没有形成实质性肿块的早期肿瘤成像。

反义基因是指与靶基因互补的核酸序列。反义基因技术采用癌基因的DNA或mRNA作为靶序列，人工合成互补于该靶序列的13-20mer单链反义寡核苷酸，它可与该靶序列产生特异性结合。用超顺磁性氧化铁标记癌基因的反义寡核苷酸，制成反义寡核苷酸探针对比剂，引入体内的对比剂能按碱基互补原则与癌基因的DNA或mRNA特异结合，所以该对比剂能特异地分布在癌基因扩增和过度表达的肿瘤组织中。由于超顺磁性氧化铁能造成组织的T₂加权像信号显著降低，磁敏感效应大大超过细胞本身所占据的空间，可明显增加磁共振对于细胞的发现率，产生较强的T₂负性对比效应，所以用磁共振成像方法，就可诊断出肿瘤的存在和大小。理论上反义癌基因成像可探测出只有癌基因扩增和过度表达还没有形成实体的肿瘤组织，因此可实现肿瘤的早期诊断。

1978年，哈佛大学的Zamecnik P和Stephenson M通过研究发现，人工合成的互补于劳斯肉瘤病毒RNA的13-mer单链寡聚核苷酸，它可与病毒的RNA特异结合，阻断基因表达，成功地抑制了病毒在培养细胞中的生长，首次提出了“ 反义核酸介导基因抑制”的概念。

c-erbB2癌基因是neu基因在人类的同源基因，又称HER-2或MAC17基因，位于人17q21，编码细胞膜磷酸糖蛋白，相对分子质量为185000，其扩增和表达只限于肿瘤组织中。不少研究已经证明，c-erbB2癌基因在多数肿瘤中均存在扩增和过度表达现象，其中研究最多的是在乳腺癌中的扩增和过度表达，其次发现在胃肠癌、头颈部肿瘤、肺癌、唾液腺癌、妇科肿瘤、前列腺癌、膀胱移行细胞癌等都有扩增和过度表达出现；除此之外，该基因还与肿瘤组织的病理分级、淋巴结转移、临床分期密切相关，并能作为临床化疗方案选择、放化疗预后判断的主要指标。因此在常见的肿瘤性病变中，c-erbB2癌基因为导向治疗和导向诊断提供了良好的靶位，一旦出现扩增和过度表达，都会使细胞mRNA的含量增加，相应结合的靶向位点也同样增加。

与上述c-erbB2癌基因对应的反义寡核苷酸片段的确定是这样的：通过统计学推算，以细胞中一条核苷酸含有4种不同的碱基，单倍体人基因组约含3×10⁹个碱基计算，则17～18bp的DNA只有一次出现的机会，这对于人类基因组来说具有唯一性和高度特异性，并能较好地接近基因靶位。所以，当反义寡核苷酸少于15bp时，则不能显示反义活性。在本实验中，反义寡核苷酸的长度选择15mer，可以反应出c-erbB2癌基因的特性。目前有利用该片段进行肿瘤恶性程度检测、特别是乳腺癌检测的报道。

发明内容：

本发明的目的是利用反义寡核苷酸探针对比剂与癌基因的mRNA能特异性结合来实现靶向显影。提供一种特异性、选择性、增强效果好，且使用安全的超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，将分子生物学领域的反义基因技术用于影像诊断学中，经过磁共振扫描可显示出肿瘤的大小、部位和与相邻结构的解剖关系。本发明的另一目的是提供制备所述对比剂的方法。

为实现上述目的而采用的技术方案是这样的：即一种超顺磁性氧化铁标记的反义寡核苷酸探针对比剂，包括由超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒外包葡聚糖构成的载体及c-erbB2，癌基因的反义寡核苷酸片段，所述反义寡核苷酸与所述载体中的葡聚糖共价键连接。

上述c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的核苷酸序列为：CTCCATGGTGCTCAC。

上述载体的粒径为20～35nm，对比剂的粒径为25～40nm。

上述载体中，纯化后超顺磁性四氧化三铁与葡聚糖的重量份数比为1∶3～8，对比剂中，经纯化后载体与c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸的重量份数比为6～10∶1。

上述对比剂的磁学参数为：T₂弛豫率为(0.156～0.163)×10⁶mol^-1·sec^-1，饱和磁化强度为69～71emu/g Fe，比饱和磁化强度68～70emu/g，比剩余磁化强度为25～31emu/g，剩磁为15～20Gs。

