针对B型淋巴造血增殖的细胞毒性抗体

摘要

本发明涉及一种针对CD20抗原的单克隆抗体，其中该抗体的每条轻链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.5具有至少70％同一性的序列编码，该抗体的每条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.7具有至少70％同一性的序列编码，而且该抗体的轻链和重链的恒定区是来自于非鼠种类的恒定区。本发明还涉及该抗体用于激活免疫效应细胞的Fcγ RIIIA受体的用途，和用于制备药物尤其是治疗白血病或淋巴瘤的药物的用途。

说明书

本发明涉及一种针对CD20抗原的单克隆抗体，其中每条轻链的 可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.5具有至少70％序列同一性的序列 编码，每条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.7具有至少70％ 同一性的序列编码，而且轻链和重链的恒定区是来自非鼠种类的恒定 区，本发明同时涉及这种抗体的用途，用于激活免疫效应细胞中的 FcγRIII受体，和用于制备药物，尤其是用于治疗白血病或淋巴瘤。

介绍和现有技术

CD20抗原是一种疏水性跨膜蛋白，分子量为35-37kDa，其存在 于成熟的B淋巴细胞的表面(Valentine et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84(22)：8085-8089；Valentine et al.(1989)J.Biol.Chem.，264(19)： 11282-11287)。它在B淋巴细胞(B细胞)，从早期前B阶段起的发育 期间表达直到分化成浆细胞时为止，在浆细胞阶段这种表达消失。CD20 抗原存在于正常的B淋巴细胞与恶性B细胞上。更具体地，CD20抗原 在大多数B表型淋巴瘤中(80％淋巴瘤)中表达：例如，它在超过90％ 的非何杰金氏B细胞淋巴瘤(NHL)，以及超过95％的B型慢性淋巴 细胞白血病(B-CLL)中表达。CD抗原不在造血干细胞与浆细胞上表达。

CD20的功能还没有完全清楚，但是它可以用作钙通道，并参与B 淋巴细胞分化的第一阶段的调控(Golay et al.(1985)J.Immunol.135(6)： 3795-3801)和增殖的调控(Tedder et al(Aug 1986)Eur.J.Immunol. 16(8)：881-887)。

因此，尽管它在B细胞激活和增殖中的作用还有一些不确定，但 是由于它的定位，CD20抗原是使用特异性识别CD20的抗体用于治疗 包括肿瘤B细胞，如NHL或B-CLL等疾病的重要靶。而且，该抗原 是理想的靶，因为它是膜蛋白，其表达调节和多态性还是未知的。

仅仅一个非放射性标记的抗-CD20单克隆抗体，Rituxan^(Genentech)，目前是商业可获得用于治疗B细胞淋巴瘤。当联合化疗 时，它在患有NHL的患者中显示鼓舞人心的临床效果。然而，当单独 使用时，它的效力是可变的而且经常是不大的(Teeling et al.(2004) Blood 104(6)：1793-1800)。

此外，Rituxan^在B-CLL中对B细胞只有较小的作用。这种低 程度的效力与各种现象相关：一方面，B-CLL B细胞只以相对低的量表 达CD20，另一方面，在体外对这些细胞，Rituxan^只诱导很低的ADCC (抗体依赖的细胞毒性)活性水平。这两种观察结果可以解释在肿瘤 中CD20表达水平(定量流式细胞仪)与治疗应答之间观察到的相关性。

因为B-CLL是西方国家最普遍的白血病形式，而且高剂量化疗治 疗有时候证实是不够的，并包括导致造血发育不全和免疫缺乏的副作 用，单克隆抗体仿佛是一种新的方法。因此，开发能特异性靶向CD20 抗原，并允许肿瘤细胞如B-CLL被破坏的抗体是首要的，B-CLL只有 限程度地表达这种抗原。

Genmab(Teeling et al.(2004)Blood 104(6)：1793-1800)建议把抗体 2F2和7D8用于治疗B-CLL，这两个抗体能激活补体，其高于Rituxan^诱导的补体。然而，这些抗体，与Rituxan^类似，具有低的ADCC活 性。但是，一些临床医生表示，补体活性是有害副作用的起因，因为 抗体触发了激活系统，其导致广谱非特异性活性(炎性，过敏性或血 管反应等等)的分子(特别是，过敏毒素)的产生。此外，这些抗体 仍然处于研究阶段，而且它们的临床效力还有待评估。

在申请FR03/02713(WO2004/029092)中，本申请人描述了一种抗 -CD20抗体，其可以在YB2/0系中产生，并与Rituxan^相比，由于其 诱导高ADCC活性和通过Jurkat-CD16细胞的高IL-2生产水平的能力 而选择它。显著需要新的抗-CD20抗体，其将扩展使用目前可用的免 疫疗法治疗的B细胞疾病的范围；特别是对于其中在涉及的B细胞群 体中较小程度地表达CD20抗原而且不存在令人满意的免疫疗法的B 细胞疾病的情况。

