法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-06-26
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K1/14 授权公告日:20110518 终止日期:20120504 申请日:20040504
专利权的终止
2011-05-18
授权
授权
2008-04-09
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-02-13
公开
公开
相关申请的交叉引用
本申请要求2003年5月5日提交的美国临时申请60/467,999的利益，该临时申请特此完整地(包括所有附图、表、氨基酸序列和多核苷酸序列)并入为参考。
技术领域
本发明一般性涉及免疫学领域，并提供免疫保护性组合物和从转基因植物细胞制备这些组合物的方法。本发明还涉及蛋白质生产领域(例如，在转基因植物细胞培养物中表达的酶、毒素、细胞受体、配体、信号转导剂、细胞因子或其它蛋白质的重组生产)，并提供包含这些蛋白质的组合物。
背景技术
对于特定病原体的全身免疫是由先天的或T细胞/B细胞介导的免疫系统响应外来介质的激活引起的。通常，这些介质可以是特定病原微生物的抗原或是设计用于防护特定病原介质的疫苗。病原体的暴露常常通过持续接触病原微生物并受到病原微生物攻击的粘膜表面发生。
粘膜和口腔免疫导致sIgA(分泌性IgA)抗体的产生，该抗体由呼吸道、胃肠道、生殖泌尿道的粘膜表面分泌并存在于所有分泌性腺体的分泌物中。McGhee，J.R.等，Annals N.Y.Acad.Sci.409(1983)。这些sIgA抗体起到防止病原体在粘膜表面定居的作用(Williams，R.C.等，Science 177，697(1972)；McNabb，P.C.等，Ann.Rev.Microbiol.35，477(1981))，是防止通过粘膜表面定居或侵入的免疫防御机制的重要特征。可以通过局部免疫分泌性腺体或组织或通过向GALT(肠道淋巴组织或淋巴集结)或BALT(支气管淋巴组织)呈递抗原来刺激sIgA产生。Cebra，J.J.等，Cold Spri ngHarbor Symp.Quant.Biol.41，210(1976)；Bienenstock，J.M.，Adv.Exp.Med.Biol.107，53(1978)；Weisz-Carri ngton，P.等，J.Immunol.123，1705(1979)；McCaughan，G，等，Internal Rev.Physiol.28，131(1983)。膜微褶细胞，又称为M细胞，覆盖在GALT和BALT的表面并可能与其它的分泌性粘膜表面相关。M细胞的作用在于从邻近粘膜表面的腔间隙采取抗原样本，并将这些抗原转移给抗原呈递细胞(树突细胞和巨噬细胞)，这些细胞又将抗原呈递给T淋巴细胞(在T依赖性抗原的情况下)。之后B细胞被刺激增殖、迁移，并最终转化为产生抗所呈递抗原的IgA的抗体分泌性浆细胞。当覆盖在GALT和BALT上的M细胞摄取抗原后，全身粘膜免疫导致机体的所有分泌组织产生抗该抗原的sIgA，Cebra等，同上引文；Bienenstock等，同上引文；Weinz-Carri ngton等，同上引文；McCaughan等，同上引文。因此，由于口腔暴露引起的免疫保护作用是刺激全身粘膜免疫应答的一个重要途径，此外，该作用还在口腔中和在胃肠道中局部刺激了分泌性免疫应答。
而且，粘膜免疫可以有利地传递给后代。新生儿可以通过初乳和/或乳被动获得免疫。这称作乳生成免疫(lactogenic immunity)，是在生命早期保护动物的一种有效方式。sIgA是乳中的主要免疫球蛋白，由粘膜免疫而最有效地诱导。
覆盖肠道淋巴组织淋巴集结的M细胞能够摄取多种抗原物质和颗粒(Sneller，M.C.和Strober，W.，J.Inf.Dis.154，737(1986))。由于其能够摄取胶乳和聚苯乙烯球、炭、微囊和其它可溶性和颗粒物质，故可以向GALT递送各种物质而不依赖于待递送的物质的任何特定粘着特性。因此，产生植物来源免疫保护性抗原的适当大小的稳定和强壮颗粒的组合物和方法将极大地促进植物生产的抗动物病原体粘膜疫苗的开发。
重组DNA技术已经显著提高了药物和兽医用药——包括疫苗——的安全性、质量、功效和成本。Curtiss & Cardineau发明了植物生产的粘膜疫苗。见美国专利号5,654,184；5,579,880和5,686,079，特此将这些文献并入为参考。包括Arntzen，Mason和Lam在内的其他人描述了表达免疫保护性抗原的转基因植物和生产方法。见美国专利号5,484,717；5,914,123；6,034,298；6,136,320；6,194,560和6,395,964，特此将这些文献并入为参考。
使用细胞培养物在规定的培养基中生产植物细胞可以避免生长培养基中对动物来源成分的需要，从而基本上消除了由生产工艺传递病原污染物的危险。植物细胞能够进行翻译后糖基化，并且相较于用于疫苗生产的常规生长培养基，植物细胞生长培养基一般价格较低，更易于操作和配制。
与常规生产系统相比，在植物系统中生产疫苗抗原和具有药物学或相关生物活性的蛋白质具有多个优点。植物来源的亚单位蛋白质不能回复毒性(这是常规活疫苗或重组产生的活载体疫苗的特征)。从常规生产方法产生亚单位蛋白质可能由于蛋白质的不稳定性和生物化学提取问题而难于生产和纯化，而且需要糖基化的亚单位疫苗组分在原核生物中生产时将不能糖基化。
植物提供了独特的优点，这些优点是难于从任何一种常规或哺乳动物来源的重组DNA系统获得的。传统上，亚单位疫苗或生物活性蛋白质将：1)由于低产率而难于从重组或常规来源纯化并由此造成其生产受阻；2)由于纯化过程中的蛋白水解、pH或溶剂而不稳定；3)由于是非天然蛋白而具有低的功效，或者纯化过程造成关键表位变性；和4)在哺乳动物系统中生产时，由于生物学来源的外来物质而受到限制(如上述)。
发明概述
本发明基于这一意外的发现：对遗传转化而表达免疫原或其它多肽的植物细胞进行机械或物理破碎可以产生在疫苗及工业、制药和药理学制剂中有用的生物活性蛋白质和免疫保护性颗粒。而且，这些蛋白质在配制和下游加工操作中表现出稳定性和强壮性。
本发明提供了制备稳定有效的组合物的方法，该组合物包含从表达至少一种免疫保护性抗原或功能性蛋白质的转化植物细胞中制备的颗粒，其中所述的抗原或功能性蛋白质在晚指数生长和稳定生长期聚集在植物细胞培养物中。抗原或功能性蛋白质聚集在植物细胞的胞质侧细胞壁和细胞膜区，并可以借助于机械或物理破碎或一些其它方式以颗粒形式释放。此外，抗原或功能性蛋白质以生物活性形式稳定存在于植物的胞质侧细胞壁和细胞膜中，并在本发明的方法实施期间和之后仍然保持稳定和活性。在其它实施方案中，生产抗原或功能性蛋白质的方法包括使用低等植物、单子叶或双子叶植物、细胞和培养物。本发明方法的其它实施方案涉及以特定病原性病毒的免疫保护性颗粒形式生产免疫原性蛋白质，包括但不限于AIV(禽流感病毒)的HA(血凝素)蛋白、1型糖蛋白；禽NDV(新城疫病毒)的HN蛋白(血凝素/神经氨酸酶)、2型糖蛋白，(见美国专利号5,310,678，特此并入为参考)；传染性法氏囊病病毒(infectious bursadisease virus，IBDV)结构蛋白VP2；ADP核糖基转移酶(大肠杆菌热不稳定毒素的LT-A亚基)；由两个亚基组成的大肠杆菌细菌毒素LT、人类病毒(包括但不限于细小RNA病毒，如口蹄疫病毒(FMDV)、脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、免疫缺陷病毒(HIV)、人乳头瘤病毒(HPV)、单纯疱疹病毒(HSV)和呼吸道合胞病毒(RSV))。本发明还提供包含带有至少一种免疫保护性抗原或生物活性蛋白质的生物活性植物细胞可溶性提取物的组合物，所述抗原或蛋白质在稳定期聚集在胞质细胞壁和细胞膜结构中，可以容易地使用诸如机械破碎等手段进行提取，并且在冷冻、冻干或悬浮状态下储藏时稳定，而且具有与天然蛋白质相似的特性。此外，通过几种不同类型的启动子系统表达这些蛋白质时，将在晚指数生长阶段和稳定生长期沉积这些蛋白质，其中所述启动子系统包括但不限于花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒的S35、根癌农杆菌(Agrobacterium tumerfacians)的monopine/章鱼碱启动子。这些由重组蛋白质和植物物质组成的组合物可以与一种或多种可药用辅药、稀释剂、载体或赋形剂联合。在其它实施方案中，组合物包括来源于低等植物、单子叶植物或双子叶植物的颗粒以及来源于特定植物细胞和培养物的颗粒。本发明组合物的其它实施方案包含植物细胞中产生的ADP核糖基酶(ADPribosylase)、结构蛋白VP2、1型糖蛋白和2型糖蛋白。某些病原性病毒的特定免疫原性蛋白质，包括禽NDV的HN蛋白和AIV的HA蛋白也是本发明的实施方案。
附图简述
本专利包含至少一幅彩色附图。带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本可以应要求从专利商标局通过附费方式获得。
图1a和1b(SEQ ID NO.1和2)：NDV株“Lasota”的HN基因的植物优化的编码序列和蛋白质序列。
图2：pBBV-PHAS-iaaH的图谱，该质粒包含由组成型CsVMV(木薯叶脉花叶病毒)启动子驱动并由MAS 3’(甘露碱合酶)元件终止的植物选择标记PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)。来自农杆菌的LB和RB(左和右T-DNA边界)元件划定了整合至植物基因组的DNA的边界。
图3：pC！H的图谱，pC！H是“模板载体”，其用于表达免疫保护性抗原的多种植物表达载体的起始质粒。
图4：用于NDV HN蛋白质的pCHN表达载体的图谱。HN表达载体或盒由组成型CsVMV启动子驱动并由大豆vspB 3’元件终止。
图5：用于NDV HN蛋白质的pgHN表达载体的图谱。HN表达盒由带有TEV 5’UTR的块茎特异性GBSS启动子驱动并由大豆vspB 3’元件终止。
图6：用于NDV HN蛋白质的pgHN151表达载体的图谱。HN表达盒由带有其天然5’UTR和内含子的块茎特异性GBSS启动子驱动并由大豆vspB 3’元件终止。该载体来源于pBBV-PHAS-iaaH，含有由CsVMV启动子驱动并由MAS 3’元件终止的植物选择标记PAT。T-DNA左和右边界元件LB和RB划定了整合至植物基因组中的DNA的界限。
图7：用于NDV HN蛋白质的pgHN153表达载体的图谱。HN表达盒由带有其天然5’UTR和内含子的块茎特异性GBSS启动子驱动并由菜豆的菜豆蛋白3’元件终止。该载体来源于pBBV-PHAS-iaaH，含有由CsVMV启动子驱动并由MAS 3’元件终止的植物选择标记PAT。T-DNA左和右边界元件LB和RB划定了整合至植物基因组中的DNA的界限。
图8：用于NDV HN蛋白质的pMHN表达载体的图谱。HN表达盒由组成型4OCSΔMAS启动子驱动(P2指导)并由大豆vspB 3’元件终止。该载体来源于pBBV-PHAS-iaaH，含有由CsVMV启动子驱动并由MAS 3’元件终止的植物选择标记PAT。T-DNA左和右边界元件LB和RB划定了整合至植物基因组中的DNA的界限。
图9：用于AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因的pCHA表达载体图谱。
图10(SEQ ID NO：3和4)：AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA序列和蛋白序列。
图11：pGLTB中间载体的图谱。
图12：pCLT105中间载体的图谱。
图13：pDAB2423。编码VP2的二元载体。
图14(SEQ ID NO：10)：传染性法氏囊病(IBD)病毒IBDV极强毒株Ehime 91的VP2基因的DNA序列。
图15-18：CHN-18、CHA-13、SLT102和CVP2-002的生产、生长和表达蛋白的积累。图15：10升发酵罐中CHA-13的生长结果。实心方块：使用收集细胞体积(PCV)在接种后不同时间从10ml样品得到的Cn-18NT-1转基因细胞的生长。实心三角：使用实施例7所述的定量ELISA测定法得到的HN蛋白质的积累(每运行10升发酵罐)。实心菱形是实施例8所述的血凝素滴度积累，第1天观察到的血凝素滴度来自于从13天(稳定)振荡培养物取得的接种物。图16：10升发酵罐中CHA-13的生长结果。实心方块是使用收集细胞体积(PCV)在接种后不同时间从10ml样品得到的CHA-13 NT-1转基因细胞的生长。空心三角显示蔗糖浓度，蔗糖用作碳源，其被快速转化成葡萄糖(空心方块)并在向培养物接种48小时后不再能被检测到。定量ELISA得到的HA蛋白质的积累由实心三角表示，蛋白质来自于CHA-13 NT-1的细胞提取物。图17：10升发酵罐中CVP2-002的生长结果。实心菱形表示使用收集细胞体积(PCV)在接种后不同时间从10ml样品得到的CVP2-002 NT-1转基因细胞的生长。空心三角显示蔗糖浓度，蔗糖用作碳源，其被快速转化成葡萄糖(＊)并在向培养基接种48小时后不再能被检测到。定量ELISA得到的VP2蛋白质的积累由实心三角表示，蛋白质来自于CV-P2-002 NT-1的细胞提取物。图18：摇瓶培养物中LT的积累，通过实施例7所述LT定量ELISA测定浓度。生长曲线在本研究中未测定，但SLT-102 NT-1细胞的PCV显示出与图15-17中观察到的NT-1转基因细胞系相同的生长和生产。
图19：来自转基因细胞系CHN-18的蛋白质稳定的生产。从制备自CHN-18 NT-1的样品得到的定量ELISA信号的稳定性。按实施例3所述，通过从10升发酵罐收获细胞，分离CHN-18的上清液。在一次微流化(microfiuidization)破碎细胞后，样品通过0.45微米或0.2微米滤器过滤，之后储存在25℃。
图20和21：聚焦扫描显微镜术。图20：MHN-41染色的细胞。绿色：用标记Rb抗HN多克隆抗体的Cy2染料染色的细胞(左上)。蓝色：用标记4A腹水的Cy5染料染色的细胞(左下)。红色：碘化丙锭染色的细胞核(右上)。浅蓝/红：绿色、蓝色和红色图像的数字合并图像。用任一抗体均未在细胞的细胞核中观察到染色。由于强染色区沿着细胞内胞质侧的整个细胞壁和细胞膜，故不能分辨液泡。
图21：对照NT-1细胞。对照NT-1细胞的染色，左图为用Rb抗HN多克隆抗体或4A腹水染色的细胞；右图为碘化丙锭染色的NT-1细胞。
图22和23：说明转基因产生的多肽的定位的电子显微照片。图22：来自NT-1对照细胞、CHN-18转基因细胞和MHN-41转基因细胞的锇酸固定细胞的电子显微照片。表明了各图面的放大倍数，对照细胞为16,000倍放大，CHN-18为50,000倍放大，MHN-41为26,000倍放大。图23：用于NT-1对照细胞、CHN-18转基因细胞和MN-41转基因细胞的电子显微术的免疫金染色。
图24-31：二元载体、中间载体和表达载体的图谱。图24：基础二元载体(BBV)图谱。图25：中间载体pDAB2407的图谱。图26：由PICOSCRIPT(Houston，TX)提供的Bluscript载体中合成的VP2。图27：中间载体pDAB2406的图谱。图28：中间载体pDAB2415的图谱。图29：中间载体pDAB2418的图谱。图30：中间载体pDAB2416的图谱。图31：双子叶植物表达载体pDAB2423的图谱，说明VP2由CsVMV启动子驱动并由Atu ORF24 3’UTR终止，并具有上游RB7 MAR元件。选择标记PAT由At Ubi 10启动子和Atu ORF 3’UTR调节。
序列简述
图1a和1b显示的SEQ ID NO：1和2是NDV株“Lasota”的HN基因的植物优化编码序列和蛋白质序列。
图10所示SEQ ID NO：3和4是AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA和蛋白质序列。
SEQ ID NO：5是用于剪裁pCP！H上CsVMV启动子末端的PCR引物。
SEQ ID NO：6是用于剪裁pCP！H上CsVMV启动子末端的PCR引物。
SEQ ID NO：7是用于产生Nco I位点的诱变引物。
SEQ ID NO：8是互补于5’区的正向引物。
SEQ ID NO：9是用于产生Xho I位点的诱变引物。
SEQ ID NO：10显示在图14中，是传染性法氏囊病病毒VP2基因的DNA序列。
SEQ ID NO：11是编码E/91 VP2变异的植物优化DNA序列(1425个碱基)。E/91植物优化VP2的编码区包含第16-1383位碱基(1371个碱基)。在碱基1384至1425发现6个读框终止。
SEQ ID NO：12包含由植物优化形式的E/91 VP2编码区(SEQ ID NO：11)编码的E/91 VP2蛋白质的序列。
SEQ ID NO：13是在6个读框中编码翻译终止(“Stop”)密码子的DNA序列。该序列用于终止转化期间DNA整合后无意出现的开放读框的翻译，其包括SacI、BstE II和Bgl II限制酶识别位点(Tsukamoto K.，Kojima，C.，Komori，Y.，Tanimura，N.，Mase，M.，和Yamaguchi，S.(1999)，用表达IBDVVP2的重组MDV为鸡提供抗强毒性传染性法式囊病病毒(IBDV)和Marer氏病病毒(MDV)的保护作用.Virol.257：353-362.)
