一种在有机溶剂中酶催化合成β－内酰胺抗生素的方法

摘要

本发明公开了一种在有机溶剂中酶催化合成β－内酰胺抗生素的方法，包括将β－内酰胺母核、酰化试剂和有机溶剂混合，加入青霉素酰化酶后在－10～45℃反应1～36小时，青霉素酰化酶在反应体系中的浓度为30～300U IU/ml。本发明方法可以有效抑制青霉素酰化酶的水解活性，从而降低酰化试剂的水解和产物的水解程度。与使用水作为介质的方法相比，本发明方法的合成/水解比值得到了很多提高，也可以更有效地实现过量的酰化试剂的回收利用，降低生产成本。β－内酰胺抗生素的产率得以提高。由于水解等副反应受到抑制，副产物减少，β－内酰胺抗生素的分离过程得到简化。

说明书

技术领域

本发明涉及β-内酰胺抗生素的制备方法。尤其涉及一种在有机溶剂中酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法。

背景技术

现在，工业上半合成的β-内酰胺抗生素如氨苄西林、阿莫西林、头孢克洛、头孢氨苄及头孢羟氨苄都是以化学方法制备，反应过程中涉及到侧链的保护、羧基的活化、缩合反应、和侧链的去保护等步骤，因此生产过程化学反应步骤多，三废排放量大，环境污染严重。

近几年来，已有很多文献报道采用酶法来制备β-内酰胺抗生素。采用酶法制备β-内酰胺抗生素的优点是，反应步骤简单，反应条件温和，避免各种保护试剂和有毒溶剂，环境污染小。

JH Zhu，DZ Wei，XJ Cao，YQ Liu and ZhY Yuan的文章“Partitioningbehaviour of cephalexin and 7-aminodeacetoxicephalosporanic acid inPEG/ammonium sulfate aqueous two-phase systems”(《J.Chem.Technol.Biot.》2000，76，1194-1200)和DZ Wei，JH Zhu，XJ Cao的文章“Enzymaticsynthesis of cephalexin in aqueous two-phase systems”(《Biochem.Eng.J.》2002，11，95-99)分别报道了在PEG 400/硫酸铵的双水相体系、水-40％乙二醇体系中酶催化合成头孢氨苄和头孢克洛的方法。

公开号为CN1207742的中国专利申请中公开了一种酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法，该方法在β-内酰胺抗生素从反应混合物回收后，利用反应水溶液中青霉素酰化酶对剩余母液中抗生素的水解作用，将抗生素分解为其起始化合物，特别是β-内酰胺核，从而实现β-内酰胺核的回收、循环利用。

专利申请WO9920786公开了一种酶催化合成头孢菌素的方法，将底物母核通过pH调节，使其达到过饱和浓度，在青霉素酰化酶作用下，与相应侧链酰胺缩合，得到产品。这种方法比不将底物母核调到过饱和浓度，转化率高10％左右，侧链与母核摩尔比不大于2.5。

美国发明专利US6048708公开了一种酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法，该方法使抗生素母核与酰基供体的浓度在反应过程中一直保持在饱和浓度的70％甚至85％以上，反应至少5个小时，能够提高母核的转化率。

另外，文献CN1265706，CN1144274，CN1572873，WO9704086和US5525483分别公开了涉及到水溶液介质中高底物浓度下，以及新的固定化青霉素G酰化酶催化下合成β-内酰胺抗生素的方法。

在上述方法中，反应介质大多采用具有一定pH值的水溶液，或者添加少量有机溶剂的水相体系。由于青霉素G酰化酶在水相介质中存在较明显的水解作用，导致生成的β-内酰胺抗生素以及采用酯或酰胺活化的侧链不可避免的会分解成β-内酰胺母核和相应的侧链酸。合成的效率高低可以用合成/水解比值(S/H：合成产物的量与水解产生的侧链酸的量之比)来评价，这两个反应可以用青霉素类抗生素作为示例图解如下：