为了该目的，本申请人已经开发了新的CD20抗体，与Rituxan^相比，其显示特别高的ADCC活性。

发明内容

本发明的第一个目的因此涉及一种针对CD20抗原的单克隆抗体， 其中每条轻链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.5具有至少70％同 一性的序列编码，每条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.7具有 至少70％同一性的序列编码，而且轻链和重链的恒定区是来自非鼠种 类的恒定区。

抗体由通过二硫键连接到一起的重链和轻链组成。每条链由位于 N-末端的可变区(或结构域)  (由重排的轻链V-J基因和重链V-D-J基 因编码)，其对抗体针对的抗原是特异性的，与位于C-末端的恒定区 组成，该恒定区由来自轻链的单个CL结构域，或重链的几个结构域组 成。

为了本发明的目的，“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”的 表达指具有相同和独特的特异性的抗体分子制剂。

根据本发明的抗体，其中轻链和重链中的可变区来自与轻链和重 链的恒定区不同的种类，则被称为“嵌合”抗体。

鼠核酸序列SEQ ID No.5与SEQ ID No.7，分别编码由鼠杂交瘤 CAT-13.6E12产生的抗体的每条轻链的可变区与每条重链的可变区，可 获自德国微生物保藏中心(DSMZ)，保藏号为ACC 474。该杂交瘤产 生针对CD20的鼠IgG2a，κ-型单克隆抗体。

这些鼠序列被选择以衍生出本发明抗体的可变区序列，由于 CAT-13.6E12鼠抗体对于CD20抗原的特异性，该抗原也被Rituxan^识别。本发明抗体的可变区与序列SEQ ID No.5和SEQ ID No.7具有 至少70％的同一性，这种序列同一性为本发明的抗体提供了与 CAT-13.6E2鼠抗体相同的特异性。优选地，这种序列同一性还为本发 明的抗体提供了与CAT-13.6E2鼠抗体相同的靶亲和力。

而且，本申请人还令人惊讶地表明，在存在表达FcγRIIIA受体的 胞外结构域(如图11所示)的Jurkat-CD16细胞时，CAT-13.6E12鼠 抗体能诱导IL-2的分泌，这指示了鼠抗体与人CD16(FcγRIIIA)之间强 的结合，其再次促发了本申请人的选择。

此外，在本发明的抗体中，轻链和重链的恒定区来自于非鼠的种 类。在这点上，所有的非鼠哺乳动物种和属都可以使用，尤其是人， 猴，鼠(除小鼠以外)，猪，牛，马，猫，犬，以及鸟。

本发明的抗体可以使用本领域技术人员熟知的标准重组DNA技 术构建，更特别地使用，例如，Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81：6851-6855描述的“嵌合”抗体构建技术，其中重组DNA技术 用于把非人哺乳动物抗体中的重链的恒定区和/或轻链的恒定区，置换 为人免疫球蛋白的相应区域。下面将举例说明一个特定的实施方案。

有利地，本发明抗体的每条轻链的可变区由与鼠核酸序列 SEQ ID No.5具有至少80％同一性的序列编码，而且本发明抗体的每 条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.7具有至少80％同一性的 序列编码。

有利地，本发明抗体的每条轻链的可变区由与鼠核酸序列 SEQ ID No.5具有至少90％同一性的序列编码，而且本发明抗体的每 条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.7具有至少90％同一性的 序列编码。

有利地，本发明抗体的每条轻链的可变区由与鼠核酸序列 SEQ ID No.5具有至少95％同一性的序列编码，而且本发明抗体的每 条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.7具有至少95％同一性的 序列编码。

有利地，本发明抗体的每条轻链的可变区由与鼠核酸序列 SEQ ID No.5具有至少99％同一性的序列编码，而且本发明抗体的每 条重链的可变区由与鼠核酸序列SEQ ID No.7具有至少99％同一性的 序列编码。

有利地，本发明还涉及任何其中重链和轻链的可变区包括一个或 多个氨基酸取代，一个或多个氨基酸插入或缺失，而且这些序列修饰 符合上面限定的序列同一性百分数水平，同时不影响抗体对靶的特异 性或亲合力的抗体。

本发明的抗体可以是任何包括与FR(构架)区域(可变区的高度 保守区域，也称为“骨架”区域)结合的CAT-13.6E1 2抗体的CDR(互 补性决定区)的抗体。这些抗体具有与CAT-13.6E12鼠抗体接近相当， 而且优选与CAT-13.6E12鼠抗体相同的亲合力和特异性。

优选地，本发明抗体的每条轻链的可变区由鼠核酸序列 SEQ ID No.5或由鼠核酸序列SEQ ID No.25编码，而且本发明抗体的 每条重链的可变区由鼠核酸序列SEQ ID No.7编码。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体因此是针对CD20抗 原的单克隆抗体，其中每条轻链的可变区由鼠核酸序列SEQ ID No.5 编码，每条重链的可变区由鼠核酸序列SEQ ID No.7编码，而且轻链 和重链的恒定区是来自非鼠种类的恒定区。