发明详述
免疫原或免疫保护性抗原是在健康动物中引起内生、体液和/或细胞免疫应答的物质，该免疫应答为日后动物与带有该免疫原的病原体的接触提供了保护作用。这些病原体通常是诸如病毒、细菌、真菌和原生动物等物质。免疫原也可以是病原体的抗原部分，包括细胞壁成分和病毒外壳蛋白。
生物活性蛋白质包括(但不限于)酶、毒素、细胞受体、配体、信号转导剂、细胞因子或其它在转基因植物细胞培养物中表达的蛋白质，包括：糖酶(例如，α-淀粉酶[细菌α-淀粉酶(如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、真菌α-淀粉酶(如，黑曲霉(Aspergillus niger))、碱性α-淀粉酶]；β-淀粉酶；纤维素酶；β-葡聚糖酶(glucanase)；外切-β-1，4-葡聚糖酶、内切-β-1，4-葡聚糖酶；β-葡糖苷酶；葡聚糖酶(dextranase)；糊精酶；α-半乳糖苷酶(蜜二糖酶)；葡糖淀粉酶；半纤维素酶/戊聚糖酶/木聚糖酶；转化酶；乳糖酶；柚苷酶；果胶酶；支链淀粉酶)；蛋白酶(例如，酸性蛋白酶；碱性蛋白酶；菠萝蛋白酶；胃蛋白酶；氨肽酶；内肽酶；枯草杆菌蛋白酶)；脂酶和酯酶(例如，磷脂酶(phospholidase)；胃前酯酶(pregastric esterase)；磷酸酶；酰化氨基酸水解酶；谷氨酰胺酶；溶菌酶；青霉素酰基转移酶；异构酶)；氧化还原酶(例如，醇脱氢酶；氨基酸氧化酶；过氧化氢酶；氯过氧化物酶(chloroperoxidase)；过氧化物酶)；裂合酶(例如，乙酰乳酸脱羧酶；天冬氨酸β-脱羧酶；组氨酸酶)；或转移酶(如，环糊精糖基转移酶)。编码这些酶(或适于在本发明表达系统中表达的毒素、细胞受体、配体、信号转导剂或细胞因子)的多核苷酸序列可以从商业数据库如EMBL、SWISSPROT或NCBI数据库获得。通常，在转基因植物细胞培养物中产生的生物活性蛋白质在功能或结构活性上等价于从天然来源中分离的相同蛋白质。
生物活性蛋白质颗粒定义为由来源于表达生物活性蛋白质的转基因植物细胞的重组蛋白质、植物蛋白质、脂质、糖、核酸或它们的组合组成的异源颗粒或集合物，所述转基因植物细胞由本发明方法制备。在某些实施方案中，生物活性蛋白质颗粒可以是部分的脂小泡、膜碎片、细胞壁碎片、亚细胞器或碎片或者通常来源于转化的植物细胞的晚指数生长和稳定生长期贮存蛋白，或者与它们相关。本发明的颗粒高度稳定，并将重组蛋白质维持在高度稳定的生物活性构象上。在其它实施方案中，颗粒定义为通过机械或物理破碎晚指数生长或稳定生长期的转基因细胞培养物(该培养物从引入该植物细胞的重组基因表达蛋白质)可以容易地悬浮在缓冲液或培养物上清液中的物质。
免疫保护性颗粒来源于或获自经过遗传改造表达免疫保护性抗原的转基因植物细胞。本发明的免疫保护性颗粒是由来源于转基因工程植物细胞的重组免疫保护性抗原、蛋白质、脂质、糖、核酸或它们的组合组成的异源颗粒或集成物，在适当地施用给动物(包括人)时其可以为日后与带有该免疫原的病原体的接触提供保护作用。本发明该颗粒高度稳定，并将免疫保护性抗原维持在高度稳定和生物活性的构象上。机械或物理破碎工程化细胞之后，通过将细胞碎片与免疫保护性颗粒分离而获得免疫保护性颗粒。在某些实施方案中，该颗粒是部分的脂小泡、膜碎片、细胞壁碎片、亚细胞器或碎片，或者来源于转化的植物细胞的晚指数生长和稳定生长期的贮存蛋白或与它们相关。在其它实施方案中，该颗粒定义为通过机械或物理破碎晚指数生长或稳定生长期的转基因细胞培养物(该培养物从引入该植物细胞的重组基因表达蛋白质)可以容易地悬浮在缓冲液或培养物上清液中的物质。
低等植物定义为任何非开花植物，包括真蕨类(ferns)、裸子植物、松柏类植物、问荆、石松、liver warts、hornwarts、苔藓植物、红藻、褐藻、蕨类植物的配子体、孢子体和绿藻；尤其优选苔藓植物。
接种定义为通过用免疫原性制剂、免疫保护性颗粒或致病因子的免疫原性制剂，或其无毒形式或部分接种宿主，以使宿主免疫系统受到刺激并防止或减轻与日后暴露于该病原体的宿主反应相关的有害病理，从而提供抗病原体的保护作用。
疫苗是用于接种动物(包括人)的组合物，其含有至少一种免疫保护性抗原物质。
病原生物是在其感染的动物中引起疾病或诱导的/受控的生理状态的细菌、病毒、真菌或原生动物。
在本说明书中，佐剂是强化、增加、调节或增强对免疫原或抗原的免疫应答的物质。佐剂通常对体液和细胞免疫应答都增强，但在缺少其中一项应答时，对另一项应答的增强也符合佐剂定义。此外，佐剂和其用途是免疫学家熟知的，通常在免疫原剂量受限、免疫原具弱免疫原性、或采用次最佳给药途径时用于增强免疫应答。因此，术语“佐剂量”是指能够增强对给定免疫原或抗原的免疫应答的佐剂量。等于“佐剂量”的质量是变化的，取决于多种因素，包括(但不限于)免疫原的特征、免疫原的施用量、宿主物种、给药途径和免疫原的施用方案。在特定的一组环境中，“佐剂量”可以通过常规实验容易地确定。这在本领域技术人员的范围内，并通常使用针对改变的免疫原和佐剂给药量的常规剂量反应测定来实施。通过使用酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、血细胞凝集试验等测定针对该免疫原产生的血清抗体效价或细胞介导的应答，从而测量应答。
本发明还提供药物组合物和兽医组合物，其包含本发明的免疫保护性或生物活性蛋白质或颗粒或者组合物以及一种或多种可药用佐剂、载体、稀释剂和赋形剂。该药物组合物也可以称作疫苗，并以制药和疫苗领域熟知的方式配制。
给药定义为向动物(包括人)体内引入物质，包括口服、鼻、眼、直肠、阴道和胃肠外途径。本发明的组合物可以通过任何给药途径单独地或与其它治疗剂联合施用，包括(但不限于)通过皮下(SQ)、肌内(IM)、静脉内(IV)、腹膜内(IP)、皮内(ID)、通过鼻、眼或口粘膜(IN)或通过口服施用。尤其优选粘膜途径，最优选口服途径。
有效剂量是在人或动物中引起如下免疫应答所必需的量，其中所述免疫应答足以使人或动物有效抵抗病原因子发动的攻击或应答动物生理需要(如针对糖尿病的自身免疫抗原)。给予这类人或动物的剂量将由医师、兽医或受训的科学工作者考虑相关因素来确定，所述因素包括特定的免疫保护性颗粒或颗粒组合、人或动物的条件、以及所选给药途径。一般地，有效剂量为大约1ng至大约0.5mg，优选大约1μg至大约50μg。对于家禽的新城疫病毒(HN抗原)，通过SQ途径给药，有效剂量为大约0.5μg至大约50μg，优选大约2.5μg至大约5μg。通过IN/眼粘膜途径给药，在家禽中用于HN的有效剂量为大约0.5μg至大约50μg，优选大约5μg至大约25μg，更优选大约10μg至大约12μg。对于禽流感病毒(HA抗原)，通过IN/眼途径给药，有效剂量为大约0.5μg至大约50μg，优选大约1μg至大约30μg，更优选大约24μg至大约26μg，通过SQ途径给药，优选大约1μg至大约5μg。对于家禽的传染性法式囊病(VP2抗原)，通过SQ途径给药，有效剂量为0.5μg至大约50μg，优选大约5μg至大约25μg，更优选大约5μg至大约20μg。对于LT抗原，有效口服剂量为大约50ng至大约250ng，优选大约100ng至大约200ng。对于LT抗原，有效SQ或IN/眼剂量为大约50ng至大约100μg；优选大约1μg至大约25μg，更优选大约2μg至大约10μg。此处给出的剂量无意以任何方式限制本发明的范围，而是作为对本领域技术人员的一般性指导。
本文中鸡定义为鸡纲(Aves)的任何温血脊椎动物，通常具有演变为翼的前肢、具鳞的脚、喙，并产仔在硬壳卵中。在本说明书中，优选的鸡类是家养的鸡、火鸡、鸵鸡、鸭、鹅和小型春鸡(cornish game hen)。更优选的鸡类是家养的鸡和火鸡。对于本发明的目的，最优选的鸡是驯化的鸡，包括肉仔鸡(broiler)和layers(家禽)。
本发明的方法和组合物针对免疫和保护动物，包括人，优选家畜，例如鸡(家禽)、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗和骆驼，最优选鸡。这些动物物种中的一些可以具有多个胃和特异于分解植物物质的消化酶，并且可以以其它方式容易地失活其它类型的口服疫苗。尽管无意限制本发明，消化转基因植物细胞及来源于它的组合物可以导致在口粘膜(包括扁桃腺)处免疫动物。
就本发明的目的而言，术语膜序列被考虑为具有本领域技术人员理解的含义。膜锚定序列包括跨膜蛋白质序列，其存在于许多天然蛋白质中。这些膜锚定序列大小各异，但总是由一系列具有亲脂性或脂肪族侧链的氨基酸组成，这些侧链有利于膜内的疏水环境。在RNA翻译和翻译后加工的过程中，锚序列整合并包埋在细胞膜中并起到锚的作用，或者松散地将蛋白附着于细胞膜成分上，从而允许蛋白的亲水部分暴露在细胞的内或外水性环境并与该环境相互作用。
贮存包函体或贮存蛋白在本文中定义为植物用作为氮源的蛋白质，这些蛋白质在植物生命周期的非生产期(例如在稳定期)贮存，并在细胞被诱导活跃生长时快速地用作能量和氮的来源。
转基因植物在本文中定义为来源于转化的植物细胞或原生质体的植物细胞培养物、植物细胞系、植物组织培养物、低等植物、单子叶植物、双子叶植物或它们的后代，其中转化的植物的基因组含有通过实验室技术引入的外源DNA，该外源DNA并非原初存在于相同物种的天然非转基因植物细胞中。术语“转基因植物”和“转化的植物”在本领域中有时作为定义其DNA中含有外来DNA分子的植物的同义词。
可以容易地使用熟知的方法构建在植物中表达免疫保护性抗原的基因盒，所述方法例如公开在Sambrook等(1989)；和Ausubel等(1987)《Current Protocols in Molecular Biology》，John Wiley and Sons，纽约，NY中的方法。本发明还包括与所公开的编码免疫保护性抗原的序列具有显著序列同源性以致能够在表达时产生所公开的效果的DNA序列。在本申请中，术语“显著的序列同源性”用于指与另一核苷酸或氨基酸序列表现出基本上的功能或结构等价性的核苷酸序列(在DNA或RNA的情况下)或氨基酸序列(在蛋白质或多肽的情况下)。在具有显著序列同源性的序列之间，任何功能或结构的差异都是微不足道的(de minimis)；即，这些差异不影响序列发挥本申请所指的功能。与本文公开的序列具有显著序列同源性的序列通常是所公开序列的变体，例如突变体，但也可以是合成的序列。
在大多数情况下，与本文具体公开的序列95％同源的序列将起到等价物的作用，而在许多情况可以接受显著较低的同源性，例如75％或80％。定位这些序列中的非关键部分可能是耗时的，但是惯例的并完全处于本领域技术人员的范围内。用于改变寡核苷酸序列的示例性技术包括多核苷酸介导的定点诱变。见Zoller等(1984)；Higuchi等(1988)；Ho等(1989)；Horton等(1989)；和《PCR Technology：Principles and Applications forDNA Amplification》，Erlich(编)(1989)。
在大多数情况下，用于通过重组DNA产生蛋白质的哺乳动物细胞、细菌细胞或其它宿主载体系统不建立在被放入更新后的培养环境中时可以被重新利用的蛋白质贮存物。针对大肠杆菌(E.coli)描述的包函体或杆状病毒、颗粒体症病毒或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thurengiensis)的晶体蛋白由宿主系统为了不同的生物学目的而储存。然而，已经证明无一将蛋白质放入在重新培养或从静止期或稳定期开始激活新生长的过程中可以被植物用作氮源的贮存区室。
在NT-1生长的稳定期晚期阶段将蛋白质放置在细胞中的贮存区室或稳定位点不是在体外培养的转基因植物细胞中表达蛋白质的预期特征。电子显微镜术显示白色体中存在暗中心，并且免疫金标记附着在位于接近细胞壁和细胞膜的细胞质区室的蛋白质上(见实施例16)。而且，不论表达的蛋白质的类型和所用转录启动子系统的类型如何，NT-1系统均能够将蛋白贮存在稳定的区室——这是一个前所未有的观察结果。已经成功表达的蛋白质包括几种不同类型的蛋白质：1)ADP核糖基转移酶，大肠杆菌LT肠毒素的LTA成分；2)含有来源于大肠杆菌的LTA和LTB亚基的、完全形成的功能性LT全毒素；3)传染性法式囊病病毒(IBDV)的结构蛋白VP2；4)禽流感病毒(AIV)的1型病毒的糖蛋白血凝素(HA)；和5)新城疫病毒的2型病毒糖蛋白。在每种情况下均发现所表达蛋白质的生物活性与来自各相应病原体的天然蛋白质相比即使不更有效也一样有效。就用于表达外源蛋白质的单一类型宿主细胞而言，与每种蛋白质相关的功效都是意想不到的特征。该贮存蛋白的另一意想不到的特征是其稳定性，而且如上所述，该蛋白质可以容易地分离(例如，通过机械破碎)。然后可以将悬浮的蛋白质或带有蛋白质的颗粒冻干、冷冻、乳化、匀浆、微流化(microfluidization)而不丧失信号和稳定性。以液体形式放置在2-7℃数月的本发明蛋白质和颗粒表现出长半衰期；无需添加任何稳定剂，通过简单机械搅动产生的提取物导致对于NDV的HN蛋白而言具有1-2年设计半衰期的制品和对于大肠杆菌LT而言具有13-15个月设计半衰期的制品。根据本发明产生的蛋白质极为强壮，并适应于多种可以提高免疫应答的制剂。
与本发明方法相容的物理或机械细胞破碎技术包括(但不限于)常规细胞破碎方法，例如超声、微流化或其它剪切类方法，高剪切转子/定子方法、弗氏压碎器或其它压碎方法，以及匀浆技术。早期的研究和开发活动证明高压破碎能量是以免疫保护性颗粒形式从收获细胞提取HN蛋白所必需的。尽管超声破碎用于从小发酵罐试验体积(1-10ml)释放HN免疫保护性颗粒，但其被证明对于从超过1L体积的收获细胞回收HN免疫保护性颗粒而言效率较低(＞35％)，并且不适于按比例放大。
使用Microfludics，Inc.的固定孔压力破碎器(fixed orifice pressuredisrupter)进行的力滴定(power titration)研究显示，破碎压力与从NT1-CHN-18细胞回收的HN免疫保护性颗粒的产率成比例。HN颗粒的最大回收在设定用于该仪器的最大压力(18,000psig)处获得。甚至在最大压力处，总的HN蛋白质中仍有40％以上留在丢弃的细胞碎片级分中。此后实验的压力滴定曲线提示，更高的裂解压力可能显著地降低丢弃的细胞碎片级分中的HN蛋白质量。
Microfludics生产线被认为是恒定细胞破碎技术的“第二代”。Microfludics仪器通过迫使悬浮细胞通过固定的0.1mm湍流(“Y”几何学)孔来实现细胞破碎，其中所述孔连接通过液压油缸以高流速排空的储水池。油缸向上打开充填储水池用于下一循环的单向阀。Microfluids Inc.要求保护级别从大约10ml＊min-1至10,000L＊hr-1的等价物。据认为细胞裂解由如下原因造成：(1)加速通过孔(向心挤压)，(2)孔尖端与喷射室(ejectionchamber)间的压力差造成细胞破裂，和/或(3)减速进入喷射室靶。细胞超微结构(即，细胞壁)、细胞浓度、破碎能(psig)和裂解缓冲液组成被认为是影响裂解效率的最重要变量。
较早的第一代仪器由Aminco Inc.生产，是连续的弗氏细胞压碎器。这些仪器与Microfludics仪器相似，其不同之处在于孔直径和液压为手动控制。这些后来的仪器主要用于不超过50ml样品体积的研究和开发活动。第三代恒定细胞破碎器(DeBEE，Inc.和Constant Systems，Inc.)包括了诸如更高的操作压力(高达60,000psig)、双样品室以减小压力波动，和在真空下操作的样品喷射室等改进。与第一代和第二代仪器相比，这些改进据报道提高了裂解效率。
本发明方法的净化步骤包括任何分离技术，包括(但不限于)重力沉降、离心、浮选、过滤(包括切向流过滤和常规过滤)和层析技术(包括所有形式的柱层析和HPLC方法)。优选方法是从大约1000g至大约5000g、为期几分钟的低速离心。
在制备本发明构建体时，可以操作多种DNA片段，以提供具有正确取向和适当时处于正确阅读框的DNA序列。衔接子或接头可以用于连接DNA片段，或可以包括其它操作以提供方便的限制性位点、除去多余DNA、除去限制性位点等等。
在实施各个步骤时，使用克隆以扩增含有目的启动子/基因的载体以便随后引入期望的宿主细胞。可以获得多种克隆载体，其中克隆载体包括在大肠杆菌中起作用的复制系统和允许选择转化细胞的标记。示例性载体包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等。因此，可以将序列插入载体的适当限制性位点处，用所得质粒转化大肠杆菌宿主(例如大肠杆菌HB101、JM101和DH5α株)，在适当营养培养基中生长大肠杆菌，收获并裂解细胞，回收质粒。分析可能涉及序列分析、限制性分析、电泳等。在每一操作之后，用于最终构建体中的DNA序列可以进行限制性消化并与下一序列连接，其中每一个部分构建体均可以克隆在相同或不同质粒中。
可以获得或可以容易地制备载体以用于转化植物细胞。一般地，质粒或病毒载体应含有在给定宿主中维持和表达外源DNA序列序列所必需的所有DNA控制序列。这些控制序列一般包括前导序列、编码翻译起始信号密码子的DNA序列、翻译终止密码子和编码控制信使RNA加工的3’UTR信号的DNA序列。本领域普通技术人员利用本公开的教导能选择适当元件以优化在任何特定物种中的表达。最后，载体应按需要具有标记基因，该标记基因能够提供允许鉴别含有载体的宿主细胞的表型性状。
插入植物细胞的外来编码序列的活性依赖于临近该插入物的内源植物DNA的影响。一般地，使用任何转化技术时，外源基因的插入似乎是随机的；但是目前存在制备在植物细胞中位点专一重组DNA的植物的技术(见WO91/09957)。任何导致一个或多个目的序列在启动子控制下表达的方法或方法组合均是可以接受的。