R1=H：氨苄西林

R1=OH：阿莫西林

非水相酶催化方法是近年来研究的热点，将非水相介质引入到β-内酰胺类抗生素酶催化合成中可以增加底物的溶解度，降低反应介质中水的活性，有效抑制酰基供体侧链和产物的水解，从而提高合成产率。如C B.Park，S B Lee，D D.Ryu的文章“Penicillin acylase-catalyzed synthesis of cefazolinin water-solvent mixtures：enhancement effect of ethyl acetate and carbontetrachloride on the synthetic yield”(《J.Mol.Catal.B：Enz》2000，9(4-6)，275-281)提到在30％(v/v)的醋酸乙酯或四氯化碳的水相反应体系中头孢唑啉酶催化合成的产率分别提高了65％和56％。美国专利US5268271公开了基于热力学控制策略(即侧链酸没有经过活化，缩合反应的副产物是水)，水-有机共溶非极性体系中的半合成抗生素酶催化合成，其中有机溶剂浓度30-90％，虽然含的水量较大(超过10％)，但是仍然取得了较好的效果。

但是由于反应体系含的水量较大，反应过程中酰基供体侧链和产物的水解仍然难以控制，产率有待于进一步提高。

发明内容

本发明提供一种收率高，副产物少的利用青霉素酰化酶催化制备β-内酰胺抗生素的方法。

一种在有机溶剂中酶催化合成β-内酰胺抗生素的方法，包括将β-内酰胺母核、酰化试剂和有机溶剂混合，加入青霉素酰化酶后在-10～45℃反应1～36小时，青霉素酰化酶在反应体系中的浓度为30～300IU/ml。(1IU＝1个酶活性单位)

β-内酰胺母核在反应体系中的浓度为50-400mM，酰化试剂与β-内酰胺母核的摩尔比为1.5～4。

本发明的方法是在无水条件下进行的，所使用的有机溶剂为二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、乙二醇、丙三醇、二氧六环、丙酮、乙腈、异丙醇、2-甲基-1-丙醇、叔丁醇、叔戊醇、2，2-二甲基-1-丙醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、C₄～C₁₈直链或支链烷烃、环己烷、氯仿或二氯甲烷中的一种或多种混合物。

在非水相进行酶催化反应时，LogP(油水分配系数)大的疏水溶剂对于酶的活性维持有更好的作用，但疏水溶剂中极性底物的溶解度比较低，而LogP小的强极性溶剂虽然具有好的底物溶解度，却对酶表面的活性水分子具有剥夺作用而易于导致酶活性降低。因此，优选采用混合溶剂，合适极性的混合溶剂可以对酶的催化性质有更好的调节作用。

本发明的混合溶剂优选由极性的醇和非极性的C₅～C₁₈直链或支链烷烃溶剂组成。即所述的有机溶剂中至少含有一种醇和一种C₅～C₁₈直链或支链烷烃。所述的醇可以是乙二醇、丙三醇、异丙醇、2-甲基-1-丙醇、叔丁醇、叔戊醇或2，2-二甲基-1-丙醇。上述醇在混合溶剂中的合适比例为30-60％(v/v)。

本发明的有机溶剂是无水的，可以采用分子筛、无水硫酸镁等干燥剂干燥或者采用蒸馏、纯化等方法实现。

所述的青霉素酰化酶可以是现有技术中通用的青霉素酰化酶，如大肠埃希氏菌、马氏醋杆菌、柑桔黄单胞菌、巨大芽孢杆菌或粪产碱菌。所述的青霉素酰化酶优选采用固定化的青霉素酰化酶。如湖南福来格生物技术有限公司的固定化青霉素G酰化酶IPA-750。

