具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌及其应用

摘要

具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌及其应用，本发明涉及一种微生物及其应用。本发明首次提出一种具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌，本发明中的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌，命名为大庆沙门氏菌MF即Salmonella Daqing MF，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，所属分类学属为沙门氏菌属Salmonella，所属分类学种为大庆沙门氏菌，保藏号为CGMCC No.1910。细菌为革兰氏阴性短杆菌，有荚膜，专性厌氧生长，细菌长短多变，在宽0.35μm～0.7μm×长0.7μm～1.6μm的范围之间，菌体无鞭毛；在固体培养基上生长时，为黑色圆形菌落，表面光滑，边缘不整齐。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物及其应用。

背景技术

在油田三次采油中，水溶性聚合物(HPAM)已广泛应用于油田工业的各个方面，大庆油田现在广泛使用是“三元复合驱”采油技术，“三元”主要包括超高分子量聚丙烯酰胺(HPAM)、碱和表面活性剂。超高分子量聚丙烯酰胺(HPAM)水溶液被用来作为驱油剂注入油层，使具有较大黏度的原油(成分主要为饱和烃、芳烃、胶质及沥青质)与水之间流度比下降，减弱水的粘性指进，从而提高原油采收率。聚合物驱油的采出液中，不仅含有原油，而且还含有聚丙烯酰胺。造成含聚丙烯酰胺污水大量增加，污水中聚丙烯酰胺含量也大量增加。油田中含聚丙烯酰胺的污水是一类比较复杂、特殊的污水，存在含油多、黏度大等的特点，如何对难以降解的聚丙烯酰胺进行有效分解，减少环境污染带来的压力，是油田在聚丙烯酰胺驱油中非常关注的问题。寻找能产生还原性物质的微生物，促进聚丙烯酰胺的连锁氧化降解反应，从而完成聚丙烯酰胺的降解，是解决含聚污水外排一条重要的途径，目前有关聚丙烯酰胺降解的微生物报道很少。

发明内容

本发明首次提出一种具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌，命名为大庆沙门氏菌MF即Salmonella Daqing MF，所属分类学属为沙门氏菌属Salmonella，所属分类学种为大庆沙门氏菌Daqing，分类命名为大庆沙门氏菌Salmonella Daqing，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1910，保藏日期为2007年1月10日。

菌种来源：所述的新的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌Salmonella Daqing MF，生活在中国大庆油田采油五厂聚合物注入站熟化罐中的聚合物水溶液里。

Salmonella Daqing MF的形态及生长特性：Salmonella Daqing MF为革兰氏阴性短杆菌，有荚膜，专性厌氧生长，细菌长短多变，在宽0.35μm～0.7μm×长0.7μm～1.6μm的范围之间，菌体无鞭毛；在固体培养基上生长时，为黑色圆形菌落，表面光滑，边缘不整齐。

Salmonella Daqing MF的生理生化特征：利用硫酸盐、亚硫酸盐和还原性硫化物起电子受体作用，并还原成H₂S，兼性厌氧；能在碳源为乳酸钠、甲酸钠、苹果酸、葡萄糖、琥珀酸、酵母膏和蛋白胨的培养基中生长，菌株能以聚丙烯酰胺为唯一碳源；可以以硫酸氨、尿素为氮源；液体培养基液相末端产物为乙醇、乙酸、丙酸和丁酸。

Salmonella Daqing MF的菌种分类鉴定：用试剂盒(宝生物公司)提取菌株DNA，采用通用引物进行PCR扩增，16S rDNA序列的引物Eubac27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3’；16S～23S rDNA间隔区的引物P1：5’-GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA-3’，P2 ：5’-CCTCTGACTGCCAGGGCATCC-3’；引物由大连宝生物有限公司合成。PCR反应在PTC-200上进行扩增，50μL的反应体系内含：模板40ng，TagDNA聚合酶(大连宝生物)终浓度为0.3U，dNTP为0.3mmol·L^-1，引物各0.1μmol·L^-1；扩增程序为：94℃预热5min，94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。扩增产物于质量浓度为1.0％的琼脂糖溶液中电泳检测。用胶回收试剂盒(宝泰克)切胶回收，后与pGEM-T(Promega)载体连接，转化到大肠杆菌TOP 10感受态细胞(天为时代)；LB固体培养基中加入氨苄青霉素Amp(5μg/MF)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)，蓝白斑筛选转化子，提取质粒(华舜)，用载体引物T7和SP6检测，测序由上海生物工程有限公司完成。