上述葡聚糖选自葡聚糖T-10或葡聚糖T-40。

为实现本发明的第二目的而采用的技术方案是这样的，即一种所述对比剂的方法：包括如下的步骤：

(1).载体的制备：采用共沉淀一步法完成，合成四氧化三铁的反应原理为：Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O；在合成四氧化三铁的同时加入葡聚糖，获得所述外包葡聚糖的四氧化三铁载体；

(2).对寡核苷酸序列为CTCCATGGTGCTCAC的c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的合成；

(3).对比剂的合成：具体步骤为：纯化步骤(1)获得的外包葡聚糖的四氧化三铁载体：取所述载体过柱后；加入相当于载体1/5的氧化剂，如0.1M高碘酸钠，使载体中的葡聚糖的羟基氧化为醛基，能与c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的氨基反应形成席夫碱(sciff base)，从而产生共价结合；取混合物置于摇床，200r/min，25℃，30min；将氧化的四氧化三铁载体置于0.9％生理盐水中透析2～3h，再置于20mM碳酸氢钠缓冲液(pH＝6.0)透析1h，得到无高碘酸钠的四氧化三铁载体溶液；取步骤(2)获得的c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸溶于同体积的超纯水中，将已透析好的氧化的四氧化三铁载体溶液加入其中，置于摇床上振摇，200r/min，25℃，24h，得到对比剂初步产物；取相当于载体2/5的1M硼氢化钠(还原剂)溶液加入初步产物溶液中，振摇30min室温，得到对比剂终产物；再将其置于0.9％生理盐水中透析，高效液相凝胶柱过滤，即得到本发明的纯化的对比剂。对比剂装入EP管，置4℃冰箱保存。

上述步骤(1)载体制备的共沉淀一步法是：将三氯化铁和二氯化铁按摩尔比接近2∶1混合后加入葡聚糖，冲氮条件下搅拌并加入氨水及超纯水，保持PH值为碱性(大于9.2)；之后在恒温磁力搅拌器中以800转/min、温度65℃的条件反应1h，加入适量冰乙酸，调节PH值；再将反应物1200转/min离心15min，取上清液，超纯水稀释100倍，放置透析袋过滤24h，0.22μm滤膜再过滤，超声振荡5min，高效液相色谱纯化，得到黑褐色的外包葡聚糖的四氧化三铁载体，密封并分装于5ml西林瓶中备用。

本发明获得的对比剂通过实验，将其引入癌细胞或荷瘤鼠体内。由于能与肿瘤细胞的mRNA特异结合，可使对比剂更多地分布到细胞或活体肿瘤组织中，增加了靶/非靶比值；加之磁共振成像具有成像时间窗更长，空间与时间分辨力高，对比度好等优点，扫描引入本发明对比剂的细胞或荷瘤鼠，得到了解剖结构清晰、信噪比高、对比度好的磁共振图像，从图像上不仅可以看到肿瘤病灶的大小、部位、与周围结构的解剖关系和信号强度改变，还可动态观察标记细胞的生长、迁徙过程。所以，反义癌基因磁共振成像可检测出只有癌基因扩增和过度表达还没有形成实体的肿瘤组织，因此可实现肿瘤的早期特异性诊断。

附图说明

本发明的内容可以通过附图进一步说明；

本发明有如下附图：

附图1为本发明对比剂的合成原理示意图；

附图2为本发明对比剂检测方法中的聚丙烯酰胺凝胶电泳图：图中5个点样孔从左至右顺序为：第1、2孔为反义寡核苷酸标准品1ug、3ug，第3孔为本发明的对比剂，第4、5孔为载体与反义寡核苷酸混合物。从图中可以看出，本发明对比剂纯化度高，性质稳定。

附图3为本发明对比剂检测方法中的高效液相凝胶色谱图：其中图A为反义寡核苷酸标准品图谱，图B为载体图谱，它们的峰型良好，无杂峰干扰。图C为载体与反义寡核苷酸混合物，二者完全分离，且峰型良好，无拖尾现象，回收率100％，证明本实验采用的凝胶柱可用于对比剂与游离反义寡核苷酸的分离。图D为本实验对比剂图谱，显示对比剂中已无游离的反义寡核苷酸，其联结率达100％；

附图4为本发明对比剂检测方法中的原子力显微镜形貌图：图中可以看出，反义寡核苷酸紧密联结于载体表面，并整齐排列；标注的两条白色链即为两条对比剂单链；

附图5为本发明对比剂的磁化曲线；

附图6为本发明对比剂标记肿瘤细胞(Hela细胞)后，普鲁士蓝染色的光学显微镜下观察图(放大40倍)；

附图7为本发明对比剂用于磁共振细胞成像图：1为蒸馏水，2为不含对比剂的培养基，3为本发明对比剂标记的Hela细胞，4为含有对比剂的培养基，5为未标记的Hela细胞。该系列图提示，本发明对比剂能产生较强的T₂负性对比效应；