本发明方法中的反应温度优选10～30℃，最优选10～25℃。反应时间优选2～18h。

本发明方法中的β-内酰胺母核的浓度为50-400mM，酰化试剂与β-内酰胺母核的摩尔比为1.5～4。

本发明方法中生成的β-内酰胺抗生素可在反应期间沉淀出，沉淀中含有少量因酰化试剂水解产生的侧链酸，过滤后经常规重结晶方法可以提纯得到β-内酰胺抗生素产品。

酰化试剂由于含有氨基，在化学合成时得到的产物通常都是胺盐，如盐酸盐或硫酸盐的形式。在非水介质中酶催化合成β-内酰胺抗生素的前期研究中发现，未经过脱盐形式处理的酰化剂反应效果较差，其原因是酰化剂的胺盐在有机溶剂中溶解度很低几乎不溶，而只有在以水为主或含水量较高的体系中才具有一定的溶解度，这也是国内外专利、文献对于无水的溶剂中酶催化合成β-内酰胺抗生素报道很少的原因。因此，本发明采用的酰化试剂优选非盐的形式或硫酸盐、盐酸盐形式酰化试剂经酸化后进行脱盐处理来使用。

本发明所述的β-内酰胺母核是具有结构式(III)或结构式(IV)的化合物，可从市售购得，也可分别通过发酵青霉素或头孢菌素衍生物的酶催化水解而获得。

本发明所述的酰化试剂是具有结构式(V)的化合物。

具有结构式(III)的化合物与结构式(V)的化合物反应生成具有结构式(I)β-内酰胺抗生素。

具有结构式(IV)的化合物与结构式(V)的化合物反应生成具有结构式(II)β-内酰胺抗生素。

反应式如下：

结构式(I)中的取代基R1与结构式(V)中的取代基R1具有相同含义；结构式(II)中的取代基R1与结构式(V)中的取代基R1具有相同含义；结构式(II)中的取代基R2与结构式(IV)中的取代基R2具有相同含义；

在结构式(IV)中：

R2为氢原子、卤原子、甲氧基、C1～C4烷基、取代或非取代的烯基、4-6元环基或杂环基。

卤素原子是氟、氯、溴或碘；C1～C4烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基；取代或非取代的烯基是乙烯基、丙烯基、1-丁烯基或1-氯-丙烯基等。4～6元环基或杂环基是苯基、对羟基苯基、1，2，3-三唑基、5-甲基-1，3，4-噻二唑-2-基硫亚甲基或1，2，3-三唑-4-基硫亚甲基等。

结构式(V)中：

R1为取代或非取代的6元环基或杂环基。

取代或非取代的6元环基是指苯基或对羟基苯基；

杂环基是1H-四氮唑基。

R3为C1～C4烷氧基、氨基、酯基、氧乙烯基、烷基取代氧乙烯基或肟基。

酯基是乙酸酯基、丙酸酯基等。

烷基取代氧乙烯基是异丙烯氧基等。

肟基是丙酮肟基。

本发明方法采用无水的有机溶剂体系进行β-内酰胺类抗生素酶催化合成将能进一步抑制酰化酶的水解活性，从而降低酰化试剂的水解和产物的水解程度。与使用水作为介质的方法相比，本发明方法的合成/水解比值得到了很多提高，也可以更有效地实现过量的酰化试剂的回收利用，降低生产成本。β-内酰胺抗生素的产率得以提高。由于水解等副反应受到抑制，副产物减少，β-内酰胺抗生素的分离过程得到简化。

具体实施方式

实施例1  在无水乙酸乙酯中氨苄西林的酶催化合成

将2.16克6-氨基青霉烷酸(10mmol)(通式(III)化合物，缩写6-APA)和3.3克D-苯基甘氨酸甲酯(20mmol)(通式(V)化合物，其中R1为苯基，R3为甲氧基，缩写D-PGM)加入到经过分子筛除水的乙酸乙酯中形成总体积100ml的混合物。然后，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟，添加10.0克(1180IU)的青霉素G酰化酶，在15℃下反应12小时，液相色谱测定抗生素母核转化率达到90％，氨苄西林产率88％，氨苄西林的合成产物和D-苯甘氨酸的水解产物的摩尔比选择性为2.5(相比之下，对于普通条件下水介质中反应时为1.2左右)。

