用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法

摘要

本发明涉及用种子类原球茎(PLBs)培育四倍体秋石斛兰新品种的方法。采用人工授粉后胚龄的未成熟秋石斛兰种子，在1/2MS液体培养基中进行非共生萌发培养60天，换入含有0.02％Oryzalin的1/2MS液体培养中处理后转入1/2MS固体培养基上继续培养，直至秋石斛兰苗形成，按常规的方法进行秋石斛兰栽培移植和管理，直至开花。本发明可以克服通常多倍体诱变频率低的缺点，具更好的欣赏性。方法简单易行，而且大幅度地提高了多倍体诱变频率(60％以上)，一次就可获得足够数量的多倍体群体(数百株以上)，供选种之用，应用价值高。本发明可以规模化生产，具有投入少，产出高的优势。

说明书

技术领域

本发明涉及兰花新品种的培育方法，特别是用种子类原球茎(PLBs)培育四倍体秋石斛兰新品种的方法。

背景技术

秋石斛兰(Dendrobiumsp.)又称蝴蝶石斛，多是以原产于新几内亚的热带原生种蝴蝶石解(DendrobiumPhalaenopsis)为亲本育成的杂交品种。秋石斛兰是一种新型的高档切花兰花品种，具有很高的欣赏性，市场需求量较大，在国际和国内花卉产业中占有重要地位。近年我国大陆引进了不少秋石斛兰品种。但是，迄今为止，国内外秋石斛兰花均为二倍体品种，尚未见多倍体秋石斛兰花的报道。多倍化后最直接的效应是植物的根、茎、叶、和花的变大，因此，多倍化育种在观赏园艺中是最有效的育种方法之一，通过多倍体育种可以获得大花型兰花新品种。

发明内容

本发明的目的是提供一种用种子类原球茎(PLBs)培育四倍体秋石斛兰新品种的方法，可以克服通常多倍体诱变频率低的缺点。方法简单，而且大幅度地提高了多倍体诱变频率高，供选种之用，应用价值高。

本发明提供的一种用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法包括以下步骤：采用人工授粉后胚龄的未成熟秋石斛兰种子，在1/2MS液体培养基中进行非共生萌发培养，在培养60天后，换入含有0.02％Oryzalin(C₁₂H₁₈N₄O₆S)的1/2MS液体培养中处理，后转入1/2MS固体培养基上，光照下，继续培养，直至秋石斛兰苗形成，按常规的方法进行秋石斛兰栽培移植和管理，直至开花。

本发明提供的一种用种子类原球茎诱导四倍体秋石斛兰新品种的方法包括以下步骤：

1)秋石斛兰的人工授粉：秋石斛兰按常规方法进行栽培管理，在开花后的5～10天进行人工授粉，授粉后的秋石斛兰，放在通风、半透光条件下进行管理，温度保持在15～20℃，湿度30～50％，防止落花、落果。

2)秋石斛兰种子非共生萌发培养：在人工授粉后150～180天，当秋石斛兰蒴果发育正常(如图1所示)，取秋石斛兰种子，用剪刀剪下蒴果(用消过毒的解剖刀)，在超净工作台内用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，沿果实纵轴方向切开，将秋石斛兰种子接种在1/2MS液体培养基中振动或静止非共生萌发培养；

3)秋石斛兰多倍体诱导：将非共生萌发的秋石斛兰种子转入含有0.02％Oryzalin(C₁₂H₁₈N₄O₆S)的1/2MS液体培养基中，诱变处理。

4)秋石斛兰多倍体幼苗培养：将诱变处理后的秋石斛兰种子转入1/2MS固体培养基上继续培养，直至秋石斛兰苗形成。

5)秋石斛兰苗多倍体的鉴定：在瓶苗移栽时，按株编号，分别取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中，前处理4小时，后转入甲醇∶冰醋酸(3∶1，体积)固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用；用压片法制备染色体标本，用卡宝品红染色液染色，显微镜观察染色体数目，选取染色体数目为2n＝76的幼苗，是加倍成功的同源四倍体秋石斛幼苗；其他染色体数目的幼苗为非整倍体，不是加倍成功的四倍体，不能使用。