Salmonella Daqing MF的16S rNA特性：用细菌的16S rNA可以精确的判定细菌的属和种。将Salmonella Daqing MF的16S rNA的PCR产物的序列与基因库NCBI中16S rNA对比，发现与沙门氏菌属的鼠伤寒沙门氏菌种(Salmonella typhimurium)同源性为96％，与鼠伤寒沙门氏菌种是同属不同的两个种，Salmonella Daqing MF是属于沙门氏菌属，为新的细菌菌种(Daqing种)。

本发明中的具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1910，保藏日期为2007年1月10日。

附图说明

图1是Salmonella Daqing MF的菌落形态图。

图2是原子力显微镜观察下的菌体形态图。

图3是MF菌株在600mg/L的HPAM上时的生长曲线和聚合物浓度变化曲线，其中颜色深的线为聚合物浓度变化曲线，颜色浅的线为生长曲线。

图4是菌株作用于聚丙烯酰胺降解前后的聚合物红外光谱图。

图5是MF菌株的系统发育树图谱。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌，命名为大庆沙门氏菌MF即Salmonella Daqing MF，所属分类学属为沙门氏菌属Salmonella，所属分类学种为大庆沙门氏菌Daqing，分类命名为大庆沙门氏菌Salmonella Daqing，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.1910，保藏日期为2007年1月10日。

具体实施方式二：本实施方式中Salmonella Daqing MF菌种的分离通过以下方法实现：取聚合物注入站的熟化罐中的聚合物水溶液5～10mL，放入充满纯度为99.99％的氮气的含有厌氧无菌水的厌氧瓶中，加入3～5颗玻璃珠，在摇床上振荡1.5h，将聚合物溶液中菌胶团打碎，用厌氧的无菌水进行倍比稀释，将细菌浓度稀释到10⁶，再接种于固体培养基中，然后“滚管”培养7～10d；挑取1～3环单菌落转接入液体体培养基中，然后进行3～6次的分离纯化，用电镜确认并分离纯菌株，将纯菌株进行扩大培养后配置成菌液，其中细菌浓度配置为10⁶；配置不同浓度的含有聚合物的培养基并向其中加入相同量的菌液，进行连续培养，不同时间测定聚合物的降解速率，反复多次筛选高效的降解菌株，将高效的降解菌株分别接入到以聚丙烯酰胺为唯一碳源、以硫酸铵、尿素为氮源的液体培养基中培养，对液体培养基的液相末端产物进行生理生化鉴定(《伯杰细菌鉴定手册》第八版)，液相末端产物为乙醇、乙酸、丙酸和丁酸的培养基中的菌株为Salmonella Daqing MF菌。

本实施方式中的液体和固体培养基是通过以下方法制备的：将0.5g的HPAM、0.5g的K₂HPO₄、1.0g的NH₄CI、2g的Na₂SO₄、0.1g的CaCI₂·2H₂O、2.0g的MgSO₄·7H₂O、1.0g的酵母膏、质量浓度为60％的乳酸钠溶液6mL和蒸馏水1000mL充分混合，然后加入质量浓度为0.2％的刃天青溶液1～2g，将混合液煮沸后，加入L-半光盐酸盐0.5g，通入纯度为99.99％的氮气驱氧30min，当培养基由红色变成淡黄色，表明培养基为厌氧状态，可以进行培养基的分装，将培养基分成相同重量的两份，然后在121℃灭菌20min，向一份培养基中加入质量浓度为3％的FeSO₄·(NH₄)₂SO₄溶液10～12g，得到具体实施方式一中的液体体培养基；向另一份培养基中加入质量浓度为1.2％的琼脂糖10～12g，得到具体实施方式一中的固体培养基；本实施方式中的培养基为选择性培养基。