实施例2  在无水叔戊醇中阿莫西林的酶催化合成

将2.16克6-APA(10mmol)和3.6克D-对羟基苯基甘氨酸甲酯(20mmol)(通式(V)化合物，其中R1为对羟基苯基，R3为甲氧基，缩写D-HPGM)加入到经过分子筛除水的叔戊醇中形成总体积100ml的混合物。然后，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟使得各个物质得到良好的分散，添加20.0克(2360IU)的青霉素G酰化酶，在15℃下反应20小时，液相色谱测定抗生素母核转化率达到86％，阿莫西林产率85％，阿莫西林的合成产物和D-对羟基苯甘氨酸甲酯的水解产物的摩尔比选择性为1.8(相比之下，对于普通条件下水介质中反应时为0.6左右)。

实施例3  在异丙醇-正辛烷混合溶剂中阿莫西林的酶催化合成

将2.16克6-APA(10mmol)和5.4克D-HPGM(30mmol)加入到经过分子筛除水的异丙醇-正辛烷(50/50)中形成总体积100ml的混合物。将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟使得各个物质得到良好的分散。添加20.0克(2360IU)的青霉素G酰化酶，在15℃下反应20小时，液相色谱测定抗生素母核转化率达到94％，阿莫西林产率92％，阿莫西林的合成产物和D-对羟基苯甘氨酸甲酯的水解产物的摩尔比选择性为1.5(相比之下，对于普通条件下水介质中反应时为0.6左右)。

实施例4  在叔戊醇中通过半连续的方法制备阿莫西林

将2.16克6-APA(10mmol)和3.6克D-HPGM(20mmol)加入到经过分子筛除水的叔戊醇中形成总体积100ml的混合物。将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟使得各个物质得到良好的分散。用15.0克(1770IU)青霉素G酰化酶在15℃下进行催化反应：以后每隔3小时向反应体系中加入0.72克6-APA(3.3mmol)和1.2克D-HPGM(6.7mmol)，总共加入4次。20小时以后，液相色谱测定抗生素母核转化率达到94％，阿莫西林产率94％，阿莫西林的合成产物和D-对羟基苯甘氨酸甲酯的水解产物的摩尔比选择性为1.9(相比之下，对于普通条件下水介质中反应时为0.7左右)。

实施例5  在乙酸丁酯中头孢氨苄的酶催化合成

将2.14克7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(10mmol)(通式(IV)化合物，其中R2为甲基，缩写7-ADCA)和3.0克D-苯基甘氨酸甲酰胺(20mmol)(通式(V)化合物，其中R1为苯基，R3为氨基，缩写D-PGA)加入到经过分子筛除水的乙酸丁酯中形成总体积100ml的混合物。然后，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟，添加10.0克(1180IU)的青霉素G酰化酶，在15℃下反应18小时，液相色谱测定抗生素母核转化率达到90％，头孢氨苄产率90％，合成水解比值为2.5。

实施例6  在叔丁醇中头孢羟氨苄的酶催化合成

将2.14克7-ADCA(10mmol)和3.32克D-对羟基苯基甘氨酸甲酰胺(20mmol)(通式(V)化合物，其中R1为对羟基苯基，R3为氨基，缩写D-HPGA)加入到经过分子筛除水的叔丁醇中形成总体积100ml的混合物。然后，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟，添加10.0克(1180IU)的青霉素G酰化酶，在15℃下反应12小时，液相色谱测定抗生素母核转化率达到91％，头孢氨苄产率89％，合成水解比值为2.1。

实施例7  在叔丁醇-异辛烷混合溶剂中头孢克罗的酶催化合成

将2.14克3-氯-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸3-Cl-7-ADCA(10mmol)和3.3克D-PGM(20mmol)加入到经过分子筛除水的叔丁醇-异辛烷(70/30)中形成总体积100ml的混合物。然后，将反应的混合物置于恒温培养箱中振荡5分钟使得各个物质得到良好的分散。添加10.0克(1180IU)的青霉素G酰化酶，在15℃下反应14小时，液相色谱测定抗生素母核转化率达到87％，头孢克罗产率85％，合成水解比值为3.8。