在另一个实施方案中，本发明的抗体因此是针对CD20抗原的单 克隆抗体，其中每条轻链的可变区由鼠核酸序列SEQ ID No.25编码， 每条重链的可变区由鼠核酸序列SEQ ID No.7编码，而且轻链和重链 的恒定区是来自非鼠种类的恒定区。

两个实施方案中，抗体的核苷酸序列只有一个核苷酸不 同：SEQ ID No.5与SEQ ID No.25的第318位的核苷酸，其分别对应 一个胞嘧啶与一个腺嘌呤。

根据这些实施方案的本发明的抗体，具有与CAT-13.6E12鼠抗体 相当，而且优选与CAT-13.6E12鼠抗体相同的对靶抗原，CD20，的特 异性和亲合力。

优选地，本发明抗体的每条轻链和每条重链的恒定区是人恒定区。 在本发明的该优选实施方案中，抗体的免疫原性在人中降低，从而， 对人治疗给药后，抗体的效力提高。

根据本发明的一个优选的实施方案，本发明抗体的每条轻链的恒 定区是κ型。任何同种异型都适于实施本发明，例如，Km(1)，Km(1，2)， Km(1，2，3)或Km(3)，但是优选的同种异型是Km(3)。

根据另一个另外的实施方案，本发明抗体的每条轻链的恒定区是λ 型。

根据本发明的一个特定的方面，尤其是当本发明抗体的每条轻链 的恒定区和每条重链的恒定区是人恒定区时，抗体的每条重链的恒定 区是γ型。根据该替代方案，抗体的每条重链的恒定区可以是γ1，γ2或 γ3型，而且这三个恒定区类型显示结合人补体的特定特征，或者甚至 可以是γ4型。每条重链的恒定区为γ型的抗体属于IgG类。免疫球蛋 白G(IgG)是异二聚体，其由2条重链和2条轻链组成，并通过二硫键 连接在一起。每条链由位于N-末端的可变区或结构域(由由重排的轻 链V-J基因和重链V-D-J基因编码)，其对抗体针对的抗原是特异性的， 与位于C-末端的恒定区组成，对于轻链该恒定区由单个CL结构域， 或对于重链由3个结构域(CH₁，CH₂和CH₃)组成。结合重链和轻链的 可变区与CH₁和CL结构域，产生Fab片段，其通过一个高度灵活的 铰链区与Fc区域连接，该高度灵活的铰链区允许每个Fab片段与它的 抗原靶结合，并同时Fc区域作为抗体效应器特性的介质仍然能到达效 应分子如FcγR和C1q受体。Fc区域，由CH₂和CH₃球状区域组成， 用一个与存在于2条链的每条链上的Asn 297连接的乳糖胺型二天线 N-多糖，在CH₂结构域处糖基化。

优选地，抗体的每条重链的恒定区是γ1型，因为这种抗体显示能 在最大数量的(人)个体中诱导ADCC活性。这样，所有的同种异型 都适于实施本发明，例如，G1m(3)，G1m(1，2，17)，G1m(1，17)或G1m(1， 3)。优选地，同种异型是G1m(1，17)。

根据本发明的一个特定方面，抗体的每条重链的恒定区是γ1型， 而且由人核酸序列SEQ ID No.23编码，同时每条轻链的恒定区由人核 酸序列SEQ ID No.21编码。这种抗体从而包括鼠可变区和人恒定区， 以及γ1-型重链。该抗体因此属于IgG1亚类。根据本发明抗体的实施 方案，抗体具有两条轻链，轻链可变区由鼠核酸序列SEQ ID No.5或 鼠核酸序列SEQ ID No.25编码，轻链的人恒定区由核酸序列 SEQ ID No.21编码，和两条重链，重链的可变区由鼠核酸序列 SEQ ID No.7编码，重链的恒定区由人核酸序列SEQ ID No.23编码。

优选地，本发明抗体的每条轻链由鼠-人嵌合核酸序列 SEQ ID No.13，或由鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.27编码，每条重 链由鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.19编码。鼠-人嵌合核酸序列 SEQ ID No.13，其编码抗体的每条轻链，可通过融合编码抗体的每条 轻链的可变区的鼠核酸序列SEQ ID No.5，与编码抗体的每条轻链的恒 定区的人核酸序列SEQ ID No.21来获得。

鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.27，其编码抗体的每条轻链，通 过融合编码抗体的每条轻链的可变区的鼠核酸序列SEQ ID No.25，与 编码抗体的每条轻链的恒定区的人核苷酸序列SEQ ID No.21来获得。

鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.19，其编码抗体的每条重链，通 过融合编码抗体的每条重链的可变区的鼠核酸序列SEQ ID No.7，与编 码抗体的每条重链的恒定区的人核苷酸序列SEQ ID No.23来获得。