本发明不限于任何特定的转化植物细胞的方法。将DNA引入植物细胞的技术是本领域技术人员熟知的。用于将外源DNA递送至植物细胞中的四种基本方法已有描述。化学方法(Graham和van de Eb，Virology，54(02)：536-539，1973；Zatloukal，Wagner，Cotton，Philips，Plank，Steinlein，Curiel，Birnstiel，Ann.N.Y.Acad.Sci.，66-：136-153，1992)；物理方法包括显微注射(Capecchi，Cell，22(2)：479-488，1980)、电穿孔(Wo ng和Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2)：584-587，1982；Fromm，Taylor，Walbot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828，1985；U.S.Pat.No.5,384,253)和基因枪(Johnston和Ta ng，Methods Cell.Biol.43(A)：353-363，1994；Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24)：11478-11482，1993)；病毒方法(Clapp，Clin.Perinatol.20(1)：155-168，1993；Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，J.Exp.Med.178(6)：2089-2096，1993；Eglitis和Anderson，Biotechniques，6(7)：608-614，1988；Eglitis，KantoFF，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，Avd.Exp.Med.Biol.，241：19-27，1988)；和受体介导的方法(Curiel，Agarwal，Wagner，Cotton，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)：8850-8854，1991；Curiel，Wagner，Cotton，Birnstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，Hum.Gen.Ther.3(2)：147-154，1992；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103，1992)。
通过电穿孔将DNA引入植物细胞是本领域技术人员熟知的。植物细胞壁降解酶，例如果胶降解酶用于使受体细胞比未处理细胞更易于通过电穿孔转化。为了通过电穿孔进行转化，可以直接使用易碎组织，例如细胞的悬浮培养物、胚胎发生愈伤组织或未成熟胚或其它有机组织。一般必需通过果胶降解酶部分降解或以控制的方式机械损伤来靶植物材料的细胞壁。这种经处理的植物材料易于通过电穿孔接受外来DNA。
将外来转化DNA递送至植物细胞的另一方法是微粒轰击。在该方法中，用外来DNA包被微粒并通过推进力将微粒递送入细胞。该微粒通常由钨、金、铂和类似金属制成。微粒轰击的优点在于无需分离原生质体(Cristou等，1988，Plant Physiol.87：671-674)和对农杆菌感染敏感。通过加速将DNA递送至玉米细胞的一个示例性方法的实施方案是生物轰击微粒递送系统(Biolistics Particle Delivery System)，该系统可以用于推动包被有DNA的颗粒或细胞通过过滤器表面的筛子，其中所述过滤器表面覆盖有悬浮培养的玉米细胞。筛子将颗粒分散，这样颗粒不会以大集成物的形式被递送至受体细胞。为了进行轰击，优选将悬浮细胞浓缩在滤器或固体培养基上。或者，可以将未成熟胚或其它靶细胞安排在固体培养基上。将待轰击的细胞放置在大轰击粒子终止板(macroprojectile stoppi ngplate)下适当距离处。对于轰击转化，可以优化轰击前培养条件以及轰击参数以便得到最大数目的稳定转化体。用于轰击的物理和生物学参数在该技术中均是重要的。物理因素是涉及操作DNA微粒沉淀的因素或影响微粒的飞行或速度的因素。生物因素包括涉及在轰击前和临轰击后操作细胞的所有步骤、靶细胞的渗透压调节以帮助缓解轰击相关的创伤，以及转化DNA的性质，例如线性DNA或完整的超螺旋质粒。
农杆菌介导的转移是将外源DNA引入植物细胞的广泛适用的系统，因为DNA可以被引入整个植物组织，从而消除了从原生质体再生全株植物的需要。；利用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入植物细胞是本领域熟知的。见例如，Fraley等1985，Biotechnology，3：629；Rogers等，1987，Meth.in Enzymol.153：252-277中描述的方法。而且，Ti-DNA整合是导致非常少重排的相对准确方法。待转移的DNA区由边界序列限定，并通常如Spielmann等，1986，Mol.Gen.Genet.，205：34；Jorgensen等，1987，Mol.Gen.Genet.，207：471所述通常将间插DNA插入植物基因组。
现代农杆菌转化载体能够在大肠杆菌和农杆菌中复制，允许方便的操作。而且，近来对于用于农杆菌介导的基因转移载体的技术发展已经改善了基因和限制性位点在载体中的排列，以利于构建能够表达多种蛋白质或多肽的载体。方便的多接头区的两侧为用于指导插入的多肽编码基因表达的启动子和多腺苷酸化位点，该多接头区适用于本发明目的。此外，可以使用含有武装的(armed)和去武装的(disarmed)Ti基因的农杆菌实施转化。
植物原生质体转化可以使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法来实现(见，例如，Potrykus等，1985，Mol.Gen.Genet.，199：183；Marcotte等，Nature，335：454，1988)。将这些系统应用于不同植物物种取决于从原生质体再生该特定物种的能力。
一旦植物细胞被转化、选择并检测抗原表达后，在一些情况下可以再生全株能育植物。这极大地取决于所选的植物物种。文献中已经记载了再生多种植物物种的方法，这些方法是本领域技术人员熟知的。为了本发明的实施，优选转化可以通过避免一般冗长的再生步骤进行快速培养和扩大规模的植物细胞系。此外，应用植物细胞培养物可以避免户外生产，极大地降低基因逃逸和食物污染的机会。优选烟草悬浮细胞培养物，例如NT-1和BY-2(An，G，1985，Plant Physiol.79，568-570)，因为这些细胞系尤其易于在培养中操作、易于转化、产生稳定整合事件并适于冷冻保存。
烟草悬浮细胞系NT-1适用于本发明的实施。NT-1细胞最初从烟草栽培品种嫩黄2(Nicotiana tabacum L.cv.bright yellow 2)开发产生。NT-1细胞系被广泛应用并易于获得；虽然，任何烟草悬浮细胞系均适用于本发明。值得注意的是，NT-1细胞系的起源是不清楚的。而且，该细胞系表现出变异，并且易于响应培养条件发生改变。适用于以下实施例的NT-1细胞可以从美国典型培养物保藏中心以保藏号ATCC 74840获得。也参见美国专利6,140,075，特此完整并入作为参考。
从实验室级别的摇瓶至数千升的生物反应器，许多植物细胞培养技术和系统均已有描述并是植物细胞培养领域所熟知的。见例如Fischer，R.等，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.30，109-112和Doran，P.，2000，CurrentOpionions in Biotechnology，11，199-204。将转化的植物细胞培养至所需质量后，收获细胞，温和洗涤并放置在适宜的缓冲液中进行破碎。许多不同的缓冲液与本发明相容。一般地，缓冲液是中性或接近中性pH值的等渗缓冲盐水溶液，不含有可以用于溶解膜的强去污剂。优选的缓冲液包括含有1mM EDTA的PBS和Dulbecoo磷酸缓冲盐水。
在一个实施方案中，可以超声破碎细胞。将洗涤后的细胞以大约0.01gm/ml至大约5.0gm/ml，优选大约0.1gm/ml至大约0.5mg/ml(洗涤后湿重细胞/缓冲液体积)置于缓冲液中。许多商业可获得的超声仪器均可以用于本发明，超声时间从大约5秒至大约20秒，优选大约15秒至大约20秒。所得物的大小可以从几微米至数百微米，并暴露重组免疫保护性蛋白质或其它生物活性蛋白质。
实施例1：载体
基因构建：分析NDV株“Lasota”的HN基因编码序列(Genbank登录号AF077761)、AIV株ATurkey/Wisconsin/68的HA基因、IBDV株E19的VP2基因(Genbank登录号X00493)和大肠杆菌的LT基因的密码子使用以及是否存在可能介导欺骗性mRNA加工和不稳定性或者基因组DNA甲基化的不期望的序列基序。见Ada ng MJ，Brody MS，Gardineau G，Eagan N，Roush RT，Shewmaker CK，Jones A，Oakes JV，McBride KE(1993)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因的构建和在原生质体和马铃薯植物中的表达，Plant Mol.Biol.21：1131-1145。用反映番茄和马铃薯密码子使用的杂合密码子偏好设计植物优化编码序列(Ausubel F.等编(1994)Current Protocols in Molecular Biology，Vol.3，p.A.1C.3 Haq TA，Mason HS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)使用转基因植物中产生的重组细菌抗原进行口服免疫，Science 268：714-716)。对于HN，设计的序列如图1所示。合成的HN基因由供应商(Retrogen)组装并以放置在两个分开的质粒中收到，这两个质粒含有克隆在pCR-Blunt中的该基因的5’(p4187-4203-1)或3’(p42111-4235-1c-1)半部分。
质粒构建：用于农杆菌介导的植物转化的二元载体基于图2所示的使用植物选择标记膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的载体pBBV-PHAS-iaaH构建，所述pBBv-PHAS-iaaH载体描述在美国专利5,879,903、5,637,489、5,276,268；和5,273,894中(并入此处作为参考)并由描述于WO97/48819的组成型木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子驱动。首先我们通过用PacI消化pBBV-PHAS-iaaH去除了iaaH基因和菜豆蛋白启动子序列，并重新连接以形成pCVMV-PAT；然后，通过用Klenow酶补平而去除了唯一的HindIII位点，并重新连接以形成pCP！H。使用引物CVM-Asc(5’-ATGGCGCGCCAGAAGGTAATTA TCCAAG SEQ ID NO：5)和CVM-Xho(5’-ATCTCGAGCCATGGTT TGGATCCA SEQ ID NO：6)通过PCR在模板pCP！H上对CsVMV启动子进行了末端剪裁，并将产物克隆在EcoRV消化的具有T尾的pBluescriptKS中制成pKS-CVM7。图3显示了pCP！H的图谱。通过载体pKS-CVM7/NcoI-EcoRI与3个插入片段——NcoI/PstI上HN的5’半部分、PstI/KpnI上HN的3’半部分和KpnI-EcoRI上大豆vspB 3’元件(Haq 1995)——的连接，构建HN表达盒pKS-CHN。然后通过载体pCP！H/AscI-EcoRI与pKS-CHN的AscI-EcoRI片段连接组装成二元T-DNA载体pCHN。图4显示了pCHN的图谱。
颗粒结合淀粉合酶(GBSS)启动子(描述在美国专利5,824,798，并入此处作为参考)用于制备其它载体。这些构建体使用从马铃薯栽培品种“Desiree”(Solanum tuberosum L.cv.“Desiree”)基因组DNA利用引物扩增的启动子片段来构建，其中所述引物是基于Genbank登录号X83220中中国马铃薯栽培品种“Do ngno ng”的序列而设计的。利用诱变引物“GSS-Nco”(5’-[TGCCATGGTGATGTGTGGTCTACAA]SEQ ID NO：7)和互补于-1800bp处5’区域的正向引物“GSS-1.8F”5’-[GATCTGACAAGTCAAGAAAATTG]SEQ ID NO：8)构建与翻译起始密码子重叠的NcoI位点；将1825bp PCR产物克隆在T尾pBluescriptKS中制成pKS-GBN，并测序。利用诱变引物“GSS-Xho”(5’-[AGCTCGAGCTGTGTGAGTGAGTG]SEQ ID NO：9)以及引物“GSS-1.8F”构建恰好位于翻译启示位点3’的XhoI位点；将此1550bpPCR产物克隆在T尾pBluescriptKS中制成pKS-GBX，并测序。
通过HindIII/XhoI消化的pTH210载体与pKS-GBX的HindIII/XhoI片段连接，装配成含有美国专利5,891,665(并入此处作为参考)中描述的TEV 5’UTR(非翻译区)的GBSS启动子表达盒，形成pTH252A，由此实现811bp GBSS启动子对CaMV 35S启动子的置换。参见Haq TA，MasonHS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)，用转基因植物中生产的重组细菌抗原进行口服免疫，Science 268：714-716。通过NcoI/PstI上HN的5’半部分和PstI/KpnI上HN的3’半部分的连接，将HN基因插入pTH252A/NcoI-KpnI中，形成pHN252A。二元R-DNA载体pgHN通过连接NsiI和EcoRI消化的载体pGLTB(显示于图11中)和片段pHN252A/NsiI-KpnI和pTH210/KpnI-EcoRI而构建。图5中显示了pgHN的图谱。
带有GBSS内含子并含有GBSS 5’UTR的GBSS启动子表达盒(见美国专利5,824,798，并入此处作为参考)通过HindIII/NcoI消化的载体pTH210(Haq 1995)和pKS-GBN的HindIII/NcoI片段连接而装配，从而实现1084 bp GBSS启动子/5’-UTR对(花椰菜花叶病毒)CaMV35启动子/TEV 5’UTR的置换，形成pTH251A。二元T-DNA载体pgHN151通过载体pCLT105(显示于图12)与片段pTH251A/HindIII-NcoI及pHN252A/NcoI-KpnI的连接而构建。pgHN151的图谱示于图6中。
构建含有GBSS 5’UTR及其内含子和菜豆的菜豆蛋白3’元件(描述在美国专利5,270,200；6,184,437；6,320,101中，并入此处作为参考)的GBSS启动子表达盒。首先，在唯一的KpnI位点消化pCP！H，用T4 DNA聚合酶平端化、重新连接形成该KpnI位点被除去的pCP！HK。用NsiI消化pCP！HK，之后用T4 DNA聚合物平端化，然后用PacI消化。所得载体与2848 bp片段连接形成pgHN153，其中该2848 bp片段通过SacI消化pgHN151并之后用T4 DNA聚合酶平端化和随后用PacI消化而产生。pgHN153的图谱示于图7。
嵌合组成型启动子(4OCSΔMAS美国专利5,001,060；5,573,932和5,290,924，并入此处作为参考)用于构建另一HN表达载体。用EcoRV消化并用BamHI部分消化质粒pAGM149。该片段与PmeI/PstI消化的pCHN以及通过用BamHI/PstI消化pKS-CHN获得的HN合成基因的5’半部分连接。所得pMHN显示在图8中。
从David Suarez(SEPRL，Athens，GA)获得含有AIVA/turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因的质粒(图10)。通过PCR对其进行末端剪裁以在5’端添加限制性位点NcoI和在3’端添加限制性位点KpnI，将其插入含有35S启动子、TEV 5’-UTR和vspB 3’端的载体pIBT210.1(Haq等，1995)。通过用HindIII和EcoRI(部分)消化，将该表达盒转移至二元载体pGPTV-Kan(Becker等，Plant Mol Biol 1992；20：1195-7)，得到pIBT-HAO。用NcoI和EcoRI(部分)消化，从pIBT-HAO获得HA基因/vspB3’端片段，插入pKS-CVM7得到pKS-CHA。用AscI和EcoRI(部分)消化，从pKS-CHA获得含有CsVMV启动子、HA基因和vspB3’端的盒子，并与pCP！H连接形成pCHA(示于图9)。
编码大肠杆菌H10407菌株的LT-B基因的植物优化序列是本领域已知的(Mason HS，Haq TA，Clements JD，Arntzen CJ，1998，Vaccine 16：1336-1343)。编码大肠杆菌H10407株的LT-A基因的植物优化序列描述于WO/00/37609(其最初作为美国临时申请60/113,507提交，其完整的教导并入此处作为参考)。WO/00/37609描述了三个二元T-DNA载体(pSLT102、pSLT105、pSLT107)的构建，这三个载体被用于实施例2中根癌农杆菌介导的烟草(Nicotiana tabacum)NT-1植物细胞的转化。所得的转化NT-1细胞系(SLT102、SLT105、SLT107)表达并积累由LT-B和修饰的LT-A亚基组成的完全装配的LT和LT类似物。图12说明pSLT107，该载体含有用Arg72置换Ala72的LT-A修饰基因。SLT102和SLT105表达产物除了在LT-A基因中含有不同的改变(在pSLT102中Ser63改变为Lys63；在pSLT105中Arg192改变为Gly192)外，其它方面相同。这些细胞系含有稳定地整合在核染色体DNA中的、未确定拷贝数的这些质粒的T-DNA区。根据神经节苷脂依赖性ELISA测定，转基因NT1细胞以高达总可溶性蛋白质的0.4％水平积累LT-B亚基，这些亚基组装成与神经节苷脂结合的五聚体。利用LT-A特异性抗体通过神经节苷脂依赖性ELISA测定，转基因NT1细胞也积累修饰的LT-A亚基，并且其中一些亚基与LT-B五聚体装配。
用于农杆菌介导的植物细胞转化的二元载体从基础二元载体(pBBV)通过在唯一的BamHI位点用AgeI接头修饰进行构建，所述接头用于插入VP2和选择标记表达盒。VP2侧翼为RB7 MAR元件(US 5,773,689；US5,773,695；US 6,239,328；WO 94/07902和WO 97/27207)及CsVMV启动子和根癌农杆菌(Atu)ORF 24(GenBank登录号X00493)3’UTR。选择标记PAT由拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)泛素10启动子(PlantJ.1997，11(5)：1017；Plant Mol.Biol.1993，21(5)：895；Genetics，1995，139(2)：921)和Atu ORF1(US 5428147；Plant Molecular Biology，1983，2：335；GenBank登录号X00493)3’UTR调节；所得质粒pDAB2423显示在图13中。