附图8为本发明对比剂用于磁共振肿瘤活体成像图：为荷瘤鼠横断位扫描图像，该图像解剖结构清晰、信噪比高、对比度好。图像不仅能清楚显示荷瘤鼠左前方肿瘤病灶的大小及与周围结构的解剖关系，还可看到肿瘤病灶信号明显降低，与相邻组织的信号存在明显差别。

具体实施方式

实施例1制备方法

本发明对比剂的一个非限定性的制备方法：包括如下步骤：

(1).载体的制备：采用共沉淀一步法完成，合成四氧化三铁的反应原理为：Fe²⁺+2Fe³⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O；在合成四氧化三铁的同时加入葡聚糖，获得所述外包葡聚糖的四氧化三铁载体；

(2).对寡核苷酸序列为CTCCATGGTGCTCAC的c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的合成。实施例中的所述反义寡核苷酸由上海生工有限司提供。

(3).对比剂的合成：具体步骤为：纯化步骤(1)获得的外包葡聚糖的四氧化三铁载体：取所述载体过柱后的250μL；加入0.1M高碘酸钠10μL，使载体中的葡聚糖的羟基氧化为醛基，能与c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸片段的氨基反应形成席夫碱(sciff base)，从而产生共价结合；取混合物置于摇床，200r/min，25℃，30min；将氧化的四氧化三铁载体置于0.9％生理盐水中透析2～3h，再置于20mM碳酸氢钠缓冲液(pH＝6.0)透析1h，得到无高碘酸钠的四氧化三铁载体溶液；取步骤(2)获得的c-erbB2癌基因的反义寡核苷酸100μL约33μg溶于100μL超纯水中，将已透析好的氧化的四氧化三铁载体溶液加入其中，置于摇床上振摇，200r/min，25℃，24h，得到对比剂初步产物；取相当于载体2/5的1M硼氢化钠(还原剂)溶液加入初步产物溶液中，振摇30min室温，得到对比剂终产物；再将其置于0.9％生理盐水中透析，高效液相凝胶柱过滤，即得到本发明的纯化的对比剂。对比剂装入EP管，置4℃冰箱保存。

上述步骤(1)载体制备的共沉淀一步法是：将三氯化铁1.14g和二氯化铁0.43g按摩尔比接近2∶1混合后加入葡聚糖T-40 2.5g，冲氮条件下搅拌并加入氨水4ml及超纯水11ml，保持PH值为大于9.2；之后在恒温磁力搅拌器中以800转/min、温度65℃的条件反应1h，加入适量冰乙酸，调节PH值；再将反应物1200转/min离心15min，取上清液，超纯水稀释100倍，放置透析袋过滤24h，0.22μm滤膜再过滤，超声振荡5min，高效液相色谱纯化，得到黑褐色的外包葡聚糖的四氧化三铁载体，密封并分装于5ml西林瓶中备用。

实施例2生物及物理性质检测：

参见附图2，图中5个点样孔从左至右顺序为：第1、2孔为反义寡核苷酸标准品1ug、3ug，第3孔为本发明的对比剂，第4、5孔为载体与反义寡核苷酸混合物。从图中可以看出，本发明对比剂纯化度高，性质稳定。

参见附图3，其中图A为反义寡核苷酸标准品图谱，图B为载体图谱，它们的峰型良好，无杂峰干扰。图C为载体与反义寡核苷酸混合物，二者完全分离，且峰型良好，无拖尾现象，回收率100％，证明本实验采用的凝胶柱可用于对比剂与游离反义寡核苷酸的分离。图D为本实验对比剂图谱，显示对比剂中已无游离的反义寡核苷酸，其联结率达100％；

参见附图4，图中可以看出，反义寡核苷酸紧密联结于载体表面，并整齐排列；标注的两条白色链即为两条对比剂单链；

实施例3磁学性质检测：

参见附图5 通过振荡样品磁强计和磁共振检测，样品的饱和磁化虽度为69.32875emu/g Fe，比饱和磁化强度68.41215emu/g，比剩余磁化强度为30.4753emu/g，剩磁为19.25782Gs，驰豫率为0.154×10⁶mol^-1·sec^-1。磁化曲线为一条过原点的单一曲线，说明本发明对比剂具有超顺磁性。

实施例4稳定性检测：

参照2005年3月我国制定的《化学药物稳定性研究技术指导原则》(编号【H】GPH6-1)，在高温、光照、加速和1年期常温条件下观察本对比剂的性状、pH值、铁浓度、粒径、饱和磁化强度及T₂磁豫率等参数，发现其稳定性好。