根据本发明的一个特定方面，当抗体的每条轻链由鼠-人嵌合核酸 序列SEQ ID No.13编码，每条重链由鼠-人嵌合核酸序列 SEQ ID No.19编码时，从核酸序列SEQ ID No.13推测的每条轻链的 肽序列为序列SEQ ID No.14，而且从核酸序列SEQ ID No.19推测的 每条重链的肽序列，为序列SEQ ID No.20。

根据本发明另一个特定的方面，当抗体的每条轻链由鼠-人嵌合核 酸序列SEQ ID No.27编码，每条重链由鼠-人嵌合核酸序列 SEQ ID No.19编码时，从核酸序列SEQ ID No.27推测的每条轻链的 肽序列为序列SEQ ID No.28，而且从核酸序列SEQ ID No.19推测的 每条重链的肽序列，为序列SEQ ID No.20。

肽序列SEQ ID No.14与SEQ ID No.28，仅仅在两条序列的第106 位的氨基酸不同。序列SEQ ID No.28的第106位氨基酸为赖氨酸(K)； 序列SEQ ID No.14的第106位氨基酸为天冬酰胺(N)。

本发明还涉及抗体，其中由鼠-人嵌合核苷酸序列编码的每条轻 链，与鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.13具有至少70％同源性或同一 性，而且由鼠-人嵌合核酸序列编码的每条重链，与鼠-人嵌合核酸序列 SEQ ID No.19具有至少70％同源性或同一性，同时这些修饰既不负面 地削弱抗体的特异性，也不削弱它的效应器活性，如ADCC(抗体依 赖性的细胞介导的细胞毒性)活性。

以尤其有利的方式，本发明的抗体通过大鼠杂交瘤细胞系产生。 产生本发明抗体的该细胞系是重要的特征，因为它为抗体提供某些特 定的特性。实际上，表达抗体的方法诱导了翻译后修饰，尤其是糖基 化修饰，其在一个细胞系与另一个细胞系中是不同的，并因此为具有 相同一级结构的抗体提供不同的功能特性。

在优选的实施方案中，抗体在大鼠杂交瘤YB2/0细胞系(细胞 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20，其在美国典型培养物保藏中心以ATCC号 CRL-1662登记)中产生。选择该系，是由于相较于产生具有相同一级结 构的抗体的细胞，例如，CHO细胞，它产生具有提高的ADCC活性的 抗体。

根据一个特定的实施方案，本发明优选的抗体是由克隆R509产生 的抗体EMAB6，克隆R509于2004年11月8日在国家微生物保藏中 心，以登记号CNCMI-3314登记(CNCM，Institut Pasteur，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，France)。EMAB6抗体的每条轻链 都由鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.13编码，而且每条重链都由鼠-人 嵌合核酸序列SEQ ID No.19编码。该嵌合抗体与CAT-13.6E12鼠抗体 竞争结合CD20，而且具有比Rituxan^高得多的细胞毒性，其部分归因 于这些抗体重链的N-聚糖的特异性糖基化(参见实施例4)。事实上， R509克隆的特定特征是，它产生岩藻糖/半乳糖比率小于0.6的EMAB6 抗体组合物，其已经在专利申请FR 0312229中表明，能最佳地为抗体 提供强的ADCC活性。该抗体因此尤其令人感兴趣地用作治疗工具， 用于治疗其中被靶向的细胞表达CD20的疾病。

在另外一个特定的实施方案中，本发明的另一个优选的抗体是克 隆R603产生的抗体EMAB603，其于2005年11月29日在国家微生物 保藏中心(CNCM，Institut Pasteur，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，France)以登记号CNCM I-3529登记。EMAB603抗体的每条 轻链都由鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.27编码，而且每条重链都由鼠 -人嵌合核酸序列SEQ ID No.19编码。该嵌合抗体与CAT-13.6E12鼠抗 体竞争结合CD20，而且具有比Rituxan^高得多的细胞毒性，其部分归 因于这些抗体重链的N-聚糖的特异性糖基化(参见实施例3)。事实 上，R603克隆的一个特定特征是，它产生岩藻糖/半乳糖比率小于0.6 的EMAB603抗体组合物，(参见实施例4)，其已经在专利申请FR 0312229中表明，能最佳地为抗体提供强的ADCC活性。该抗体因此 尤其令人感兴趣地用作治疗工具，用于治疗其中被靶向的细胞表达 CD20的疾病。