基于报道的VP2氨基酸序列(GenBank登录号AB024076)和来自UK661株的氨基酸#454-456(GenBank登录号NC_004178)，使用传染性法式囊病(IBD)病毒的极毒病毒株Ehime 91(J Vet Med Sci.1992，54(1)：153；JVI.2002，76(11)：5637)产生VP2植物优化的核苷酸序列。(VP2序列见图14)。
实施例2：制备转基因烟草
转化前3-4天，在新鲜培养基中传代培养1周龄NT-1培养物，方式是将2ml该NT-1培养物加至40ml NT-1培养基中。在暗处于25±1℃在摇床上以100rpm维持此传代培养物。
NT-1培养基
试剂 每升
B1肌醇原液(100X)(1升)
硫胺素HCl(Vit B1)-0.1g
MES(20X)(1升)
MES(2-N-吗啉代乙磺酸)-10g
肌醇(myoinositol)-10g
Miller’s I(1升)
KH2PO4-60g
从甘油贮存物将含有目的表达载体的根癌农杆菌划线接种在含有50mg/l.壮观霉素的LB培养基平板上。细菌培养物在暗处于30℃孵育24-48小时。选择一个良好形成的菌落转移至3ml含有50mg/L壮观霉素的YM培养基中。此液体培养物在暗处于30℃在摇床上以250rpm孵育直到OD600为0.5-0.6。这大约需要24小时。
LB培养基
YM培养基
(或者，可以购买粉末形式的YM(Gibco BRL；目录号#10090-011)。将11.1g加入1升水制备液体培养基)。
转化当天，每ml NT-1培养物加入1μl 20mM乙酰丁香酮。乙酰丁香酮原液在转化当天在乙醇中制备。损伤NT-1细胞以增加转化效率。为了进行损伤，通过5ml宽孔无菌移液管将悬浮培养物反复上下(20次)抽吸。分别向10.60×15mm焙养板中转移进4毫升悬液。留出一个平板用作未转化的对照。大约将50-100μl农杆菌悬浮物各加到剩余的9个平板上。用Parafilm包裹平板然后在暗处于25±1℃在摇床上以100rpm孵育3天。
将细胞转移至无菌50ml锥形离心管，并用NTC培养基(含有高压灭菌后添加的500mg/L卡唑霉素的NT-1培养基)补至45ml最终体积。混合，然后以1000rpm在配有吊桶式转头的离心机中离心10分钟。除去上清液，所得沉淀重新悬浮在45ml NTC中。重复洗涤。离心悬浮物，弃去上清液，沉淀重新悬浮在40ml NTC中。将5ml等分试样铺在含有NTCB10培养基(用8g/l琼脂固化的NTC培养基/琼脂；补充有高压灭菌后添加的10mg/lbialaphos)的各培养板(150×15mm)上。用Parafilm包裹平板然后于暗处维持在25℃±1℃。在转移至培养室之前，将平板打开置于层流罩超净台中，以允许过量液体蒸发。6-8周后，出现推定的转化体。选择这些转化体并转移至新鲜NTCB5(用8g/l琼脂固化的NTC培养基/琼脂；高压灭菌后补加5mg/l bialaphos)。用Parafilm包裹平板并在暗处于25℃±1℃培养。
在死的未转化细胞背景上出现小簇愈伤组织形式的推定转化体。将这些愈伤组织转移至NTCB5培养基并允许其生长几周。选择每个推定的转化体的一部分用于ELISA分析。通过至少2轮ELISA分析后，选择具有最高抗原水平的株系。然后，在平板培养物(偶尔在液体培养物)中扩增每个原种系的愈伤组织材料的量。
实施例3：抗原制备
使用蠕动泵和硅氧烷管道系统通过收获口从发酵罐取出细胞。细胞被泵至含有30μm Spectramesh的锥形过滤装置上，通过真空细胞被过滤为湿细胞滤饼。然后将细胞悬浮在含有Dulbecco磷酸缓冲盐水(目录号#21-031-CV Mediatech，Inc.)和1mM乙二胺四乙酸(EDTA；目录号E(884，Sigma Aldrich))的冷裂解缓冲液中，比率为每克过滤后的细胞2ml缓冲液。在处理之前将此细胞浆状物置于5℃。在微流化前，可以使用SilversonL4RT Mixer以6000rpm匀浆细胞5-10分钟。安装有100μm Z组态相互作用室(H10Z)的Microfluidics 110L型微流化器以大约200ml冷裂解缓冲液起动。室压设定在18,000 PSI，并且该相互作用室：输入和输出线用冰覆盖。样品以100ml/min流速通过微流化器并在冰上收集裂解的细胞悬浮液。加工后的溶液通过以2800xg在4℃离心15分钟去除细胞碎片而澄清。具有释放的HN、HA、LT或VP2蛋白质的上清液与细胞碎片沉淀分离，并储存在-80℃。将此2800xg沉淀重新悬浮在2倍过量的新鲜裂解缓冲液中，在5℃孵育16小时以提取与细胞碎片保持结合的HN蛋白质。在4℃以2800xg在吊桶式转头中离心细胞碎片15分钟，倾析上清液并储存在-80℃。
通过在4℃以2800xg离心冷储存物15分钟进行此大量物质的加工，在真空下通过30μm Spectramesh过滤上清液。可以使用Pall Centramate切线流系统使用小于产物靶分子量的分子量截断膜浓缩此大量上清液物质。进口和停留线被引导至产物容器，汇合的产物被浓缩10-20倍。测试渗透物以检查产物是否漏出。在完成浓缩后，用～500ml DPBS冲洗Centramate装置，将此洗涤物加入最终的浓缩池。浓缩物储存在4℃或-80℃。
为了进行超声，从细胞培养物直接收获表达HN、HA或空对照的所有湿NT-1细胞，通过在布氏漏斗上放置Spectramesh 30滤器并使用轻微真空倾倒细胞和培养基通过滤器，过滤以除去过量的培养基。0.5g细胞置于2ml缓冲液(Dulbecco氏磷酸缓冲盐水和1mM EDTA)中，然后在冰上超声15-20秒。使用装有可置换Microtip的Branson450超声仪以8的输出控制、60的占空因数(duty cyde)超声不同时间量。然后将超声物放在冰上备用。对于更大细胞量，超声所需时间按比例增加(例如，对于250g细胞，超声增加至8-10分钟)。
实施例4：抗原提取
为了检查非去污剂处理是否能够从转化的NT-1细胞释放ELISA信号并允许生物活性的保持，设定了一系列处理以涉及比较无去污剂的处理和各种水平的超声或微流化。结果是惊人的，因为在提取缓冲液中超过20秒的超声期完全破坏来自带有pCHN的NT-1细胞系的HN的血细胞凝集活性，但不破坏ELISA信号。相反，在DPBS中仅20秒的超声不仅释放可通过ELISA信号检测的抗原，而且可溶性蛋白质提取物显示出优良的血细胞凝集活性(见表1)。
使用在无强去污剂或无高浓度去污剂的情况下提取的植物来源HN作为抗原用于血凝抑制测定中，以测定针对天然病毒产生的多克隆抗体是否能够识别并抑制植物来源HN造成的RBC凝集。结果表明，天然抗体以类似于识别天然病毒的方式识别植物来源HN的血细胞凝集表位(表2)。表2的数据还说明对照NT-1细胞或表达非血细胞凝集蛋白质的NT-1细胞不造成红细胞凝集也不受NDV特异性血清的影响。在本实施例中，植物来源蛋白质的提取物稀释至4个HA(血细胞凝集)单位，然后用NDV特异性多克隆抗血清处理。4个HA单位是用于滴定血清的标准病毒量。
上述数据证明，对于表达HN或HA的转化NT-1细胞系，使用不利用强去污剂的提取方法并减少细胞破碎量可以产生保持血细胞凝集活性的细胞外级分。为了确定来自无去污剂提取的NT-1细胞的HN蛋白质是否具有可能与疫苗效力有关的其它生物活性，检查HN提取物结合鸡细胞受体的能力。免疫荧光染色指示，不能区别用天然病毒或pCHN＝18提取物处理的鸡胚成纤维细胞(CEF)。因此，植物来源的HN保持了与病毒一样的结合靶细胞表面受体的能力。
来自表1和2以及上述血细胞凝集和免疫荧光试验的组合数据提示，来源于本发明转基因NT-1细胞的HN蛋白质同时保持了免疫性质和生物学性质。而且，可以在缺少去污剂的情况下，从植物细胞以有效的天然形式释放蛋白质和免疫保护性颗粒。以上提供的数据中最重要的是针对天然病毒的抗血清在HAI试验中可以识别植物来源的HN。含有比背景高至少4倍的血细胞凝集抑制(HAI)活性效价的鸡几乎总是一定程度的抵抗强毒病毒攻击。
为了检查HN产量是否可以通过其它机械破碎方式得以增加，按上述将细胞暴露于微流化。使用各种压力以检查破碎的效果和HN蛋白质的生物活性；表3显示了本研究的结果。此数据提示，使用该破碎方法时每单位质量HN蛋白质的血细胞凝集活性量可以改变10倍以上，然而蛋白质浓度仅仅增加大约20％。这些数据说明，HN蛋白质结合成通过超声仅仅部分释放的较大颗粒，并且可以存在保持生物活性的较小颗粒。使用产生更均一提取物的破碎方法可以回收额外的活性多肽。
实施例5：定量ELISA
定量ELISA VP2
用在0.01M硼酸缓冲液中1∶2000稀释的鸡抗IBDV多克隆抗血清(SPAFAS Lot.No.G0148)，以每孔100μl包被Nunc Maxisorp 96孔微量滴定ELISA板；板在5℃孵育过夜。用300μl/孔PBS-T(含有0.05％Tween 20的1xPBS，Sigma Cat.No.P-1379)洗涤板3次。然后每孔在37℃与200μl封闭缓冲液(5％(w/v)脱脂奶粉，Difco Cat.No.232100，在PBS中)一起孵育1小时。用PBS-T以300μl/孔洗涤孔3次。将IBDV参照抗原(BEI失活的IBDV D-78株，Lot No.220903IBDV)在封闭缓冲液中稀释至1000ng/ml VP2的终浓度。通过在B行向双孔中施加200μl样品而剩余的孔施加100μl封闭剂，将稀释的参照抗原和试验抗原样本加入平板。通过混合并每孔转移100μl制备连续2倍稀释物，每个参照或样品6个稀释。然后，在37℃孵育板1小时，在PBS-T中洗涤3次，之后每孔加入在封闭缓冲液中1∶10,000稀释的100μl R-63单克隆抗体腹水(IBDV VP2特异性，Lot.No.190903R-63)，37℃孵育1小时。用PBS-T洗涤板3次。以100μl/孔加入在封闭缓冲液中1∶2000稀释的山羊抗小鼠IgG过氧化物酶标记的抗体缀合物(KPL Cat.No.074-1806)，并将板在37℃孵育1小时。在PBST-T中洗涤板3次并向每个板加入100μl ABTS底物(KPL Cat.NO.50-66-01)，室温孵育大约5分钟。使用Tecan Sunrise平板读数器测定405nm波长下的光密度。使用Tecan Magellan软件传送和显示数据。使用Microsoft Office Excel 2003进行线性回归和定量分析。
用5μg/孔0.01M硼酸缓冲液中的混合GM1神经节苷脂以100μl/孔包被Nunc Maxisorp 96孔微量滴定ELISA板；室温孵育板过夜。用PBS-T(含有0.05％Tween 20的1xPBS，Sigma，Lot.NO.120K0248)洗涤板3次。然后每孔在37℃用在PBS-0.05％Tween 20中含有5％(w/v)脱脂奶粉的200μl封闭缓冲液孵育1小时。用PBS-T以250μl/孔洗涤孔3次。将LT参照抗原[或LT-B参照抗原]稀释成50ng/ml。将样品预先稀释在封闭缓冲液中。通过在A行中施加200μl样品并在剩余行中施加100μl封闭缓冲液，将稀释的参照抗原和样品加入板中。通过混合和每孔转移100μl，制备2倍连续稀释物。然后板在37℃孵育1小时，在PBS-T中洗涤3次，并每孔加入100μl封闭液中稀释的LT-A或LT-B特异性抗血清，在37℃孵育1小时。在PBS-T中洗涤板3次，然后加入100μl过氧化物酶标记的抗体缀合物，在37℃孵育1小时。在PBS-T中洗涤板3次并向每个板添加50μl TMB底物。在底物添加后20分钟加入TMB终止溶液。使用TecanSunrise平板读数器测定450nm波长的光密度。使用Tecan Magellan软件传送和显示数据。使用Microsoft Excel 2000版9.0.3821 SR-1进行线性回归和定量分析。
定量ELISA HN
HN的定量ELISA可以通过在试验前一天包被板来实施。向每个平底96孔微量滴定板每孔加入50μl捕获抗体(50％甘油中的兔抗HN，稀释(1∶500)在0.01M硼酸缓冲液中)。覆盖板并在2℃-7℃孵育过夜(12-18小时)。应允许包被的ELISA板平衡至室温(大约20-30分钟)，然后用PBS-T洗涤3次，每次每孔洗涤200-300μl。通过每孔添加200μl的3％脱脂奶封闭溶液封闭整个板以防止非特异性反应。然后板在37℃±2℃孵育2小时(+10分钟)(用板盖或等效物覆盖)。HN参照抗原(Ag)加入1％脱脂奶封闭剂中至250ng HN/ml浓度；试样抗原稀释在1％封闭剂中。用PBS-T洗涤HN ELISA板一次，并向B行每孔加入100μl稀释的HN参照抗原和HN测试样品；向所有剩余的孔中每孔加入50μl的1％封闭剂；通过从B行每孔转移50μl至G行，在板上向下连续稀释样品，每次转移前用移液管混合4-5次。覆盖板并在37℃±2℃孵育1小时(+10分钟)；用PBS-T洗涤ELISA板三次。将于50％甘油中的50μl NDV HN 4A腹水在3％封闭剂中(1∶2000)加至每孔，覆盖板并在37℃±2℃孵育1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板三次，向每孔加入50μl在3％封闭剂中1∶3000稀释的50％甘油中的兔抗小鼠IgG；覆盖板并在37℃±2℃孵育1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板三次，向每孔加入50μl ABTS过氧化物酶底物溶液(在RT(室温)平衡至少30分钟)。覆盖板并在暗处于RT孵育15-20分钟。在405nm波长读取孔的光密度(使用492nm参照滤光器)，HN参照抗原的初始稀释应当在0.7-1.0 OD，这充当此ELISA的阳性对照。
定量ELISA HA
为了进行HA的定量ELISA，在测定前一天包被板。向平底96孔微量滴定板的每孔中加入50μl/孔捕获抗体(50％甘油中的山羊抗Hav5，在0.01M硼酸缓冲液中稀释(1∶1000))。覆盖板并在2℃-7℃孵育过夜(12-18小时)。允许包被的ELISA板平衡至室温(大约20-30分钟)，然后用PBS-T洗涤3次，每次洗涤每孔200-300μl。通过每孔添加200μl的3％脱脂奶封闭溶液封闭整个板以防止非特异性反应。然后板在37℃±2℃孵育2小时(+10分钟)(用板盖或等同物覆盖)。AIV-HA(尿囊液)参照抗原加入1％脱脂奶封闭剂中至1000ng HA/ml浓度；试验抗原稀释在1％封闭剂中。用PBS-T洗涤HA ELISA板一次，并向B行每孔加入100μl稀释的HA参照抗原和HA试验样品；向所有剩余的孔中加入每孔50μl的1％封闭剂；通过从B行每孔转移50μl至G行，在板上向下连续稀释样品，在每次转移前用移液管混合4-5次。覆盖板并在37℃±2℃孵育1小时(+10分钟)；用PBS-T洗涤ELISA板三次。将50μl于50％甘油中的鸡抗AIV多克隆抗血清在3％封闭剂中(1∶2000)加至每孔，覆盖板并在37℃±2℃孵育1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板三次，向每孔加入50μl在3％封闭剂中1∶3000稀释的在50％甘油中的山羊抗鸡IgG；覆盖板并在37℃±2℃孵育1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板三次，向每孔加入50μl ABTS过氧化物酶底物溶液(在RT平衡至少30分钟)。覆盖板并在暗处于RT孵育15-20分钟。在405nm波长(使用492nm参照滤光器)读取孔的光密度(OD)。HA参照抗原的初始稀释应在0.7-1.0OD，这充当此ELISA的阳性对照。
定量ELISA LT和LTB
用5μg/孔在0.01M硼酸缓冲液中的混合的GM1神经节苷脂，以100μl/孔包被Nunc Maxis 96孔微量滴定ELISA板；室温孵育板过夜。用PBS-T洗涤板3次。然后每孔与在PBS-T中包含5％(w/v)脱脂奶粉的封闭缓冲液(200μl/孔)一起在37℃孵育1小时。用PBS-T洗涤孔3次，250μl/孔。参照抗原和样品抗原与PBS-T按1∶1混合，之后加入板中。在第一孔中将LT参照抗原和LTB参照抗原稀释至50ng/ml。通过在A行施加200μl样品并在剩余行施加100μl封闭缓冲液，将样品加至板中。通过混合并每孔转移100μl，制备2倍连续稀释物。然后板在37℃孵育1小时，在PBS-T中洗涤3次，并每孔加入100μl在封闭缓冲液中的稀释抗血清，37℃孵育1小时。在PBS-T中洗涤板，然后加入100μl抗体缀合物并37℃孵育1小时。在PBS-T中洗涤板3次，向每个板加入50μl TMB底物，并在底物添加后20分钟加入TMB终止溶液。使用Tecan Sunrise平板读数器测定450nm的光密度。使用Tecan Magellan软件传送和显示数据，使用Microsoft Excel 2000版本9.0.3821 SR-1进行线性回归和定量分析。
实施例6：血清ELISA
血清ELISA LT
通过断头(0-7天龄的鸡)或在翅蹼或颈静脉中静脉穿刺收集血液。在断头前，通过颈脱位或通过暴露CO2 1-5分钟对鸡实施安乐死。血液从动物机构运输到实验室，放置在2-7℃下45分钟以促进和凝结血块。将血液样品转移至37℃水浴，持续10分钟，然后使用Beckman GPR离心机在2-7℃以2500rpm离心20分钟。无菌条件下从每个管子取出血清，按0.5-1.5ml等分试样分装在冷冻管(Nunc)中，并在使用前储存在-18℃。对于血清ELISA，利用1.5μg/孔或15μg/ml通过在2-7℃孵育过夜来进行神经节苷脂吸附步骤。用PBS-T洗涤板3次，然后在37℃用3％脱脂奶PBS封闭1小时。神经节苷脂吸附后，为了滴定每个血清样品的抗体，每孔加入100μl 2.5μg/ml在封闭缓冲液中的LT-B或LT，并在37℃孵育1小时。用PBS-T洗涤板3次，然后将稀释在封闭缓冲液中的200μl血清样品加至A行，剩余的行加入100μl封闭缓冲液。除非另行说明，对于血清，起始稀释为封闭缓冲液中1∶10。在2倍连接稀释血清样品后，在37℃孵育板1小时，然后在PBS-T中洗涤三次。加入HRP标记的山羊抗鸡缀合物，在37℃孵育1小时。洗涤板并加入100μl ABTS，孵育直到利用TecanSunrise平板读数器测定阳性对照在405/492双波长处给出0.7-1.0吸收为止。利用Tecan Megellan软件传送和显示数据。利用Microsoft Excel 2000版本9.0.3821 SR-1进行线性回归和定量分析。对于每个处理组，使用Microsoft Excel 2000版本9.0.3821 SR-1确定血清几何平均效价(GMT)。对于这些计算，＜10的背景ELISA效价被赋予值1。使用最小二乘方分析(least squares ancdysis)，确定经处理的鸡和对照的最小均方差异。如果处理组和未接种未受攻击的对照组具有显著差异，则处理被评定为有效的。
