一种紫杉木霉菌株及其在制备木霉菌酯素中的用途

摘要

本发明涉及一种以南方红豆杉内生真菌紫杉木霉菌株，及其在制备木霉菌酯素中的用途。木霉菌酯素具有抗肿瘤抗真菌活性，为进一步开发新的抗真菌药物提供了天然药物化学研究基础。本发明菌株，保藏号：CGMCC1672；25℃光暗培养7～14天，PDA、MEA菌落边缘形成大量白色疱状突起，疱状突起可愈合；瓶梗在疱状突起中的分生孢子梗上密集轮生，瓶梗安瓿形，顶部明显变细；分生孢子无色，光滑，椭圆形，1.7－2.0(1.9)×2.2－2.5(2.3)μm。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是一种以南方红豆杉内生真菌紫杉木霉菌株，及其在制备木霉菌酯素中的用途。

背景技术

从天然产物中发现新型先导化合物，是新药创制的重要途径。微生物是自然界中天然产物的主要来源，植物内生真菌作为其中的一个重要类群，是相对较新的研究领域。内生真菌产生的丰富多样的具多种生物活性的次生代谢产物在现代医药和农药工业中具有重要的应用潜力，它们在抗菌、抗病毒、杀虫、抗肿瘤、抗心血管疾病以及抗衰老等领域具有广阔的应用前景。典型例子是产生紫杉醇的内生真菌的发现(Stierle et al.，1993)。另一方面从植物内生真菌也发现了许多新生物活性物质，如从传统药用植物雷公藤分离到的内生真菌Rhinocladiella sp.可产生3种新松胞菌素(cytochalasin)，对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用(Wagenaar et al，2000)；从青蒿茎干中分离的内生真菌Colletotrichum sp.能产生多种对病原真菌和植物病原细菌有良好抑制作用的化合物，其MIC值一般在25～50μg/L(Lu et al.，2000)。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种新的菌株——紫杉木霉(Trichoderma taxii)菌株，及其在制备具有抗肿瘤抗真菌活性的木霉菌酯素(Trichodermisin)中的用途。

本发明的紫杉木霉(Trichoderma taxii)菌株，保藏号：CGMCC 1672；在PDA固体培养基上20℃72小时菌落直径37mm，25℃时55mm，30℃时71mm，35℃时不生长；在PDA上的最适温度为30℃；25℃光暗培养7～14天，PDA、MEA菌落边缘形成大量白色疱状突起，疱状突起可愈合；瓶梗在疱状突起中的分生孢子梗上密集轮生，瓶梗安瓿形，顶部明显变细；分生孢子无色，光滑，椭圆形，1.7-2.0(1.9)×2.2-2.5(2.3)μm。

本发明的菌株是从南方红豆杉分离得到的，它属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)，有丝分裂真菌肉座菌目(mitosporic Hypocreales)，木霉属(Trichoderma)。

本发明的菌株在制备木霉菌酯素中的用途，其特征在于：以人工发酵生产的紫杉木霉的发酵液为原料，浓缩发酵液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得到化合物木霉菌酯素。

本发明提供了一种新的紫杉木霉菌株，以该菌株制备的新化合物木霉菌酯素具有抗肿瘤抗真菌活性，为进一步开发新的抗真菌药物提供了天然药物化学研究基础。

附图说明

图1之A-D为本发明的紫杉木霉菌株的形态特征照片，其中A为MEA菌落形态；B为PDA菌落形态；C为分生孢子梗和瓶梗；D为分生孢子。

具体实施方式

实施例1、紫杉木霉(Trichoderma taxii)菌株的分离培养：

在实验室中按下列条件分离培养，即可获得本发明所述的紫杉木霉菌株。从我国江西官山自然保护区采集南方红豆杉(Taxus mairei)树皮及树枝，将采集的南方红豆杉的树皮及树枝在5％次氯酸钠表面消毒2min，无菌水漂洗后置于无菌滤纸上吸干水，用无菌刀片去除外皮层，并将其切成1cm左右大小组织片，将组织片移接在2％含100μg·ml^-1氨苄青霉素和链霉素的水琼脂平板上，24℃培养，待菌丝长出后，将菌丝顶端移接到PDA固体培养基上，连续重复纯化3次，获得纯培养。紫杉木霉菌株的形态特征见图1。

