重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的组织培养繁殖方法

摘要

本发明涉及一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的组织培养繁殖方法：将经消毒处理过的剪成0.8－1.2厘米带叶天蓝遏蓝菜茎尖/茎节，或者或者经消毒处理过的天蓝遏蓝菜种子实生苗具芽茎段依次接种到启动培养基中培养生成丛生芽苗；接种到增殖培养基中培养生成密集丛生芽；置入壮苗基本培养基中进行壮苗培养；转接到生根培养基中培养得生根苗；转移至荷格兰特液体培养基中进行水培壮苗培养，之后再将水培壮苗后的壮苗移栽到苗圃基质中进行移栽定植培养，得到蓝遏蓝菜的组织；本方法不仅可以排除外界条件的影响，四季可行，节约育苗占地，降低生产成本；而且可以在短期内得到大量健壮幼苗，进行规模化、工厂化生产。

说明书

技术领域

本发明属于植物的人工繁殖和栽培方法技术领域；特别涉及一种重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的组织培养繁殖方法。

背景技术

天蓝遏蓝菜(Thlaspi caerulescens)是一种一年生或多年生的草本植物，原产于欧洲中部、西部和南部，是一种典型的重金属超富集植物，其中，累积锌含量高达25000-30000毫克/千克，未表现出任何受伤症状或生长受到抑制，而大多数植物累积锌达到100毫克/千克时即表现中毒症状；同时，累积镉含量高达1800毫克/千克，远远超出其它普通植物所能忍受的极限。自20世纪80年代以来，利用植物修复重金属污染的土壤和水体的思想日益得到国内外学术界和产业界的密切关注，并有望迅速发展成为一项新产业。天蓝遏蓝菜具有吸收和富集土壤或水体中重金属的特征，通过收割植物带走重金属，进而以其为工业原料提炼重金属，达到清除土壤污染和有害物质变害为宝的双重目的。利用遏蓝菜的快速繁育和种植技术可以开发出廉价、彻底的土壤重金属污染的治理修复技术，其花费不仅少(仅是常规技术的几十到几百分之一)，而且是进行土层原位修复，既保护了地表生态环境，又金属冶炼提供矿源，因此国际上将其称之为“廉价的绿色修复技术”。然而，天蓝遏蓝菜生长缓慢，生物量小，在生产应用上造成了限制。如何利用现代生物技术在短期内培育出大量健壮的幼苗，成为国内外急切解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种天蓝遏蓝菜组织培养快速繁殖方法，以满足遏蓝菜的工厂化生产和环境污染治理的研究与应用的需求。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的重金属超富集植物天蓝遏蓝菜的组织培养繁殖方法，其步骤如下：

1)启动培养

将经消毒处理过的天蓝遏蓝菜植株的茎尖/茎节剪成0.8-1.2厘米带叶的茎尖/茎节，或者经消毒处理过的天蓝遏蓝菜种子实生苗的具芽茎段接种到启动培养基中，置于培养室中培养21-28天，生成丛生芽苗；

所述启动培养基所含组分及配比为：每升启动基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂0.5-3毫克和二种植物生长激素各0.2-2毫克，pH＝5.8；所述二种植物生长激素为6-苄基嘌呤和萘乙酸；

所述启动基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

2)增殖培养

将经启动培养的不少于2.5厘米的丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段接种到增殖培养基中培养21-28天；

所述增殖培养基所含组分及配比为：每升增殖基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂0.5-3毫克和二种或三种植物生长激素各0.2-2毫克，pH＝5.8；

所述二种植物生长激素为6-苄基嘌呤和萘乙酸；所述三种植物生长激素为6-苄基嘌呤、赤霉素和萘乙酸；

所述启动基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

3)壮苗培养

将经过增殖培养的不少于3厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到壮苗培养基中培养21-28天；

所述壮苗培养基所含组分及配比为：每升壮苗基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白150毫克、维生素B₂0.5-3毫克和二种植物生长激素各0.2-2毫克，pH＝5.8；所述二种植物生长激素为6-苄基嘌呤和萘乙酸；

所述壮苗基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

4)生根培养

剪取经壮苗培养3.5-5厘米的丛生芽苗，转接到生根培养基中进行生根培养15-25天，长出生根苗；

所述生根培养基所含组分及配比为：每升生根基本培养基中含植物生长激素0.2-4毫克和蔗糖15克；pH＝5.8；所述的植物生长激素为吲哚丁酸或萘乙酸；

所述生根基本培养基为2368.22毫克/升的MS生根基本培养基；

5)水培壮苗

将经生根培养的生根苗取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培壮苗培养；其培养条件为：以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次荷格兰特液体培养基；22-25℃，光照16小时/天，湿度80-85％；