血清ELISA NDA-HN
用稀释于0.01M硼酸缓冲液(1∶2000)的兔α-NDV混合抗血清(与水中的50％甘油1∶2混合)包被板(100μl/孔)。板在覆盖下于2-7℃孵育过夜；在室温平衡板大约20-30分钟。利用Titertek M96洗板器或等同物用PBS-T(1xPBS+0.05％Tween 20)以300μl/孔洗涤板3次。用PBS-T中的5％脱脂奶(封闭缓冲液)封闭板(200μl/孔)并在37℃孵育板2小时。用Titertek M96洗板器或等同物，用PBS-T以300μl/孔洗涤板1次。在封闭缓冲液中1∶200稀释NDV尿囊液。向板加入100μl/孔的稀释抗原，在37℃孵育板1小时。用Titertek M96洗板器或等同物，用PBS-T以300μl/孔洗涤板3次。稀释测试的鸡血清样品(1∶50)。稀释阴性对照血清(1∶50)(Neg.Control 27NOV00)。稀释阳性对照血清(1∶10,000或1∶20,000)(SPAFAS鸡α-NDV血清)。所有血清样品均在封闭缓冲液中稀释。向列1的B至G行添加100μl/孔阴性对照血清；向2-3列的A行添加200μl/孔的阳性对照血清；向适当列的A行添加200μl/孔测试血清样品。这允许每板有4个样品，每个样品有8个稀释。向所有剩余的孔加入100μl/孔封闭剂；在板上向下2倍连接稀释阳性对照血清和试验血清样品。从板的A行向下至H行稀释样品，丢弃剩余的100μl/孔。在37℃孵育板1小时，并用Titertek M96洗板器或等同物用PBS-T以300μl/孔洗涤板3次。在封闭缓冲液中稀释山羊α-鸡IgG(H&L)-HRP(1∶3000)。向各板添加100μl/孔该稀释的缀合物；一旦向板中加入缀合物，于暗处在RT平衡ABTS底物。板在37℃孵育1小时；并用Titertek M96洗板器或等同物用PBS-T以300μl/孔洗涤板3次。向每个板加入100μl/孔预温的ABTS底物。板间间隔2-3分钟。当阳性对照的第一个稀释达到0.7-1.0吸收时，在TecanSunrise平板读数器或等同物上以405/490nm双波长读板。
血清ELISA AIV-HA
用在0.01M硼酸缓冲液中稀释(1∶1000)的兔α-HA混合抗血清包被板。在2-7℃覆盖下孵育板过夜。在室温平衡板大约20-30分钟。利用Titertek M96洗板器或等同物用PBS-T(PBS原液+0.05％Tween 20)以300μl/孔洗涤板3次。用PBS-T中的5％脱脂奶(封闭缓冲液)封闭板(200μl/孔)并在37℃孵育板1小时。用Titertek M96洗板器或等同物，用PBS-T以300μl/孔洗涤板1次。在封闭缓冲液中1∶100稀释失活的T/W/68 AIV尿囊液并向板加入100μl/孔此稀释抗原；在37℃孵育板1小时。用TitertekM96洗板器或等同物，用PBS-T以300μl/孔洗涤板3次。在封闭缓冲液中稀释测试鸡血清样品(1∶50)；稀释阴性对照血清(1∶50)；稀释阳性对照血清(1∶25600)(USDA/SEPRL鸡α-AIV(T/W/68抗血清))。向列1的B至G行添加100μl/孔阴性对照血清；向2-3列的A行添加200μl/孔的阳性对照血清；向适当列的A行添加200μl/孔试样血清样品；向所有剩余的孔加入100μl/孔封闭缓冲液。在板上向下2倍连接稀释阳性对照血清和试验血清样品，丢弃剩余的100μl/孔，在37℃孵育板1小时。以TitertekM96洗板器或等同物用PBS-T以300μl/孔洗涤板3次。在封闭缓冲液中稀释山羊α-鸡IgG(H&L)-HRP(1∶3000)，向各板添加100μl/孔该稀释的缀合物。一旦向板中加入缀合物，于暗处在RT平衡ABTS底物。板在37℃孵育1小时；用Titertek M96洗板器或等同物用PBS-T以300μl/孔洗涤板3次。向每个板加入100μl/孔平衡的ABTS底物。板间允许2-3分钟间隔。当阳性对照的第一个稀释达到0.7-1.0吸收时，在Tecan Sunrise平板读数器或等同物上以405/490nm双波长读板。
血清ELISA IBDV-VP2
按上述用于LT的血清ELISA的方式进行血液和血清收集。对于血清ELISA，以1.0μg/ml 0.1M硼酸缓冲液(pH 6.5)中的鸡抗IBDV吸附于板，在2-7℃孵育过夜。用PBS-T洗涤板3次，然后在37℃用PBS-T中的3％脱脂奶封闭1小时。200μl稀释在封闭缓冲液中的鸡血清样品加至A行，100μl封闭缓冲液加至剩余行。除非另外说明，对于血清，起始稀释是在封闭缓冲液中1∶10。在2倍连接稀释血清样品后，在37℃孵育板1小时，然后在PBS-T中洗涤3次。加入HRP标记的山羊抗鸡缀合物并在37℃孵育1小时。洗涤板，并加入100μl ABTS，孵育直到使用Tecan Sunrise平板读数器测得阳性对照在405/492双波长给出0.7-1.0吸收为止。如用于LT的血清ELISA时所述，使用Tecan Magellana软件传送和显示数据。
实施例7：红细胞的血细胞凝集和血细胞凝集抑制
血细胞凝集：从Colorada Serum(L#8152)获得Alsevers溶液中的鸡红细胞(CRBC)。为了制备1％的CRBC溶液，将5ml转移至15ml锥形管并250xg离心10分钟。从RBC沉淀中吸出上清液和暗黄覆盖层；在1xDPBS(Dulbecco氏磷酸缓冲盐水)(L#003435 JRH)中重新悬浮以洗涤沉淀两次，并250xg离心10分钟。将沉淀在DPBS中重新悬浮至1％(v/v)。为了验证悬浮物的浓度，将400μl转移至1.6ml去离子水并通过剧烈混合裂解细胞。OD540在0.4至0.5。该1％溶液在使用前储存在2-7℃。为了测试血细胞凝集，首先用Static GuardTM喷洒96孔U型底盘(Falcon)并在纸巾上吸干。在DPBS中1∶2预先稀释病毒样品，将50μl DPBS加入96孔板的每孔。向第1行添加稀释的病毒，然后对每个病毒样品制备所需数目的2倍连接稀释。向每孔加入50μl的1％CRBC，600rpm混合板20秒。将板放置在湿纸巾上并在2-7℃孵育至少1小时或者孵育直到对照孔(1∶1比例的DPBS和CRBC)中的CRBC沉淀至板底部。终点为提供100％凝集的系列中最后一个孔的稀释。
血细胞凝集抑制(HAI)：在DPBS中预先稀释病毒以提供每50μl 4至8 HA单位(基于上述的病毒滴定)。使用每孔25μl DPBS在第1列和第3-12列中设置分开的板；在第1列和第3列中每孔加入25μl血清；在第3列中血清通过10个孔作2倍连接稀释。然后在第3-12列的所有孔中加入预先滴定的病毒(25μl)并且600rpm混合20秒；在室温孵育板1小时±15分钟。然后每孔加入50μl的1％CRBC，600rpm混合20秒，对于AIV在加湿室中2-7℃孵育过夜，或者对于NDV在2-7℃孵育1-2小时。血清效价为在连接稀释中100％抑制凝集的最后一孔。
实施例8：兔中的抗原性
为了测试如上所述在非去污剂缓冲液中提取的免疫保护性颗粒中的植物来源蛋白质是否将在动物物种中产生抗体，制备HA和HN蛋白质并接种兔子。用植物来源的HA-AIV或者HN-NDV按照表4提供的剂量方案接种3月龄新西兰白兔。对于初次接种，抗原与完全弗氏佐剂(CFA)混合，不完全弗氏佐剂用于所有的加强接种。表5中提供了两种蛋白质诱导的抗体效价。结果说明两次接种后，两种蛋白质均诱导HAI抗体效价，证明从生长后期的NT-1细胞制备的本发明植物来源免疫保护性颗粒能够在识别天然蛋白质的哺乳动物中诱导抗体。该数据提示，植物来源的HN和HA与天然来源的HN和HA蛋白具有相同的特征。接种兔的植物来源AIV-HA的效价高于NDV-HA植物来源蛋白诱导的效价。这可能是有意义的，因为每单位AIV-HA蛋白比NDV-HN具有更低的总体生物活性(血细胞凝集)(表4第4列)。
实施例9：表达的抗原的效力和生物活性：对家禽的攻击和体外细胞毒性
对新城疫病毒(NDV)的攻击试验。为了检查植物来源的HN蛋白的效力，使用2天龄和10天龄的鸡在两个分开的试验中进行接种。在表6中提供用于这些研究的试验#16的剂量浓度。所有疫苗接种物均用在25℃摇瓶培养15-20天的NT-1细胞的可溶性级分配制。用于两个试验中的佐剂均是来自Corixa，Inc.的MPL-TDM。鼻内组仅给予MPL作为佐剂。
用来源于NT-1的生物活性(血细胞凝集阳性)NDV-HN蛋白，以表6中所示的每次接种HN蛋白量，通过不同途径利接种两天龄SPF鸡。该试验的血清学结果和攻击结果在表7中提供。所有的对照组按照预期的出现应答。在接种物中未接受NDV-HN抗原的鸡有100％死亡率，而通过SQ途径接受20μg天然NDV的对照鸡有100％存活率。在使用植物来源HN抗原组的试验处理中，在组#3(无佐剂存在下SQ接种)中有75％保护作用，而在组#4(有佐剂存在SQ接种)中有80％保护作用。通过IN和口服途径接种的剩余处理组有100％死亡率。然而，在组6中，两只鸡出现延迟死亡，说明这些鸡可能已经被敏化接种(见表10，第14行)并且通过该途径施用时需要不同制剂以增强效力。在随后的试验(#18)中，用表8方案中所述的剂量接种10天龄SPF鸡。一个对照组(#3)——未接种未进行攻击的处理——用于显示舍饲和设施对于鸡的一般健康无副作用。在该试验中对照组也如预期地应答。由于来自两个试验的鸡以相同的设施实施攻击，处理组#2用作试验16(表7)和试验18(表9)的阳性对照。在所有用来源于NT1细胞的HN通过SQ接种的剩余组中，在组#7中100％存活率，在组5和组6中各80％存活率，在组4中60％存活率(见表9)。
针对禽流感(AIV)的攻击试验：在独立的研究中，用植物来源的血细胞凝集蛋白(HA)接种肉仔鸡(broiler chick)。使用描述用于NT1CHN-18的载体系统，用植物来源的禽流感病毒(AIV)株A/turkey/Wisc/68(H5N9)HA蛋白基因序列转化NT1细胞。用于HA-AIV蛋白质的转基因植物细胞生产的NT-1系命名为CHA-13。从孵化场获得3日龄鸡，将10只鸡随机放置在笼中用作每个处理组。每个处理组的使用剂量显示在表11中。在研究的第0、14和28天给予鸡三次剂量，在第0、21、35和45天收集血液样品。分析每个血液样品中血清的HAI效价；在第35天，将鸡运往Athens，GA的AIV家禽研究实验室，并在那里用强毒性AIV(Chicken/Pennsylvania/1370/1983)攻击。表11提供的数据说明，来源于CHA-13 NT-1系的30μg剂量HA蛋白在仅两剂疫苗制剂后提供向HAI阳性效价的血清转变。在攻击后，所有接种组均表现出抵抗AIV的作用；50或以上的攻击得分指示疾病或临床病理。所有组不管制剂如何均显示出在攻击后与天然AIV非常相似的效价，说明植物来源蛋白诱导了对天然病毒的记忆应答(表11，第4列)。
传染性法式囊病病毒(IBDV)的攻击试验：上述试验说明根据本发明来源于转基因植物细胞的两类糖蛋白是高度有效的，因为它们可以为靶物种提供抵抗病毒攻击的保护作用。在其它研究中，使用与CHN-18和CHA-13所用相似的载体和启动子，将来自IBDV的非糖化结构蛋白VP2的基因转化至NT-1细胞。此处描述的所得转染细胞命名为CVP2-002。在此研究中，在孵化后第7、21和35天，用NT-1对照细胞裂解物、来自表达IBDV VP2蛋白质的转基因NT细胞的细胞裂解物(转化事件CVP2-002)和商业上可获得的Vi Bursa K+V灭活传染性法式囊病病毒(IBDV)疫苗(Lohman Animal Health)接种SPF鸡。在10L发酵罐中扩增NT-1对照细胞，在摇瓶中扩增第6代CVP2-002细胞。培养后第10-14天收获细胞，使细胞通过装有100μm Z组态相互作用室的Microfluidics 110L微流化器以18,000 PSI裂解细胞。所得细胞裂解物在2000xg离心澄清。通过冷冻干燥浓缩澄清的上清液。用佐剂配制疫苗，在接种前利用ELISA测定各疫苗的VP2浓度。表12描述了每个接种目的疫苗制剂、给药途径和VP2浓度。在孵化后21、35和42天收集血液样品，并在血清学ELISA中测试抗体应答并在IBDV血清中和(SN)试验中测试中和抗体效价。通过双侧眼内滴注50 EID50胚胎来源的IBDV STC株，对鸡实施攻击。攻击后10天对鸡实施安乐死。测定每只鸡的囊与体重(BBW)比和脾与体重(SBW)比。在福尔马林中固定每只鸡的囊组织，并对通过囊滤泡减少指示的IBDV相关损伤进行评分。与未攻击的对照鸡比较BBW比、SBW比和囊损伤得分。如果在未攻击和对照之间BBW没有统计学差异，则鸡被评价为受保护而免于攻击。表13总结了每个疫苗组的血清学结果和攻击结果，结果说明从植物来源的VP2抗原产生的血清学应答实际上高于(通过ELISA)从常规灭活IBD疫苗产生的应答。而且，通过BBW测定的抗攻击保护作用说明了植物来源的VP2的保护与常规灭活IBD疫苗一样(比较表13第4行与第10行)。
热不稳定毒素在Y1肾上腺细胞中的细胞毒性：从ATCC购买来自小鼠的Y1肾上腺细胞(CCL-79，L#353400)。在37℃融化细胞小瓶，放入25cm2 T型烧瓶(Corni ng)中，该烧瓶中含有10ml由15％供体马血清(Quad-5#2212)、2.5％胎牛血清(JRH L#7N2326)、F-12K培养基(GibcoL#1089716)的1％glutamax-1(Gibco L#1080323)所组成的生长培养基。在37℃、5％CO2下孵育细胞。每一代细胞都保持在该生长培养基中，并在该培养基中进行LT和CT毒性测定。为了进行测定，细胞在96孔细胞培养板(Nunc)上传代并允许达到80％汇合度。将LT毒素在F-12K生长培养基中稀释至1μg/ml。在96孔微量滴定板上通过2倍连接稀释进一步稀释毒素，操作为向板的A行添加100μl该预先稀释的样品。然后将A行中的50μl转移至下一孔的50μl生长培养基中而制备此2倍连接稀释物。取决于样品或者细胞的可获得性，将样品的每个稀释物转移至1-4孔Y1肾上腺细胞中。LT毒素的终点滴度为获得50％细胞毒性(细胞死亡)所需的蛋白质量(EC50)(Guidry等，1997；Donta，等1974)。所用毒素是大肠杆菌(E.coli)热不稳定毒素的G192、R72和K63单氨基酸基因替换突变体，这些突变体分别由NT-1转基因细胞系SLT105、SLT107和SLT102产生。LT毒素的此三种突变形式在体外和体内生物学试验中据报道是有毒的，G192、R72和K63分别提供比野生型LT毒素低大约10倍、100倍和1000倍的毒性(Rappuoli等，1999，Immunology Today 20：293-500)。在Y1肾上腺测定中比较植物产生的LT突变体的浓度与来自大肠杆菌的野生型LT毒素的毒性(见表14)，结果显示观察到植物来源的毒素与来源于大肠杆菌的相同突变体具有相似的敏感性水平。而且，由于LT毒素的定量是通过G1神经节苷脂捕获ELISA方法测定的，因此植物制备的毒素模拟了完全装配的全毒素(Guidry等，1993，Inf.and Imm.65：4943-4950)。
粘膜递送从CHA-13和CHN-18植物制备的免疫保护性颗粒
为了测定在粘膜表面上递送的非复制型植物来源抗原是否是有效的免疫保护性物质，通过直接在眼和鼻粘膜表面上接种抗原进行鸡试验，其中所用制剂通过微流化制备以产生的用于接种的均一乳化物。7天龄肉仔鸡随机分配在笼中(每组5只)，并用2.6-16.7μg/只鸡的抗原接种(见表15)。在研究的第0、14和21天给予鸡三剂疫苗，在研究结束时鸡为42日龄。抗原包括来源于CHN-18转基因植物细胞的HN、来源于CHA-13转基因植物细胞的HA和来源于感染的鸡胚尿囊液的灭活禽流感病毒(AIV)。如实施例3所述制备抗原制剂。在不同的制剂中使用5种单独的佐剂，通过血细胞凝集抑制的血清学和血清ELISA测定免疫应答(见表15)。研究结果显示在表16。3次给药后，在接种来源于CHN-18植物的HN的鸡中，除了一种制剂外其余所有制剂导致血清转变。在接种CHA-13来源的HA的鸡中，其中一个制剂导致血清转变；在接种灭活AIV抗原的鸡中两个制剂导致血清转变。对于所有应答组共同的一个佐剂是与胆固醇混合的Quil A。结果说明，通过在粘膜表面接种来源于植物的非复制型抗原，在鸡中提供血清学应答。
实施例10：表达蛋白质在转基因细胞中的产生和累积
在图15-18中显示了来自生长在10升生物反应器或者摇瓶中的转基因细胞培养物的rDNA表达蛋白质。在实施例2所述的培养基中产生CHN-18、CHA-13、SLT102或者CVP2-002转基因细胞的NT-1转基因细胞培养物，在培养12天后(稳定期)收获。然后在无菌条件下将来自摇瓶的接种物转移至10升Bioflow 3000发酵罐(New Brunswick)，该发酵罐中含有10L包含1ml Pluronic L61消泡剂的生长培养基。在25℃以100rpm的搅拌和2.5升/分钟的通气速率以30％溶解氧实现细胞生产；细胞生产进行9-15天。通过将10ml发酵培养物加入15ml锥形管并2000xg离心10分钟测定收集细胞体积(PCV)，然后作为参数测定并评价细胞体积，以跟踪从接种日至培养第10天或稳定期的细胞生长。数据说明，对于分析的所有转基因细胞系，不管所用的插入基因和启动子系统如何，在大约3天的延迟期后在第3-7天为培养物的指数生长期，之后培养物开始达到稳定期。对于CHN-18，在每一天跟踪可测量的HN蛋白质量。在第1天，新细胞生长前，存在可以倍提取的HN ELISA信号，这代表收获自12天摇瓶培养物的接种物中存在的HN量。然而，HN迅速地降解并且不能检测直到培养的大约第6天——此时细胞达到稳定期——此后在细胞通过稳定期后继续在细胞中积累。HN的表达通过两种不同的测量来跟踪，实心三角代表通过定量ELISA测量的HN蛋白质，实心方块代表血细胞凝集。定量ELISA对于HN蛋白质产生更灵敏，其测量单体和聚合的HN蛋白质，血细胞凝集仅仅测量能够造成红细胞凝集的二聚体或聚合的蛋白质，因此，在可以测量血细胞凝集活性之前需要积累更多的蛋白质(图15)。不管表达何种蛋白质(大肠杆菌LT全毒素、禽流感病毒血细胞凝集蛋白(HA)、传染性法式囊病病毒的VP2结构蛋白、或新城疫病毒的血细胞凝集-神经氨酸酶蛋白(HN))均观察到晚期生产蛋白质的现象(见图16、17和18)。
对于CHA-13和CVP2-002，生产和生长曲线分别示于图16和17。对于CHA-13，生长(PCV)起始于接种后第2天，并在接种后第10天进入稳定期。到接种后第2天蔗糖耗光，到接种后第6天葡萄糖耗光。HA积累起始于接种后第6天(log生长中期)并增加至第14天。细胞生长起始于接种后第2天并在接种后第9或第10天进入稳定期。蔗糖到接种后第2天耗光，葡萄糖在接种后第5天耗光。VP2积累起始于接种后第7天(log生长中期)并增加至第14天。