经测定，该菌株具有特异性序列如下：

TCGCGGGGAGGATGAGGACAAGCCCAGTAGGGTTTTCCCTTGTTAGGAGTGTCACTGGTGACCCTGCGCTCGACGGCTCTTTTTCGCGGAGAACAGTTGCCTACATGTCATAGGAATGTGTTAGCGTTTTGAAACATTTCAGGATAAATGGGAATAATAAAAGGAGAATTGAAGAGAAGTGGGCAGATAATCAAGTGTCATGAAAATGGATATGAGGTGAGATGGTGGCAAATGAAGCTGCAGCGAGAAAACATACACCACCATTCGTTCCCATGCCAAAGGCCCTTGAGTCGCCTCTTCTCCGTCGACGGCGTGCCTGGGTAAAAATCCTGGTAGCGATTCCTGGAAGGGGTCGCCATCGCCATGGTAAATGTGCGAAGCTCCAGTATTTCGTAAACTGAGGTTTGTTTCTGTTCCTGAACTTCCTAGAGTATGGCTTGGATCCAAGTCTTCCAGTAGCTCAACGGCGC。

实施例2、化合物木霉菌酯素的分离提取：

木霉菌菌株ZJUF0986发酵培养，浓缩发酵液用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯，得到化合物木霉菌酯素，该化合物为黄褐色液体。经测定，其结构式为，

EIMS确定分子量292，m/z(rel.int)：(292[M⁺]，40)，277(75)，149(25)，107(50)，91(48)，43(100)；红外光谱(KBr)确定具有C＝O(1735cm^-1)，C-O-C(1220，1080cm^-1)and C＝C(977cm^-1)；采用高分辨核磁共振仪(500MHz)测定了该化合物的¹H-NMR、¹³C-NMR、H-HCOSY、HMBC、HMQC、DEPT(135)等二维相关谱，确定了化合物所有碳原子和氢原子的信号归属。

新化合物木霉菌酯素的核磁共振图谱数据为：

  No.  ¹H-NMR  ¹³C-NMR    ¹H-¹HCOSY  1  2  3  4-CH₂  5.41  -  5.57  1.43d，1.93d，  75.1  140.3  118.6  24.5  5  3.61d  70.5    H_4a  6  7-CH₂  8  9-CH₂  10  11-CH₂  12-CH₃  -  2.53m，1.94m  3.83d  2.83d，3.12d  -  1.96m  0.72s  40.5  36.7  79.1  47.9  65.6  28.0  5.91  13-CH₃  1.71s  14.29    H₁  14-CH₃  15-CH₃  16-CH₃  17-CH₂  18  19CH₃  2.06s  2.00s  0.93s  4.14dd  -  1.27m  21.1  21.2  19.2  60.5  171.1  16.0

新化合物木霉菌酯素的抗菌生物测定：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar，PDA)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml。

以植物病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)及根霉(Rhizopus sp.)为指示菌株，采用生长速率法测定新化合物木霉菌酯素对指示菌的抑制作用。将木霉菌酯素配成不同浓度的药液按一定量分别加入到预先溶化的一定量的PDA固体培养基中，混匀制成一定浓度的带毒培养基，将带毒培养基倒入直径9mm的培养皿中制成平板，同时用无毒培养基作对照，各种浓度和对照重复3次。用打孔器打出菌丝块放在平板中央。在24℃培养至菌丝生长接近培养皿边缘时测定菌落直径，每个菌落十字交叉测量2次，计算出每种处理菌落平均直径。按公式计算药剂对菌丝生长的相对抑制率，采用剂量对数-抑制率机率值法计算求得半抑制浓度(IC₅₀)。

生长速率法测定表明，化合物木霉菌酯素对立枯丝核菌的半抑制浓度IC₅₀为1.1μg/ml，对灰葡萄孢的IC₅₀为2.0μg/ml，对根霉的IC₅₀为17.1μg/ml。

新化合物木霉菌酯素的抗肿瘤生物测定：

以对卤虫(Artemia salina)的细胞毒试验测定新化合物木霉菌酯素的抗肿瘤活性。卤虫卵在pH 8.5的人工海水中28℃培养孵化24hr。将人工海水以1∶1的比例与系列浓度的木霉菌酯素溶液混合加入到试管中，每处理3个重复，同时以蒸馏水、鬼臼毒素分别作为空白对照和阳性对照。在每个试管中加入10只正常的卤虫，培养24hr后观察及记录各处理的卤虫死亡数，计算校正死亡率，采用剂量对数-死亡率机率值法计算求得半抑制浓度(LC₅₀)。

细胞毒试验测定表明，化合物木霉菌酯素对卤虫的LC₅₀为1.3μg/ml。