本发明的另一个目的涉及载体pEF-EMAB6-K，其用于表达本发明 抗体的具有序列SEQ ID No.12的轻链。该载体是允许表达本发明的抗 体的载体，该抗体的轻链由核酸序列SEQ ID No.13编码，其推测的肽 序列为序列SEQ ID No.14。该载体是一种核酸分子，其中插入了鼠核 酸序列SEQ ID No.5，其编码抗体的每条轻链的可变区，以及核酸序列 SEQ ID No.21，其编码抗体的每条轻链的恒定区，引入到宿主细胞中并 在宿主细胞中保持。它允许外源核酸片段在宿主细胞中表达，因为它 具有这种表达所必需的序列(启动子，多聚腺苷酸序列，选择基因)。 这些载体是本领域技术人员熟知的，而且可以是，没有默认的限制， 腺病毒，逆转录病毒，质粒或噬菌体。此外，任何哺乳动物细胞可用 作宿主细胞，也即用作表达本发明抗体的细胞，例如，YB2/0，CHO，CHO dhfr-(例如，CHO DX B11，CHO DG44)，CHO Lec13，SP2/0，NSO，293， BHK或COS。

本发明的另一个目标涉及用于表达本发明抗体的重链的载体 pEF-EMAB6-H，其具有序列SEQ ID No.18。该载体是允许表达本发明 抗体的载体，该抗体的重链由核酸序列SEQ ID No.19编码，其推测的 肽序列为序列SEQ ID No.20。该载体是这样的核酸分子，其中插入了 鼠核酸序列SEQ ID No.7，其编码抗体的每条重链的可变区，和人核酸 序列SEQ ID No.23，其编码抗体的每条重链的恒定区，以引入并保持 在宿主细胞中。它允许这些外源核酸片段在宿主细胞中表达，因为它 具有这种表达所必需的序列(启动子，聚腺苷酸化序列，选择基因)。 正如前面指出的，载体可以是，例如，质粒，腺病毒，逆转录病毒或 噬菌体，而且宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞，例如，YB2/0，CHO， CHO dhfr-(CHO DX B11，CHO DG44)，CHO Lec13，SP2/0，NS0，293， BHK或COS。

通过在YB2/0细胞中共表达pEF-EMAB6-K和pEF-EMAB6-H载 体所产生的抗体，由克隆R509(在CNCM以登记号CNCM I-3314登 记)产生的抗-CD20 EMAB6抗体进行示例。在来自患有B-CLL的患者 的细胞中(其上CD20抗原以较低水平表达)，和在用作模型并与来自 患有B-CLL的患者的细胞相比以较高密度表达CD20的Raji细胞中，， 该抗体诱导的细胞毒性都高于Rituxan^诱导的细胞毒性。而且，EMAB6 抗体在Jurkat-CD16细胞中以比Rituxan^高得多的水平诱导IL-2(白介 素2)的分泌。由于可以通过在培养基中并在允许表达上面所述的载体 的条件下生长R509克隆，来生产EMAB6抗体，因此它是一种非常令 人感兴趣的工具，用于推进其中涉及CD20抗原的B细胞疾病，更具 体地B-CLL的治疗和诊断，以及用于该领域的研究。

本发明的一个特定的目标是表达本发明抗体的稳定细胞系。

有利地，表达本发明抗体的稳定细胞系选自：SP2/0，YB2/0， IR983F，人骨髓瘤如Namalwa或人来源的任何其它细胞，如PERC6， CHO系，尤其是CHO-K-1，CHO-Lec10，CHO-Lec1，CHO-Lec13，CHO Pro-5，CHO dhfr-(CHO DX B11，CHO DG44)，或选自Wil-2，Jurkat， Vero，Molt-4，COS-7，293-HEK，BHK，K⁶H⁶，NSO，SP2/0-Ag 14与 P3X63Ag8.653的其它系。

使用的系优选是大鼠杂交瘤YB2/0细胞系。选择该系是由于，与 例如CHO细胞中产生的具有相同一级结构的抗体相比，该系能产生具 有提高的ADCC活性的抗体。

根据本发明的一个特定的方面，表达本发明抗体的，而且更具体 地选自上述小组的稳定细胞系，具有如前面所述的整合的两个 pEF-EMAB6-K和pEF-EMAB6-H表达载体。

本发明的一个特定的方面涉及克隆R509，其在国家微生物保藏中 心(CNCM)以登记号CNCMI-3314登记。

本发明的一个特定方面涉及克隆R603，其在国家微生物保藏中心 (CNCM)以登记号CNCMI-3529登记。

本发明的另一个目标涉及一种DNA片段，其具有编码本发明抗体 的重链的序列SEQ ID No.19。鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.19编码 抗体的每条重链。通过融合鼠核酸序列SEQ ID No.7，其编码抗体的每 条重链的可变结构域，与人核酸序列SEQ ID No.23，其编码抗体的每 条重链的恒定区，来获得该鼠-人嵌合核酸序列。

本发明的另一个特定目标涉及DNA片段，其具有编码本发明抗体 的轻链的序列SEQ ID No.13。鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.13编码抗 体的每条轻链。通过融合鼠核酸序列SEQ ID No.5，其编码抗体的每条 轻链的可变区，与人核酸序列SEQ ID No.21，其编码抗体的每条轻链 的恒定区，来获得该鼠-人嵌合核酸序列。