表达大肠杆菌热不稳定毒素(LT)K63突变体的SLT102转基因NT-1细胞系显示在图18中。LT毒素在第5天至第6天之间开始积累，本试验中未显示收集细胞体积，但是与其它NT-1转基因细胞系的相似。
实施例11：植物制备的蛋白质的稳定性
从重组或者天然来源提取的蛋白质常常由于与蛋白质和细胞组分一起纯化的蛋白酶、糖基化酶、脂酶或其它酶而不稳定。分离自NT-1细胞的蛋白质和免疫保护性颗粒本质上对于多种不同的下游加工行为是稳定并强壮的。在图19中，从10升发酵罐收获稳定期CHN-18细胞并过滤，通过离心澄清，根据实施例3所述方法微流化1次。然后上清液过滤通过0.2或0.45微米滤器以除去可能已经在过滤或微流化操作中引入的任何细菌物，不向这些上清液添加稳定剂，来源于这些转基因植物的蛋白质是固有稳定的。然后材料储存在2-7℃、25℃或冻存在-80℃；发现该材料在所有温度下均是稳定的，但最有意义的结果是当在25℃(环境温度)保存时，发现分离的蛋白质是稳定的(显示在图19)。尽管各月之间观察到信号的变化，但是分离的蛋白质的量在数月后显示出显著的稳定性，可以从这些数据计算的半衰期指示8个月的推断半衰期(0.45微米样品)以及大于1年的推断半衰期(0.2微米过滤的样品)。
实施例12：抗原的亚细胞定位
共聚焦激光扫描显微镜术(CLSM)：通过共聚焦激光扫描显微镜术在转化的MHN-41和CHN-18细胞中定位HN抗原。用于定位方法的抗体是IgG纯化的兔抗HN多克隆抗体(在HN ELISA中的捕获抗体)和HNMab 4A——来自腹水的非纯化抗体(在HN ELISA中的检测抗体)。使用如下方法从培养的植物细胞获得图像。以1000g离心细胞(包括未转化的对照细胞(NT-Ctrl.))5分钟，用3.7％福尔马林固定15分钟。用PBS洗涤细胞两次，每次5分钟。3000g离心细胞2分钟(每次)，然后用0.5％Triton X-100和1％果胶酶处理15分钟。用水洗涤，将水置换为甲醇(-20℃)；通过移液管将细胞加载在具有不同孔的包被的载玻片上，空气干燥(在通风橱中20-30分钟)。用PBS洗涤，然后在3％BSA/PBS中封闭30分钟。一抗(在1％BSA-PBS-T(具有0.05％Tween-20的PBS))在37℃孵育1小时或者在RT孵育1.5-2小时。用PBS-T洗涤3次。用Cy5/Cy2(1∶100)标记的二抗在RT孵育1小时，用PBS-T洗涤载玻片3次并封片。
在NT对照细胞中用Rb抗HN多克隆抗体或HN Mab 4A未观察到染色。使用两种HN特异性抗体，在整个MHN-41系中观察到稳定期细胞的整个细胞质有明亮染色(但细胞核不染色)。(见图20和21)
电子显微镜术：
为了确立表述蛋白的积累位置，在培养10天后收获转基因植物细胞并按下述制备薄切片和免疫金标记。使用自尿囊液新城疫病毒制品纯化的HN蛋白免疫兔，其中所述尿囊液取自10日龄的感染鸡卵胚；从免疫后的兔获得纯化的IgG以实施免疫金标记。为了确定形态学特征，在0.1M磷酸缓冲液(pH 6.8)中的3％戊二醛中固定细胞悬浮液3小时。然后在磷酸缓冲液中洗涤细胞1小时，其中4次更换缓冲液。在磷酸缓冲液中的2％四氧化饿中进行细胞后固定1小时。在上升乙醇系列(25％、50％、75％、95％和100％，每步15分钟)和环氧丙烷中使细胞脱水。细胞留置于环氧丙烷/Epon 812混合物中过夜，之后包埋在Epon812中并于60℃聚合2天。用LKB Ultrotome III切片，用2％乙酸双氧铀和柠檬酸铅水溶液染色，用在80kV操作的Hitachi 7500透射电子显微镜检查。
对于免疫金标记，在磷酸缓冲液洗涤(加有0.02M甘氨酸)后在上升乙醇系列中脱水戊二醛固定的细胞。然后用LR白树脂侵润透细胞过夜，最后包埋并在50℃聚合24小时。
镍网上的切片在PBS缓冲液(pH 7.4)中与1％牛血清白蛋白溶液孵育20分钟以封闭非特异性位点。然后细胞在室温与一抗(在PBS中1∶150稀释)孵育2小时。然后用PBS-BSA漂洗6次(每次3分钟)，与缀合山羊抗兔AB(在PBS中1∶150稀释)的胶体金(15nm)在室温孵育2小时。在PBS中漂洗细胞4×5分钟并在水中漂洗2×1分钟，用乙酸双氧铀染色镍网5分钟。EM图指示在对照细胞和表达HN蛋白的转基因细胞之间存在两个主要区别：第一，在转基因细胞中质体/白色体显示暗颗粒积聚，而在对照细胞中则没有(图22)；第二，可以在转基因细胞细胞壁附近观察到免疫金染色颗粒的积聚而在对照细胞中则没有(图23)。通常，宿主细胞中表达的基因产物出现在细胞指数生长期，并且通常可能在细胞的内质网、高尔基器和其它蛋白质合成亚结构中被染色。联合图19和20所示共聚焦图像，这些数据说明蛋白质产生并沉积在细胞膜和细胞壁中，但是通过电子显微镜不能在细胞核、叶绿体、线粒体、内质网和高尔基器中观察到蛋白质积聚。电子显微镜术证明，稳定后期细胞具有扩大的液泡和被挤压的细胞质和细胞核。共聚焦图像提示，蛋白质被压靠在整个细胞的胞质侧细胞壁和细胞膜上。
不寻常的是，细胞中蛋白质生产和积聚在指数生长后期和稳定期(此时细胞不再活跃代谢)前是不明显的。在生长瓶或发酵罐中接种细胞时表达的蛋白质信号快速丢失(24小时)(见图15)，这说明细胞正在使用该蛋白质作为氮源，当细胞完成活跃生长后可能发生氮源(蛋白质)储存。该现象是以上实施例中所述植物细胞培养物中产生的转基因蛋白质的独特性质。该蛋白质靠近细胞壁和细胞膜的定位帮助解释了意想不到地能够容易地使用机械破碎分离该蛋白质的能力。易于以稳定和有效形式分离每种蛋白质的能力也是预料之外的。尽管任何一种蛋白质常常可以在所选的任何外源宿主系统中制备以研究重组DNA表达，但是许多蛋白质，尤其是跨膜结合的糖蛋白，常常以低水平产生并且一个宿主系统不会以相同的方式表达两种糖蛋白。在此处所述细胞培养物转基因系统中，至少5类蛋白质(酶、I型病毒糖蛋白、2型病毒糖蛋白、LT毒素、及非糖基化的结构蛋白VP2)已经成功地在此同一宿主系统中以相似水平表达。而且，无论蛋白质的类型、转录盒盒启动子系统如何，这些蛋白质均在稳定期晚期积累，并且可以容易地使用相同物理或机械破碎方法从细胞中取出。不管转基因细胞表达何种蛋白质，每种蛋白质均已经以稳定的生物活性形式得以成功分离。
实施例13：植物优化的传染性法式囊病病毒VP2抗原基因
传染性法式囊病(IBD)病毒(或IBDV)的病毒病原体具有二重RNA基因组(J.Virol.(1979)32：593)。全长RNA1被翻译成多蛋白，该多蛋白被加工成VP2、VP3和VP4肽。可以计算机模拟逆转录该基因组RNA，获得相应于天然RNA的蛋白质编码能力的DNA序列。IBVD株Ehime91(E/91)编码天然E/91 VP2蛋白质的1359碱基对(bp)衍生DNA序列可以从GenBank登录号AB024076获得。该序列的分析揭示存在几个被认为有损于最佳植物基因表达的序列基序以及非最佳的密码子组成(见，例如，US专利5,380,831)。为了提供重组VP2蛋白质在单子叶以及双子叶植物中的生产，开发了“植物优化”DNA序列(SEQ ID NO：11)，该序列编码除了在天然E/91蛋白的羧基末端添加单个异亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸残基之外基本等同于天然E/91 VP2蛋白质的蛋白质(本文中公开于SEQID NO：12)。这些额外的氨基酸的密码子基于J.Caston等(J Virol(2001)75：10815)的报道而被包括在内，该报道指出对于VP2衣壳组装，最佳的VP2加工位点在氨基酸456位而非453位之后，此456位是IBD株UK661的VP2序列编码的最后一个氨基酸(GenBank登录号NC_004178)，该VP2序列除了位置451(Leu对Ile)外等同于E/91的VP2序列。因此，从UK661株获得454、455和456位氨基酸(Ile，Ala，Val)以制备456个氨基酸的VP2基因。天然E/91序列编码的VP2蛋白质与植物优化的编码区编码的VP2蛋白质有99.3％同一性，只在454、455和456氨基酸位置存在差别。相反，天然E/91 VP2编码区的衍生DNA与植物优化DNA仅有80.3％同一性。
将外源基因随机整合在植物染色体中，由此存在任何特定整合位点可能促进从整合位点两侧的基因控制元件和开放读框偶然产生新的异常蛋白质的可能性。为了帮助消除这些不想要的并可能有害的蛋白质的产生，在所有6个可能的阅读框中编码翻译终止密码子的额外碱基被包括在VP2编码区下游(“通用终止子”；公开在SEQ ID NO：13)。为了随后克隆步骤的实施，包含3种限制性酶的识别位点的碱基被包括在此有用序列中。
实施例14：构建在植物细胞中表达植物优化的传染性法式囊病VP2抗原基因的基础二元载体pDAB2423
构建含有IBD VP2基因的植物优化核苷酸序列(SEQ ID NO：11)的双子叶植物表达载体。使用基础二元载体(BBV)主链(图24)，在唯一BamHI位点处通过添加AgeI接头进行修饰。此新二元载体(pDAB2407，图25)允许VP2和选择标记表达盒以AgeI/AgeI方式在T-DNA边界之间连接(pDAB2423，图31)。
通过从DAS5 P60C2(图26，PICOSCRIPT，Houston，TX)用BbsI和SacI限制性酶切出合成的VP2序列，组装该表达盒。编码CsVMV启动子和根癌农杆菌(Atu)ORF24 3’UTR(GenBank登录号X00493)的pDAB2406(图27)用NcoI和SacI切割。将pDAB2406主链和VP2插入片段在pDAB2406的NcoI和SacI位点处连接，得到pDAB2415(图28)。用连接的DNA转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(Invitrogen)，筛选阳性克隆。通过使用HindIII x MluI酶进行限制性分析，鉴定阳性克隆，并通过跨越插入片段/载体接头处的测序进行验证。
一旦验证pDAB2415亚克隆后，用NotI切割质粒以分离CsVMV/VP2/ORF24片段。以NotI线性化编码RB7 MAR元件(US5,773,689；US 5,773,695；US 6,239,328；WO 94/07902和WO97/27207)和由拟南芥(At)泛素10(Ubi 10)启动子(Plant J.1997，11(5)：1017；Plant Mol.Biol.1993，21(5)：895；Genetics，1995，139(2)：921)和Atu ORF1 3’UTR(US5428147；Plant Molecular biology，1983，2：335；GenBank登录号X00493)调节的选择标记PAT的pDAB2418(图29)。在凝胶上分离pDAB2418主链和pDAB2415插入片段，纯化并在NotI位点连接，得到pDAB2416(图30)。用连接的DNA转化大肠杆菌，通过BglII和SacI限制性酶消化筛选菌落。通过跨越NotI接头处的测序进一步验证阳性亚克隆。然后用AgeI切割pDAB2416质粒从载体主链取出MAR/CsVMV/VP2/ORF24/Ubi10/PAT/ORF1表达盒。也用AgeI切割pDAB2407以线性化此二元载体，通过这些适当片段的连接形成pDAB2423。转化连接的DNA后，使用HindIII和XhoI消化筛选菌落。挑取的30个菌落中12个为阳性。一个阳性克隆进一步通过使用NcoI、PmeI和PstI酶限制性消化分析。将克隆的T-DNA边界之间作完全测序以最终验证。
表1：根据植物来源HN的血细胞凝集活性比较提取方法
1天然NDV超声2分钟。提取缓冲液——50mM抗坏血酸钠、1mM EDTA、1mM PMSF和0.1％Triton X-100 pH 7.2；DPBS——Dulbecco氏磷酸缓冲盐水；F/T——冻融；nd——对于本实验而言未进行。
表2：比较植物来源HN和天然病毒的血细胞凝集抑制(HAI)活性
1病毒原液是4HA单位，折合该病毒原液的1∶4稀释。
这是用于滴定抗体的病毒浓度，干扰4HA单位病毒的终点抗体稀释度被认为是抗体制品的HAI效价。
表3：比较使用不同压力进行微流化的CHN-18转基因细胞的细胞提取物的血细胞凝集作用
MF——微流化；PSI——磅/平方英寸；S/N——上清液
表4：接种兔的剂量水平
1从非冻干材料提供所有NT-1样品。BCA——双金鸡纳酸，Pierce Chemical BCA蛋白测定试剂盒的主要组分；TSP——总可溶性蛋白质。
CHN-7和CHN-18是表达来自NDV的HN蛋白质的两个不同转基因细胞系；CHA-13和CHA-47是表达AIV的HA蛋白的两个不同转基因细胞系。
表5：用来源于转基因植物细胞CHA-13和CHN-18的AIV-HA和NDV-HN蛋白质接种兔得到的血清学结果
S/N——上清液；HAI——血细胞凝集抑制血清效价
表6：家禽试验#16中用于每次接种的剂量水平
1基于每湿重细胞表达的血凝素/神经氨酸酶(HN)的剂量；IN——鼻内；SQ——皮下；OG——口腔管饲；OF——喂以饲料混合物。
表7：从家禽试验#16得到的CHN-18的血清学结果和攻击结果(NDV攻击)
所有鸡接受102 EID50(卵感染剂量)NDV的Texas GB株。
在最后一次接种后24天攻击鸡。粗体鸡编号具有延迟的死亡发生，见表9。HAI——血细胞凝集抑制血清效价；na——不适用。
表8：试验#18每次接种所用的抗原剂量水平
表9：试验#18中得到的CHN-18的血清学结果和攻击结果
除组1接受104 EID50(卵感染性剂量)NDV的Texas GB株和组3用作未攻击对照，其余所有鸡接受102 EID50 NDV的Texas GB株。在最后一次接种后31天攻击鸡。血细胞凝集抑制(HAI)效价以三个重复试验的平均效价报道。
表10：试验#16和试验18#中攻击后各天的死亡(NDV攻击)
*第5组中有一只鸡在这一天没有记录
表11：CHA-13的血清学结果和攻击结果(AIV攻击)
1血细胞凝集抑制(HAI)效价以两次重复的50％终点报道，值1指定为背景。
2攻击得分通过结膜炎＝1；抑郁＝2；共济失调＝3；
瘫痪/斜颈＝4；死亡/安乐死＝5的综合评估来确定。
3Corixa佐剂单磷酰脂A(MPL)海藻糖dicorynomycolate(TDM)
表12：家禽试验中每次接种所用的剂量水平
1SO——皮下；OG——口腔管饲；IB——囊内(intrabursal)；SO OG——第1剂皮下，第2剂和第3剂口腔管饲；Drakeoil乳剂——具有等体积5％Drakeoil、1％Tween 80、0.33％SDan 80的nCVP2-002；CGI——纯化的Cellcap来源的鸡γ干扰素；LAP——具有等体积的于水乳剂中的卵磷脂丙烯酸聚合物油的nCVP2-002
表13：来自CVP2-002家禽试验的血清学结果和攻击结果(IBDV攻击)
1血清中和(SN)效价范围为每次处理的一组鸡的最低血清效价值至最高血清效价值
2血清ELISA效价范围为每次处理的一组鸡的最低血清效价值至最高血清效价值。
3测定处理组中每只鸡囊重与体重的比(BBW)，通过比较每个受攻击组和未受攻击组(#1)产生提供p值的统计学差异；p值大于0.05被认为具有保护性。
na——不适用
表14：不同的热不稳定毒素制剂对Y1小鼠肾上腺细胞的细胞毒性
1使用实施例6中所述神经节苷脂定量捕获ELISA测定每个抗原。
2LT浓度代表使用LTA特异性抗体的神经节苷脂捕获的与LTB结合的LTA蛋白质量。
3基于使用LTB特异性抗体的毒素LTB定量的浓度。
LT——热不稳定毒素；LTA-A——热不稳定毒素的A亚基；LTB-B——热不稳定毒素的B亚基
表15：植物来源的和天然的抗原的粘膜递送(鼻内和眼)；
每个处理组的施用剂量
1用于该研究的抗原包括CHA-13和CHN-18植物来源抗原以及灭活的禽流感病毒(灭活AIV)，日期指示从10升发酵罐的收获日并指定批号。
2用于处理的佐剂所有均通过鼻内和眼途径给药，每只眼滴0.05ml和每个鼻孔滴0.2ml。LAP——卵磷脂丙烯酸聚合物；Quil A是来自树(Quillia saponaria)皮的皂苷；LT——来自大肠杆菌的热不稳定毒素；chol.——胆固醇；油——Drakeol矿物油。
3施用的剂量水平通过使用在与佐剂进行疫苗组装之前从大量抗原的定量ELISA取得的抗原的稀释或组合来确定。
4阳性对照样品通过SQ——皮下接种——递送。
表16：对植物来源抗原和天然抗原的粘膜递送疫苗递送物(鼻内和眼)的血清学应答；每个处理组的施用剂量
1，2见表15信息
3使用灭活AIV和NDV抗原(两者均来自鸡胚尿囊)测定血细胞凝集抑制(HAI)血清效价。两种抗原均用作每个处理的对照，血清效价以针对用于该处理的抗原的特异性应答来报道。
序列表
<110>美国陶氏益农公司
T·J·米勒
M·J·方东
S·R·韦布
<120>来源于转基因植物细胞的稳定免疫预防性和治疗性组合物及其制备方法
<130>DAS-120XC1
<140>待获得
<141>2004-05-04
<150>US 60/467,999
<151>2003-05-05
<160>13
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>1753
<212>DNA
<213>新城疫病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1753)
<223>见图1a和1b
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1753)
<223>新城疫病毒(NDV)“Lasota”株的血凝素/神经氨酸酶(HN)基因的植物优化的编码
序列
<400>1
atggacagag cagtttcaca agtggcccta gagaatgatg agagggaagc caagaatacc 60
tggaggctta tattcagaat agccatctta ttccttactg tggtcaccct agcaatctct 120
gttgcatccc tcctctattc tatgggagca agcaccccct cagacttggt gggcataccc 180
acaagaatct ctagggcaga agaaaaaatc accagtaccc ttggctccaa ccaagatgtt 240
gtggacagaa tctacaaaca ggtggcactt gaaagtccac ttgcattact caacacagag 300