6)移栽定植

待经水培壮苗生长至根长不少于5厘米时取出，移栽到苗圃基质中，进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1∶1花土和蛭石组成；

幼苗移栽前，将苗圃基质用荷格兰特液体培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95％，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基；移栽苗定植10天后揭去覆膜；再保持温室内湿度80％，温度20-30℃，每天喷水3次，14天喷施1次荷格兰特液体培养基，21天喷施1次尿素，进行速生培养，完成天蓝遏蓝菜的组织繁殖培养。

所述步骤2)中所述的启动培养基中所述的二种植物生长激素中的6-苄基嘌呤为0.5-2毫克/升，所述的萘乙酸为0.2-2毫克/升时，效果较佳。

所述的步骤3)中所述的增殖培养基中所述的二种植物生长激素中的6-苄基嘌呤1.0-2毫克/升，所述的萘乙酸为0.2-2毫克/升时，效果较佳。

所述的步骤4)中所述的壮苗培养基中涉及的二种植物生长激素中的6-苄基嘌呤为0.5-2毫克/升，所述的赤霉素为0.5-2毫克/升时，效果较佳。

采用本发明方法进行快速繁殖天蓝遏蓝菜，可以在短期内得到大量健壮幼苗，不受外界环境条件影响，四季皆可进行。而且节约育苗占地，降低生产成本。植物组织培养技术是利用细胞的全能性，采用植物体上的细胞团或一块组织，通过人为条件的控制，使之形成大量植株，并且保存了母体的全部优良性状，且遗传性状稳定。通过这种方法得到的大量健壮天蓝遏蓝菜试管苗，对重金属镉、锌等富集水平没有变化，完全可以满足栽培研究和应用。

具体实施方式

下面结合天蓝遏蓝菜组培繁殖实施例和农杆菌介导的天蓝遏蓝菜遗传转化实施例进一步描述本发明：

实施例1：天蓝遏蓝菜的组培繁殖

1、剪取成年天蓝遏蓝菜植株茎尖，流水冲洗干净，70％酒精表面消毒30秒，0.1％二氯化汞消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次，用滤纸吸干表面水分；

2、将消毒处理过的材料剪成1厘米带叶的茎尖，接种到启动培养基中，置于培养室内，16小时光照/天，培养21天，出现丛生芽苗；

所述启动培养基所含组分及配比为：每升启动基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂1毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.2毫克，pH＝5.8；所述启动基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

3、将培育不少于2.5厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到增殖培养基中，置于培养室中，16小时光照/天，培养21天，出现大量密集丛生芽；所述增殖培养基所含组分及配比为：每升增殖基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂1毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.2毫克，pH＝5.8；所述增殖基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

4、将经过增殖培养的不少于3厘米以上的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到壮苗培养基中，置于培养室中，16小时光照/天，培养21天，株高显著增加，叶片明显增大；

所述壮苗培养基所含组分及配比为：每升壮苗基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白150毫克、维生素B₂1毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，赤霉素0.5毫克，pH＝5.8；所述壮苗基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

5、剪取4厘米左右的丛生芽试管苗，转接到生根培养基中，进行生根培养15-25天，生根率98％，平均根数15条，平均根长4.8厘米；

所述生根培养基所含组分及配比为：每升生根基本培养基中含吲哚丁酸1毫克和蔗糖15克；pH＝5.8；

所述生根基本培养基为2368.22毫克/升的MS生根基本培养基；

6、将试管生根苗取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培壮苗培养；培养条件为：以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次培养液；培养条件：22-25℃，光照16小时/天，湿度80-85％；

7、待水培苗长至根长5厘米以上时取出，移栽到苗圃基质中进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1∶1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将基质用荷格兰特营养液培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95％，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格兰特营养液培养基；移栽苗在10天后揭去覆膜；保持温室内湿度80％，温度20-30℃；每天喷水3次，14天喷施1次培养液，21天喷施1次尿素，进行速生培养得到天蓝遏蓝菜组织。

实施例2：天蓝遏蓝菜组培繁殖

1、剪取成年天蓝遏蓝菜植株茎尖，流水冲洗干净，70％酒精表面消毒30秒，0.1％二氯化汞消毒8-10分钟，无菌水冲洗3-5次，用滤纸吸干表面水分；

2、将消毒处理过的材料剪成1厘米带叶的茎尖接种到启动培养基中，置于培养室内，16小时光照/天，培养21天，出现丛生芽苗；

所述启动培养基所含组分及配比为：每升启动基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂ 2毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.2毫克，pH＝5.8；所述启动基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