6)四倍体秋石斛兰的栽培管理：将加倍成功的秋石斛兰苗，进行移植，待瓶苗长至3-4片叶时，将瓶盖打开，进行练苗3-5天，然后用清水轻轻地冼净培养基，将瓶苗移栽在兰花土+火烧土+松针土(重量比为1∶1∶1)基质中，放在阴凉处，按常规的秋石斛兰进行栽培管理，防止病虫害，直至开花。

步骤1)在秋石斛兰花开花5～10天内进行人工杂交授粉，取自花或同株异花花粉进行授粉。

步骤2)所述的非共生萌发培养是在黑暗或弱光下，室温25～27℃条件下进行非共生萌发培养60天。

步骤3)所述的诱变处理是在培养60天后，当种子类原球茎(PLBs)发育成球形时，即原胚期，进行多倍体诱变处理150-180小时。可显著地提高了多倍诱变频率，可以获得大量四倍体秋石斛兰苗。

步骤4)所述的继续培养是在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温25～27℃条件下进行。

步骤5)所述的移植方法：待瓶苗长至3-4片真叶后，打开瓶盖进行练苗3-5天，然后用清水轻轻地洗去培养基，移栽在兰花土+火烧土+松针土(重量比为1∶1∶1)基质中，放在阴凉处，按一般石斛兰花进行精心管理，防止病虫害。

本发明提供的一种用种子类原球茎(PLBs)培育四倍体秋石斛兰新品种的方法，可以克服通常多倍体诱变频率低的缺点。四倍体秋石斛兰根、茎、叶和花等都明显大或高于原二倍体秋石斛兰，苗壮，种苗品质好，具更好的欣赏性。本发明在秋石斛兰种子非共生萌发培养的基础上，在种子类原球基(PLBs)时期，用低浓度Oryzalin，进行较长时间处理(150～180小时)，不但方法简单易行，而且大幅度地提高了多倍体诱变频率(60％以上)，一次就可获得足够数量的多倍体群体(数百株以上)，供选种之用，应用价值高。本发明可以规模化生产，具有投入少，产出高的优势。

附图说明：

图1：秋石斛兰开花与授粉；

图2：人工授粉后发育正常的朔果；

图3：非共生萌发培养秋石斛兰种子；

图4：多倍体诱导时期种子原球茎；

图5：加倍成功的多倍体秋石斛兰幼苗；

图6：四倍体秋石斛兰染色体(2n＝76)；

图7：四倍体秋石斛兰幼苗。

具体实施方式

本发明可以通过以下实例得到具体体现出来，但它不会对本发明作任何限制。

实施例

2003年10月初从山东省兖州三益公司购入秋石斛兰，于当年10目16日进行同株异花人工授粉，授粉后的秋石斛兰放在20～25℃，自然光照条件下，至2004年6月22日(246天)，剪下蒴果，在超净工作台内，先用75％酒精消毒1分钟，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌蒸馏水冲洗5遍，沿蒴果纵轴方向，用无菌解剖刀将蒴果切开，将秋石斛种子接种在1/2MS液体培养基中，在20～25℃条件下，间歇振荡培养。在培养60天后，转入含有0.02％Oryzalin(氨磺灵)的1/2MS液体培养基中，诱变处理150～180小时，后转入1/2MS固体培养基上，在光周期14小时/天，光强度3000Lux，室温20～25℃条件下继续培养，直至秋石斛兰幼苗分化。在瓶苗移栽时，按株分别取新生长的根尖，放入对二氯代苯饱和水溶液中前处理4小时，后将根尖放入体积比为3∶1甲醇∶冰醋酸固定液中固定4小时以上，4℃冰箱中保存备用。用压片法制备染色体标本，卡宝品红染色液染色，显微镜观察，染色体数目2n＝76的幼苗为加倍成功的四倍体秋石斛兰幼苗，其他染色体数目的幼苗为非整倍体，不能使用。四倍体秋石斛兰幼苗，按一般二倍体秋石斛兰进行栽培管理，直至开花。实验结果见图1-7。