具体实施方式三：本实施方式中Salmonella Daqing MF菌种的鉴定通过以下方法实现：1、本发明中的Salmonella Daqing MF细菌为革兰氏阴性短杆菌，Salmonella DaqingMF的菌落形态如图1所示，在固体培养基上生长时，为黑色圆形菌落，表面光滑，边缘不整齐；2、图2是用原子力显微镜观察的Salmonella Daqing MF的菌体形态图，菌落有荚膜，细菌长短多变，在宽0.35μm～0.7μm×长0.7μm～1.6μm的范围之间，菌体无鞭毛；3、SalmonellaDaqing MF的菌种分类鉴定：用试剂盒(宝生物公司生产)提取菌株DNA，采用通用引物进行PCR扩增，16S rDNA序列的引物Eubac27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；16S～23S rDNA间隔区的引物P1：5’-GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA-3’，P2：5’-CCTCTGACTGCCAGGGCATCC-3’；引物由大连宝生物有限公司合成，PCR反应在PTC-200上进行扩增，50μL的反应体系内含：模板40ng左右，TagDNA聚合酶(大连宝生物公司生产)终浓度为0.3U，dNTP为0.3mmol·L^-1，引物各0.1μmol·L^-1；扩增程序为：94℃预热5min，94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min；扩增产物于1.0％的琼脂糖电泳检测；用胶回收试剂盒(宝泰克)切胶回收，后与pGEM-T(Promega)载体连接，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞(天为时代)；LB固体培养基中加入氨苄青霉素Amp(5μg/MF)和X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷)，蓝白斑筛选转化子；提取质粒(华舜)，用载体引物T7和SP6检测，测序由上海生物工程有限公司完成；将Salmonella Daqing MF的16S rNA的PCR产物的序列与基因库NCBI中16S rNA对比，发现与沙门氏菌属的鼠伤寒沙门氏菌种(Salmonella typhimurium)有96％的同源性，但不完全相同，SalmonellaDaqing MF是属于沙门氏菌属而与鼠伤寒沙门氏菌种不同的一种短杆菌，本发明中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌的16S rNA序列的核苷酸有1259个，16S～23S rDNA间隔区的核苷酸有818个。

具体实施方式四：本实施方式中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌为革兰氏阴性短杆菌，有荚膜，专性厌氧生长，细菌长短多变，在宽0.35μm～0.7μm×长0.7μm～1.6μm的范围之间，菌体无鞭毛；在固体培养基上生长时，为黑色圆形菌落，表面光滑，边缘不整齐。

具体实施方式五：本实施方式中具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌应用于聚丙烯酰胺的降解。

Salmonella Daqing MF菌种对聚丙烯酰胺黏度的改变和降解率的大小通过以下方法测定：选用水溶性聚丙烯酰(HPAM)，代替乳酸钠作为碳源，用蒸馏水配置成浓度为600mg/L聚丙烯酰胺厌氧培养基，接种量为10％；选择生长曲线上代表性的4个点测定了聚丙烯酰胺溶液黏度，如图3所示：由于微生物的降解作用，黏度由接种时停滞期的19.0mPa·s，到第2天进入对数生长期的8.2mPa·s，至第7天稳定期3.0mPa·s，第20天衰亡期的1.1mPa·s，该菌对于降低黏度效果显著，第20天聚合物降解率为40～70％。Salmonella Daqing MF菌种对聚丙烯酰胺分子结构的改变如图4所述：水作用后的吸收峰与干粉样品相比有1571.0345的羰基峰出现，3433.0721峰值代表N-C键断裂；菌株作用后，相对与干粉样品和水溶液，增加1462.8813可能是羧基的吸收峰，在618.5579到1298.3612峰值为各种不同的苯环结构，多为菌株代谢产物。每逢MF菌株以聚丙烯酰胺为碳源和氮源，降解侧链，部分官能团发生改变，导致聚丙烯酰胺断链。聚丙烯酰胺结构的改变表现在降解产物中，产物萃取相的气相色谱图，经质谱计算机系统检索，并与纯化合物谱图核对，确定保留时间为9.368min的是底物正十六酰胺(C₁₆H₃₃N)，可能是聚合物的微生物作用下的C-C断链后的产物；此外还有3-甲基-4-康醇(C₈H₁₈O)保留时间为1.505min；2-甲基丁二酸异丁酯(C₁₃H₂₄O₄)保留时间为2.418min，此外还有15种微生物利用聚合物的降解和代谢产物；大部分降解产物中，低分子量化合物除含双键、环氧和羰基的聚丙烯酰胺碎片外，大多属于一般丙烯酰胺低聚体的衍生物。

MF菌株的系统发育树如图5所示。

序列表

<110>哈尔滨工业大学

<120>具有聚丙烯酰胺降解功能的硫酸盐还原细菌及其应用

<160>2

<210>1

<211>1259

<212>DNA

<213>沙门氏菌属(Salmonella)

<220>

<223>沙门氏菌属大庆沙门氏菌MF 16S rNA基因序列。

<400>1

tgcctaacac atgcaagtcg aacggtagca cagagagctt gctctcgggt gacgagtggc 60

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<210>2

<211>818

<212>DNA

<213>沙门氏菌属(Salmonella)

<220>

<223>沙门氏菌属大庆沙门氏菌MF16S～23S rDNA间隔区部分基因序列。

<400>2

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