本发明的另一个特定目标涉及DNA片段，其具有编码本发明抗体 的轻链的序列SEQ ID No.27。鼠-人嵌合核酸序列SEQ ID No.27编码 抗体的每条轻链。通过融合鼠核酸序列SEQ ID No.25，其编码抗体的 每条轻链的可变区，与人核酸序列SEQ ID No.21，其编码抗体的每条 轻链的恒定区，来获得该鼠-人嵌合核酸序列。

本发明的一个特定目标涉及使用本发明的抗体用于体内或体外激 活效应器免疫细胞的FcγRIIIA受体。实际上，本发明的抗体具有细胞 毒性的特定特征和优点。这样，它们显示能用它们的Fc区域激活 FcγRIIIA受体。这是相当有趣的，因为该受体在称为“效应细胞”的 细胞的表面上表达：抗体的Fc区域与效应细胞携带的受体结合，导致 FcγRIIIA受体的激活，以及靶细胞的破坏。效应细胞是，例如，NK(自 然杀伤细胞)细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，CD8淋巴细胞，Tγδ 淋巴细胞，NKT细胞，嗜酸性粒细胞，嗜碱细胞或肥大细胞。

在一个特定方面中，本发明的抗体用作药物。有利地，这种药物 用于治疗其中靶细胞是表达CD20的细胞的疾病，如恶性B细胞淋巴 瘤。

根据一个有利的方面，本发明的抗体用于制备治疗白血病或淋巴 瘤的药物。

本发明的一个特定的目标是使用本发明的抗体用于制备治疗选自 急性B淋巴母细胞的白血病，B细胞淋巴瘤，成熟B细胞淋巴瘤，包 括B型慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)，小B细胞淋巴瘤，B细胞前 淋巴细胞白血病，淋巴浆细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤， 缘区MALT型淋巴瘤，带有或没有单核B细胞的淋巴结缘区淋巴瘤， 脾脏缘区淋巴瘤(带有或没有绒毛淋巴细胞)，毛白细胞白血病 (tricholeucocytic)，弥散性大B细胞淋巴瘤，Burkitt’s淋巴瘤，以及 任何涉及B淋巴样细胞的免疫功能紊乱疾病，包括自身免疫性疾病的 病理的药物。

本发明的另一个目标是使用本发明的抗体，用于制备治疗淋巴样 白血病的药物。

本发明的另一个目标是使用本发明的抗体，用于制备治疗B型慢 性淋巴样白血病(B-CLL)的药物。而且，本发明的抗体尤其很适于治 疗其中CD20在B细胞表面不是较强表达的疾病，优选B-CLL(B型 慢性淋巴细胞白血病)。在这点上，本发明的抗体可与一种或多种另 外的抗体组合使用，例如，针对一种或多种在淋巴样细胞上表达的另 外的抗原如例如，抗原HLA-DR，CD19，CD23，CD22，CD80，CD32和 CD52的单克隆抗体，用于制备治疗白血病或淋巴瘤的药物。因此，人 源化的抗体Campath-1H^(alentuzumab，MabCampathR^)，其靶向在 淋巴样细胞上大量表达的分子，CD52抗原，而且其通过动员宿主效应 机制(补体结合，抗体依赖的细胞毒性)诱导细胞裂解，用于治疗 CLL(Moreton P.，Hillmen P.(2003)Semin.Oncol.30(4)：493-501； Rawstron A.C.et al，(2004)Blood 103(6)：2027-2031；Robak T.(2004) Leuk.Lymphoma 45(2)：205-219；Stanglmaier M.et al，(2004)Ann. Hematol.83(10)：634-645)。用于评估靶向患有CLL的患者中的抗原 HLA-DR，CD22，CD23，CD80的抗体或免疫毒素的临床检测也在 进行中(Mavromatis B.H.，Cheson B.D.(2004)Blood Rev.18(2)：137-148； Mavromatis B.，Cheson B.D.(2003)J.Clin.Oncol.21(9)：1874-1881， Coleman M.et al，(2003)Clin.Cancer Res.9：3991S-3994S；Salvatore G. et al，(2002)Clin.Cancer Res.8：995-1002)。

在另一个实施方案中，本发明的抗体也可用于与表达FcγRs的细 胞的细胞组合使用，如NK细胞，NKT(天然杀伤T细胞，Tγδ淋巴细 胞，巨噬细胞，单核细胞或树突细胞，也即，与细胞治疗组合使用(Peller S.，Kaufman S.(1991)Blood 78：1569，Platsoucas C.D.et al，(1982)J. Immunol.129：2305；Kimby E.et al，(1989)Leukaemia 3(7)：501-504； Soorskaar D.et al，Int.Arch.Allery Appl.Immunol.87(2)：159-164； Ziegler H.W.et al，(1981)Int.J.Cancer 27(3)：321-327；Chaperot L.et al， (2000)Leukaemia 14(9)：1667-1677；Vuillier F.，Dighiero G.(2003)Bull. Cancer.90(8-9)：744-750)。