actaccatca tgaatgcaat taccagccta tcctatcaaa ttaatggggc tgccaacaat 360
tcaggttggg gagccccaat tcatgatcca gactatattg gaggtattgg caaagagctt 420
attgtagatg atgcttcaga tgttacatct ttctatcctt cagctttcca ggaacacctg 480
aatttcattc ctgcacccac aactgggagt gggtgcacta gaataccctc atttgacatg 540
agtgctacac actactgcta cacacataat gttattctct ctggctgtag ggaccactct 600
cactcttatc aatacttagc tcttggagtt ctcagaacat ctgctactgg tagagtcttt 660
ttctcaactc ttaggagtat caacctagat gatacacaaa ataggaaaag ttgctctgta 720
tctgctacac ctttgggctg tgatatgcta tgcagtaaag taacagaaac tgaagaagag 780
gactataatt ctgctgtccc tacaaggatg gtgcatggca gattgggttt tgatggtcaa 840
tatcatgaaa aagatttgga tgtcactaca ttgtttgggg attgggtagc taattaccca 900
ggagttggag gtggtagctt cattgactcc agagtctggt tctctgtcta tggtggttta 960
aaacctaaca gtcctagtga tactgtgcaa gagggaaagt atgttatcta caagaggtat 1020
aatgatactt gtcctgatga acaggattac cagattagga tggctaagtc atcatacaaa 1080
ccaggaagat ttggaggtaa gaggatacaa caagctattt tgagtattaa ggttagcaca 1140
tcattgggag aggacccagt ccttactgtt ccaccaaaca ctgtaacact catgggagct 1200
gagggaagga ttttaactgt tggtactagc cattttcttt atcagagagg aagttcctat 1260
tttagcccag cattactgta tccaatgact gtgagcaaca agacagctac attacattca 1320
ccatatactt ttaatgcttt tacaagacct ggatcaattc cttgccaggc ttcagctaga 1380
tgtccaaatt catgtgtgac tggagtttac actgatcctt accctttgat attttacaga 1440
aatcatacct tgagaggggt ttttggaaca atgttggatg gtgttcaagc taggctcaat 1500
cctgcctctg ctgtttttga ttctacatca agatcaagaa taaccagggt ttcctctagt 1560
tccactaagg cagcatatac tacctccaca tgtttcaaag ttgtaaagac taacaaaact 1620
tattgtctga gcatagctga gatctctaac actctttttg gggagttcag aattgttcca 1680
cttttggtgg aaattctgaa ggatgatggt gtaagggaag caagatctgg ttaagtcttc 1740
aggtaccgag ctc 1753
<210>2
<211>577
<212>PRT
<213>新城疫病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>见图1a和1b
<220>
<221>misc_feature
<223>新城疫病毒(NDV)“Lasota”株的血凝素/神经氨酸酶(HN)基因的植物优化的编码序
列
<400>2
Met Asp Arg Ala Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu
1 5 10 15
Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ile Leu Phe Leu
20 25 30
Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met
35 40 45
Gly Ala Ser Thr Pro Ser Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Ser
50 55 60
Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gln Asp Val
65 70 75 80
Val Asp Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Asn Thr Glu Thr Thr Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr
100 105 110
Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His
115 120 125
Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp
130 135 140
Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu
145 150 155 160
Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro
165 170 175
Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile
180 185 190
Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala Leu
195 200 205
Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu
210 215 220
Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val
225 230 235 240
Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu
245 250 255
Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His
260 265 270
Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val
275 280 285
Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu
305 310 315 320
Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile
325 330 335
Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile
340 345 350
Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg
355 360 365
Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu
370 375 380
Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala
385 390 395 400
Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg
405 410 415
Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser
420 425 430
Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr
435 440 445
Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn Ser
450 455 460
Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg
465 470 475 480
Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asp Gly Val Gln
485 490 495
Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser
500 505 510
Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr
515 520 525
Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser
530 535 540
Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro
545 550 555 560
Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser
565 570 575
Gly
<210>3
<211>1647
<212>DNA
<213>禽流感病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1647)
<223>见图10
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1647)
<223>禽流感病毒AIV)A/火鸡/Wisconsin/68(H5N9)的血凝素(HA)基因的DNA序列
<400>3
gaccaaatct gcatcggtta tcatgcaaac aattcaacaa aacaagttga cacaatcatg 60
gagaagaatg tgacggtcac acatgctcaa gatatactgg aaaaagagca caacgggaaa 120
ctctgcagtc tcaaaggagt gaggcccctc attctgaagg attgcagtgt ggctggatgg 180
cttcttggga acccaatgtg tgatgagttc ctaaatgtac cggaatggtc atatattgta 240
gagaaggaca atccaaccaa tggcttatgt tatccgggag acttcaatga ttatgaagaa 300
ctgaagtatt taatgagcaa cacaaaccat tttgagaaaa ttcaaataat ccctaggaac 360
tcttggtcca atcatgatgc ctcatcagga gtgagctcag catgcccata caatggtagg 420
tcttcctttt tcaggagtgt ggtgtggttg atcaagaaga gtaatgtata cccaacaata 480
aagaggacct acaataacac caatgtagag gaccttctga tattgtgggg aatccatcac 540
cctaatgatg cagcggaaca aacggaactc tatcagaact cgaacactta tgtgtctgta 600
ggaacatcaa cactaaatca gaggtcaatt ccagaaatag ctaccaggcc caaagtgaat 660
ggacaaagtg gaagaataga atttttctgg acaatactaa ggccgaacga tgcaatcagc 720
tttgaaagta atgggaactt tatagctcct gaatatgcat acaagatagt taaaaaggga 780
gattcagcaa tcatgagaag cgaactggag tatggcaact gtgataccaa atgtcagacc 840
ccagtgggtg ctataaattc cagtatgcct tttcacaatg ttcatcccct taccattgga 900
gagtgtccca aatatgtcaa atcagataaa ctggtccttg caacaggact gaggaacgtg 960
cctcagagag aaacaagagg tctgtttgga gcaatagcag gattcataga aggggggtgg 1020
caaggaatgg tagatggatg gtatggttac catcatagca acgagcaggg aagtggatat 1080
gctgcagaca aagagtccac tcagaaagca atcgacggga tcaccaataa agtcaactca 1140
atcattgaca aaatgaacac tcaattcgaa gccgttggga aagaattcaa caacttagaa 1200
aggagaatag aaaatttgaa taagaaaatg gaagatggat ttctagatgt atggacttac 1260
aatgcagaac ttctggtgct catggaaaat gaaagaactc tggatttcca tgattcatat 1320
gtcaagaacc tatacgataa ggtccgactc cagctgagag ataatgcaaa agaattgggc 1380
aatgggtgtt tggagttctc ccacaaatgt gacaatgaat gcatggaaag tgtgagaaac 1440
ggaacgtatg actatccaca atactcagaa gaatcaaggc tgaacagaga ggaaatagat 1500
ggagtcaaat tggagtcaat gggcacctat cagatactat caatttactc aacagtggcg 1560
agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctgtctt tttggatgtg ctccaatgga 1620
tcattgcaat gcagaatttg catctag 1647
<210>4
<211>548
<212>PRT
<213>禽流感病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>见图10.
<220>
<221>misc_feature
<223>禽流感病毒AIV)A/火鸡/Wisconsin/68(H5N9)的血凝素(HA)基因的蛋白质序列
<400>4
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val
1 5 10 15
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
20 25 30
Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg
35 40 45
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
50 55 60
Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
65 70 75 80
Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn
85 90 95
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu
100 105 110
Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser
115 120 125
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe
130 135 140
Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
165 170 175
Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln
180 185 190
Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
195 200 205
Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
210 215 220
Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser
225 230 235 240
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
245 250 255
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
260 265 270
Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser
275 280 285
Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
290 295 300
Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val
305 310 315 320
Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile
325 330 335
Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His
340 345 350
Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln
355 360 365
Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys
370 375 380
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu
385 390 395 400
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp
405 410 415
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
420 425 430
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
435 440 445
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu
450 455 460
Glu Phe Ser His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn
465 470 475 480
Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg
485 490 495
Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile
500 505 510
Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met
515 520 525
Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys
530 535 540
Arg Ile Cys Ile
545
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(28)
<223>用于剪裁pCP！H上组成型木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子末端的PCR引物——
CVM-Asc
<400>5
atggcgcgcc agaaggtaat tatccaag 28
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(24)
<223>用于剪裁pCP！H上木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子末端的PCR引物——CVM-Xho
<400>6
atctcgagcc atggtttgga tcca 24
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223>用于产生Nco I位点的诱变引物
<400>7
tgccatggtg atgtgtggtc tacaa 25
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>与5’区互补的正向引物
<400>8
gatctgacaa gtcaagaaaa ttg 23
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>合成序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>用于产生XhoI I位点的诱变引物
<400>9
agctcgagct gtgtgagtga gtg 23
<210>10
<211>1368
<212>DNA
<213>传染性法式囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1368)
<223>见图14
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1368)
<223>传染性法式囊病病毒的VP2基因的DNA序列
<400>10
atgaccaacc tccaagatca aactcaacag attgttccct tcatacgcag ccttctcatg 60
ccaaccactg gacctgcttc cattcctgat gacaccttgg agaagcacac tctccgctct 120
gagacctcaa cctacaactt gactgttggt gacactggct ctgggttgat tgtctttttc 180
cctgggttcc ctggctccat tgtgggtgct cactacacat tgcagtccaa tggcaactac 240
aagtttgatc aaatgctctt gactgcccag aatcttccag cctcctacaa ctattgccgt 300
cttgtgtctc gctccctcac agtgaggtcc tcaacactcc ctggtggagt gtatgcactc 360
aatggcacca tcaacgcagt gactttccaa ggaagccttt cagaattgac tgatgtgagc 420
tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaatgaca agattgggaa tgtccttgtt 480
ggagaaggag tcaccgtcct ctcactccca acatcctatg atcttggcta tgtgagactt 540
ggtgatccca ttcctgccat aggacttgat cccaaaatgg ttgccacatg tgacagctct 600
gatcgtccaa gggtttacac catcacagca gctgatgact accaattctc ctcacagtac 660
caagctggtg gagtcaccat cacactcttc tcagccaaca tagatgccat cacaagcctc 720
agcattggtg gagaacttgt ctttcagaca tctgtccaag ggctcatcct tggtgccacc 780
atctacttga ttggctttga tggcactgct gtcatcacca gagcagtggc tgcagacaat 840
gggctcacag ctggcactga caacctcatg ccattcaaca ttgtgattcc cacctctgag 900
atcacccagc caatcacttc catcaagttg gagatagtga cctcaaagtc cggtggacaa 960
gctggtgatc agatgtcctg gtctgcatct gggagcttgg ctgtgaccat tcatggtggc 1020
aactaccccg gagccctcag acctgtgact ttggttgcct atgaacgcgt tgcaactggc 1080
tctgttgtca ctgttgctgg tgtcagcaac tttgagttga tcccaaatcc tgaacttgca 1140
aagaacttgg tcacagagta tggaaggttt gaccctggtg ccatgaacta cacaaaattg 1200
atcctctcag agagggacag acttggcatc aagactgttt ggccaaccag agagtacact 1260
gacttccgcg agtacttcat ggaggttgct gacctcaaca gccctctcaa gatagctgga 1320
gcctttggtt tcaaagacat cataagggct attcgtcgca tcgctgtt 1368
<210>11
<211>1425
<212>DNA
<213>传染性法式囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>编码变异的E/91 VP2(来自传染性法式囊病病毒的结构蛋白)的多核苷酸(DNA)
<400>11
agatctgaag acaacatgac caacctccaa gatcaaactc aacagattgt tcccttcata 60
cgcagccttc tcatgccaac cactggacct gcttccattc ctgatgacac cttggagaag 120
cacactctcc gctctgagac ctcaacctac aacttgactg ttggtgacac tggctctggg 180
ttgattgtct ttttccctgg gttccctggc tccattgtgg gtgctcacta cacattgcag 240
tccaatggca actacaagtt tgatcaaatg ctcttgactg cccagaatct tccagcctcc 300
tacaactatt gccgtcttgt gtctcgctcc ctcacagtga ggtcctcaac actccctggt 360
ggagtgtatg cactcaatgg caccatcaac gcagtgactt tccaaggaag cctttcagaa 420
ttgactgatg tgagctacaa tgggttgatg tctgcaacag ccaacatcaa tgacaagatt 480
gggaatgtcc ttgttggaga aggagtcacc gtcctctcac tcccaacatc ctatgatctt 540
ggctatgtga gacttggtga tcccattcct gccataggac ttgatcccaa aatggttgcc 600
acatgtgaca gctctgatcg tccaagggtt tacaccatca cagcagctga tgactaccaa 660
ttctcctcac agtaccaagc tggtggagtc accatcacac tcttctcagc caacatagat 720
gccatcacaa gcctcagcat tggtggagaa cttgtctttc agacatctgt ccaagggctc 780
atccttggtg ccaccatcta cttgattggc tttgatggca ctgctgtcat caccagagca 840
gtggctgcag acaatgggct cacagctggc actgacaacc tcatgccatt caacattgtg 900
attcccacct ctgagatcac ccagccaatc acttccatca agttggagat agtgacctca 960
aagtccggtg gacaagctgg tgatcagatg tcctggtctg catctgggag cttggctgtg 1020
accattcatg gtggcaacta ccccggagcc ctcagacctg tgactttggt tgcctatgaa 1080
cgcgttgcaa ctggctctgt tgtcactgtt gctggtgtca gcaactttga gttgatccca 1140
aatcctgaac ttgcaaagaa cttggtcaca gagtatggaa ggtttgaccc tggtgccatg 1200
aactacacaa aattgatcct ctcagagagg gacagacttg gcatcaagac tgtttggcca 1260
accagagagt acactgactt ccgcgagtac ttcatggagg ttgctgacct caacagccct 1320
ctcaagatag ctggagcctt tggtttcaaa gacatcataa gggctattcg tcgcatcgct 1380
gtttgagtag ttagcttaat cacctagagc tcggtcacca gatct 1425
<210>12
<211>456
<212>PRT
<213>传染性法式囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<223>SEQ ID NO：11编码的E/91 VP2(来自传染性法式囊病病毒的结构蛋白)的变异多
肽
<400>12
Met Thr Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile Arg
1 5 10 15
Ser Leu Leu Met Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp Asp Thr
20 25 30
Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr Asn Leu Thr
35 40 45
Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe Pro Gly Phe Pro
50 55 60
Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln Ser Asn Gly Asn Tyr
65 70 75 80
Lys Phe Asp Gln Met Leu Leu Thr Ala Gln Asn Leu Pro Ala Ser Tyr
85 90 95
Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr
100 105 110
Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr
115 120 125
Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu
130 135 140
Met Ser Ala Thr Ala Asn Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val
145 150 155 160
Gly Glu Gly Val Thr Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly
165 170 175
Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys
180 185 190
Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile
195 200 205
Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly
210 215 220
Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile
245 250 255
Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile
260 265 270
Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn
275 280 285
Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro
290 295 300
Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln
305 310 315 320
Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr
325 330 335
Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val
340 345 350
Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val
355 360 365
Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val
370 375 380
Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu
385 390 395 400
Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr
405 410 415
Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile
435 440 445
Arg Ala Ile Arg Arg Ile Ala Val
450 455
<210>13
<211>42
<212>DNA
<213>传染性法式囊病病毒
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(42)
<223>编码翻译终止密码子的DNA序列，所述密码子用于在转化过程中DNA整合后终止不
利开放阅读框的翻译(包括Sac I、BstE II和Bgl II限制酶识别位点)。
<400>13
tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg gtcaccagat ct 42
机译： 化合物，稳定的抗体产生细胞系，组合物，调节个体免疫应答和治疗和/或预防疾病的方法，化合物和/或组合物和树突状细胞或其前体的用途，富集和检测树突状细胞的方法细胞或其子集或前体，多肽，载体多核苷酸，宿主细胞，转基因植物，转基因非人类动物，提取物，化合物或多肽的制备方法，富集的树突状细胞群和/或前体扩增的树突状细胞群和/或其前体，鉴定与多肽结合的分子并筛选与多肽结合的化合物的方法，多肽，多核苷酸，载体，宿主细胞，转基因植物，提取物，细胞群的用途和/或构图。 ，化合物的生产方法和试剂盒。
机译： 由转基因植物细胞衍生的稳定的免疫原性和治疗性组合物及其生产方法
机译： 由转基因植物细胞衍生的稳定的免疫原性和治疗性组合物及其生产方法