3、将培育不少于2.5厘米的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段接种到增殖培养基中，置于培养室中，16小时光照/天，培养21天，出现大量密集丛生芽；所述增殖培养基所含组分及配比为：每升增殖基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂2毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.2毫克，赤霉素0.5毫克，pH＝5.8；所述增殖基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

4、将经过增殖培养的不少于3厘米以上的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到壮苗培养基中，置于培养室中，16小时光照/天，培养21天，株高显著增加，叶片明显增大；

所述壮苗培养基所含组分及配比为：每升壮苗基本培养基中含肌醇100毫克/升，水解乳蛋白150毫克/升，维生素B₂1毫克/升，6-苄基腺嘌呤1毫克/升，赤霉素0.5毫克/升，pH＝5.8；所述壮苗基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

5、剪取3.8-4.2厘米的丛生芽试管苗，转接到生根培养基中，进行生根培养15-25天，生根率68％，平均根数14条，平均根长2厘米；

所述生根培养基所含组分及配比为：每升生根基本培养基中含萘乙酸0.5毫克和蔗糖15克；pH＝5.8；所述生根基本培养基为2368.22毫克/升的MS生根基本培养基；

6、将试管生根苗取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培壮苗培养；培养条件为：以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次培养液；培养条件：22-25℃，光照16小时/天，湿度80-85％；

7、待水培苗长至根长5厘米以上时取出，移栽到苗圃基质中进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1∶1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将基质用荷格兰特营养液培养基淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95％，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次荷格兰特营养液培养基；移栽苗在10天后揭去覆膜；保持温室内湿度80％，温度20-30℃；每天喷水3次，14天喷施1次培养液，21天喷施1次尿素，进行速生培养得到天蓝遏蓝菜成熟植株。

实施例3：天蓝遏蓝菜组培繁殖

1、将剪取的天蓝遏蓝菜种子实生苗具芽茎段接种到启动培养基中，置于培养室中，16小时光照/天，培养21天，出现丛生芽；

所述启动培养基所含组分及配比为：每升启动基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂2毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.毫克，pH＝5.8；所述启动基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

2、将培育2.5厘米以上的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种增殖培养基中，置于培养室中，16小时光照/天，培养21天，出现大量密集丛生芽；

所述增殖培养基所含组分及配比为：每升增殖基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白250毫克、维生素B₂2毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.2毫克，pH＝5.8；所述启动基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

3、将经过增殖培养的、3厘米以上的试管丛生芽苗修剪成带2-3个节的茎段，接种到壮苗培养基中，置于培养室中，16小时光照/天，培养21天，株高显著增加，叶片明显增大；

所述壮苗培养基所含组分及配比为：每升壮苗基本培养基中含肌醇100毫克、水解乳蛋白150毫克、维生素B₂2毫克、6-苄基腺嘌呤1毫克，萘乙酸0.5毫克，pH＝5.8；所述启动基本培养基为4736.43毫克/升的MS培养基；

4、剪取4厘米左右的丛生芽试管苗，转接到本发明的生根培养基中，进行生根培养15-25天，生根率95％，平均根数20条，平均根长5.4厘米；

所述生根培养基所含组分及配比为：每升生根基本培养基中含吲哚丁酸1毫克和蔗糖15克；pH＝5.8；所述生根基本培养基为2368.22毫克/升的MS生根基本培养基；

5、将试管生根苗取出，洗去附着的培养基，转移至荷格兰特液体培养基中进行水培苗培养；以泡沫板作为幼苗支持物，泡沫板大小应与水培槽口大小一致，尽量避免根部见光导致绿藻滋生；每5天更换一次培养液。培养条件：22-25℃，光照16小时/天，湿度80-85％；

6、待水培苗长至根长5厘米以上时取出，移栽到苗圃基质中进行移栽定植；所述苗圃基质由重量份配比为1∶1花土和蛭石组成；幼苗移栽前，将基质用荷格兰特营养液淋透；移栽后，用聚氯乙烯薄膜覆盖，保持湿度90-95％，注意通风；每5天喷水1次，14天喷施1次培养液；移栽苗在10天后揭去覆膜，保持温室内湿度80％，温度20-30℃；每天喷水3次，14天喷施1次培养液，21天喷施1次尿素，进行速生培养得到天蓝遏蓝菜成熟植株。