而且，本发明的抗体有利地允许减少施用给患者的剂量：有利地， 施用给患者的剂量比Rituxan^的剂量低2倍，5倍，或者甚至10倍， 25倍，50倍或者尤其有利地100倍。有利地，施用给患者的抗体剂量 比Rituxan^的剂量低2到5倍，5到10倍，5到25倍，5到50倍，或 者甚至5到100倍。因此，本发明的抗体，例如EMAB6抗体，有利地 可以低于187.5mg/m²，75mg/m²，37.5mg/m²，15mg/m²， 7.5mg/m²，或者尤其有利地以低于3.75mg/m²的剂量施用。施用的剂 量有利地为187.5mg/m²到75mg/m²，或者75mg/m²到37.5mg/m²， 75mg/m²到15mg/m²，75mg/m²到7.5mg/m²，或者甚至75mg/m²到3.75mg/m²。

因此，本发明也涉及一种用于治疗其中靶细胞是表达CD20的细 胞的疾病如恶性B细胞淋巴瘤的方法，包括给患者施用有效剂量的含 有本发明抗体的组合物。更具体地，该治疗方法尤其适于治疗白血病 或淋巴瘤。甚至更具体地，它是一种用于治疗选自急性B淋巴母细胞 白血病，B细胞淋巴瘤，成熟B细胞淋巴瘤，包括B型慢性淋巴细胞 白血病(B-CLL)，小B细胞淋巴瘤，B细胞前淋巴细胞白血病，淋巴 浆细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，缘区MALT型淋巴瘤， 带有或没有单核B细胞的淋巴结缘区淋巴瘤，脾脏缘区淋巴瘤(带有 或没有绒毛淋巴细胞)，毛白细胞白血病，弥散性大B细胞淋巴瘤， Burkitt’s淋巴瘤，以及任何涉及B淋巴样细胞的免疫功能紊乱疾病， 以及自身免疫性疾病的病理的方法，包括施用有效剂量的本发明抗体 或抗体组合物。

本发明的一个特定的目标是使用本发明的抗体，用于制备治疗慢 性移植物抗宿主反应疾病的药物，以治疗涉及接受者的B细胞的症状。

最后，本发明的最后一个目标是使用本发明的抗体用于制备治疗 器官，尤其是肾移植物排斥的药物。

最近的研究(Ratanatharathorn et al，(Aug 2003)Biol.Blood Marrow Transplant 9(8)：505-511；Becker et al，(Jun 2004)Am.J.Transplant.4(6)： 996-1001)实际上已经表明，抗-CD20抗体在治疗这些疾病中的益处。

本发明其它的方面和优点将描述于下面的实施例中，其应当理解 为示例性实施例，而不是限制本发明的范围。

附图描述

图1：用于嵌合抗体EMAB6与EMAB603的轻链κ的CKHu载体 的图示。

图2：用于产生抗体EMAB6的轻链pEF-EMAB6-K表达载体的图 示。

图3：用于嵌合抗体EMAB6与EMAB603的重链的G1Hu载体的图 示。

图4：用于产生抗体EMAB6的轻链pEF-EMAB6-H表达载体的图 示。

图5：CAT-13.6E12(CAT13)产生的鼠抗体与嵌合EMAB6抗体竞 争结合Raji细胞上表达的CD20。

图6：抗-CD20抗体在Raji细胞上的补体依赖性细胞毒性。(A) Rituxan^：空心三角形，EMAB6：实心菱形。细胞裂解通过测定释放到上 清液中的细胞内LDH来进行评估。结果表示成裂解百分数，而且用 Rituxan^获得的值(以5,000ng/mL抗-CD20抗体)为100％。5次测定 的平均值。(B)比较EMAB6(实心菱形)与EMAB603(空心菱形)的 补体依赖性细胞毒性。

图7：在存在Raji细胞时，抗--CD20抗体诱导的ADCC活性。(A) Rituxan^：空心三角形，EMAB6：实心菱形。细胞裂解通过测定释放到上 清液中的细胞内LDH来进行评估。结果表示成裂解百分数，而且用 Rituxan^获得的值(以250ng/mL抗-CD20抗体)为100％。3次测定 的平均值。(B)比较EMAB6(实心菱形)与EMAB603(空心菱形)诱 导的ADCC。

图8：在存在来自患有B-CLL的患者的B淋巴细胞时，抗-CD20抗 体诱导的ADCC活性。Rituxan^：空心三角形，EMAB6：实心菱形。E/T 比率＝15。细胞裂解通过测定释放到上清液中的钙黄绿素(calcein) 来进行评估。结果表示成百分数，而且用Rituxan^获得的值(以 500ng/mL抗-CD20抗体)为100％。对应于4个不同患者的4个实验 的平均值。