实施例5急性毒理实验：

按照我国2005年版《化学药物急性毒性试验技术指导原则》(编号：【H】GPT1-1)，分别按总剂量为2104.8mg/kg，给药容积40ml/kg口服灌胃；总剂量为438.5mg/kg，给药容积25ml/kg静脉注射；以及总剂量为1578.6mg/kg，给药容积30ml/kg腹腔注射这三种方式，连续观察14d，记录昆明小鼠急性毒理反应、主要脏器的病理学改变和血清主要生化指标改变。结果显示，各组小鼠均未出现死亡；肝、脾、肾心、肺、骨髓等主要脏器未见明显病理改变，仅肝、脾内分布少许蓝色铁颗粒；各组生化指标无明显差异。说明本发明对比剂为实际无毒级化合物。

实施例6一般药理学研究：

在体内符合二室模型，半衰期3.22h，血浆蛋白结合率10.93％，细胞返流比率低(21.81％)；瘤/血比值为(3.44～4.29)±0.61，瘤/肌肉比值为14.02±6.06，有显著性差异(P＜0.05)。注射本发明对比剂后，随着时间的增加，在各个时间点与对照组相比，对比剂主要分布在肝、脾和循环系统内，且在小鼠肝脏、脾脏、肾脏内的含量先快速增高后，1h后达到最高，再逐渐降低。10min、30min、1h、2h、3h、6h注射组与对照组有统计学意义(P＜0.01)。6h时与对照组相比较，肝脏、脾脏与肾脏均无差别；而心脏在给予本对比剂10min时达到最高，随着时间延长而逐渐降低，6h时基本上达到了正常水平；其余组织内对比剂的分布极少。

实施例7磁共振细胞成像：

本发明对比剂标记肿瘤细胞(Hela细胞)，普鲁士蓝染色可见铁颗粒位于细胞浆内(如图6)，滞留时间明显延长；标记后细胞的活力、凋亡指数、生长曲线与未标记细胞无统计学差异。

细胞成像：与未标记细胞相比，本发明对比剂标记细胞于T₁W时信号强度平均上升21.56％，T₂WI时信号强度平均下降51.71％，T₂*WI时信号强度平均下降57.64％。未标记细胞和标记细胞的T₂分别为515ms和75ms，弛豫率R₂分别为1.89/s、13.02/s；T₂*分别为110.7ms和22.6ms，其弛豫率R₂*分别为9.09/s及44.52/s。标记细胞的R₂及R₂*分别约增强了5倍及4倍。所以，本发明对比剂能够有效标记肿瘤细胞，明显提高标记细胞的₂及R₂*，T₂WI和T₂*WI序列对显示标记细胞与未标记细胞间的信号差异较敏感。

实施例8磁共振活体成像

注射本发明对比剂行增强扫描发现，所有扫描序列均显示荷瘤鼠肿瘤的信号强度较平扫有不同程度的下降，肿瘤病灶对比噪声比明显高于平扫期。增强扫描的GRET₂*W序列中，病灶的比噪声比明显高于其它序列，但增强后TSE T₂W和常规SE T₂WI序列在显示病变信噪比、比噪声比方面没有显著性差异。可见，注射本发明对比剂行磁共振增强检测肿瘤病灶的各种序列中，以GRE T₂*WI最为敏感，其次是双回波的T₂WI+PDWI序列。

在本发明对比剂增强的T₂WI及T₁WI序列上，正常组织信号降至周围噪声水平的剂量分别为10μmol Fe/kg及40μmol Fe/kg，以20μmol Fe/kg剂量，增强T₂WI序列肿瘤/组织的比噪声比最好，几乎是增强T₁WI及平扫T₂WI的2倍，检出率达到大体病理水平；而平扫T₂WI的比噪声比最差。

小结：本发明超顺磁性氧化铁标记的c-erbB2癌基因反义寡核苷酸对比剂，具有标记率高、稳定性好、细胞摄取率高、生物性能良好等优点。体内分布以肝、肾较多，肿瘤组织摄取高，注入后即可保证磁共振成像获得成功。因此，本发明对比剂可望为肿瘤的早期诊断提供一种新的基因成像方法。

本发明将分子生物学领域的反义基因技术用于影像诊断学中，把两种先进技术的优点和特异性结合起来，最大限变地增加探针的靶/非靶比值，经过磁共振扫描可显示出肿瘤的大小、部位和与相邻结构的解剖关系，从而建立起一种基因水平的早期、特异性诊断肿瘤的成像新方法。

本发明对比剂可以用于多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、食道癌和头颈部鳞癌的早期影像诊断。