图9：在存在Raji细胞时，抗-CD20抗体诱导的CD16(FcγRIIIA)的 激活。Rituxan^：空心三角形，EMAB6：实心菱形。结果表示成使用ELISA 在上清液中进行测定的IL-2的百分数；而且用Rituxan^获得的值(以 2，500ng/mL的抗-CD20抗体)是100％。4次测定的平均值。(B). 比较EMAB6(实心菱形)与EMAB603(空心菱形)诱导的CD16 (FcγRIIIA)的激活。

图10：在存在来自患有B-CLL的患者的B淋巴细胞时，抗--CD20 抗体诱导的CD16(FcγRIIIA)的激活。Rituxan^：空心三角形，EMAB6： 实心菱形。结果表示成使用ELISA在上清液中进行测定的IL-2的百分 数；而且用Rituxan^获得的值(以2,500ng/mL的抗-CD20抗体)是100 ％。12个患者的平均值。

图11：在存在Jurkat-CD16细胞(Fcγ/RIIIA)时，CAT-13.6E12鼠抗 体诱导的IL-2的产生。

图12：用于产生抗体EMAB603的重链和轻链pRSV-HL-EMAB603 表达载体的图示。

实施例

实施例1：构建用于抗-CD20嵌合抗体EMAB6与EMAB603的表达载体

A.确定CAT-13.6E12鼠抗体的可变区的序列

分离来自鼠杂交瘤CAT-13.6E12细胞(供应者：DSMZ， ref.ACC 474)的总RNA，该细胞产生IgG2a，κ-型免疫球蛋白(RNAeasy 试剂盒，Qiagen ref.74104)。逆转录之后，使用5′RACE技术(cDNA 末端的快速扩增)(GeneRacer试剂盒，Invitrogen ref.L1500-01)，对 CAT-13.6E12抗体的轻链可变区(Vκ)和重链可变区(VH)进行扩增。用于 这两步的引物如下：

1.逆转录引物

a.鼠κ特异性反义引物(SEQ ID No.1)

5’-ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC-3’

b.鼠G2a特异性反义引物(SEQ ID No.2)

5’-CTG AGG GTG TAG AGG TCA GAC TG-3’

2.5’RACE PCR引物

a.鼠κ特异性反义引物(SEQ ID No.3)

5’-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC-3’

b.鼠G2a特异性反义引物(SEQ ID No.4)

5’-GAGTTCCAGGTCAAGGTCACTGGCTCAG-3’

得到的VH与Vκ PCR产物克隆到载体pCR4Blunt-TOPO(Zero blunt TOPO PCR克隆试剂盒，Invitrogen，ref.K2875-20)中，并测序。 鼠CAT-13.6E12抗体的Vκ区域的核苷酸序列如序列SEQ ID No.5所 示，而且推测的肽序列为序列SEQ ID No.6。Vκ基因属于Vκ4类[Kabat et al.(1991)″Sequences of Proteins of Immunological Interest″.NIH Publication 91-3242]。

CAT-13.6E12的VH区域的核苷酸序列为序列SEQ ID No.7，而 且推测的肽序列为序列SEQ ID No.8。VH基因属于VH1类[Kabat et al. (1991)″Sequences of Proteins of Immunological Interest″.NIH Publication 91-3242]。

B.构建用于嵌合抗体EMAB6与EMAB603的重链和轻链表达载体

1.轻链κ载体

1.1用于抗体EMAB6的轻链载体

使用下面的克隆引物，对克隆到pCR4Blunt-TOPO测序载体中的 Vκ序列进行扩增：

a)Vκ有义引物(SEQ ID No.9)

5’CTCAGTACTAGTGCCGCCACCA TGGATTTTCAAGTGCAG ATTTTCAG-3’

下划线的序列对应于SpeI限制性位点，以粗体书写的序列对应于 Kozak共有序列，ATG起始密码子以斜体表示。

b)Vκ反义引物(SEQ ID No.10)

5’TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCGGTTTATTTCCA GCCTGGT-3’

该引物连接鼠Vκ序列(斜体)与人恒定区(Cκ)(粗体)。下划线 的序列对应于DraIII限制性位点。

得到的Vκ PCR产物包含编码CAT-13.6E12鼠抗体的天然信号肽 的序列。该Vκ PCR产物然后克隆到位于人恒定区Cκ5’端的对应于序 列SEQ ID No.11的轻链嵌合载体的SpeI与DraIII位点之间(图1)， 该PCR产物的核酸序列是序列SEQ ID No.21，其推测的肽序列是序列 SEQ ID No.22。已经通过沉默诱变预先对该嵌合化载体的人Cκ序列进 行了修饰，以产生DraIII限制性位点允许克隆鼠Vκ序列。该嵌合载 体包含RSV启动子和bGH(小牛生长激素)聚腺苷酸化序列以及dhfr (二氢叶酸还原酶)选择基因。

由该载体编码的嵌合EMAB6抗体的轻链序列的核苷酸序列如 SEQ ID No.13所示，对应的推测的肽序列为SEQ ID No.14。

1.2抗体EMAB603的轻链载体

规程与用于EMAB6抗体的轻链载体的相同(参见实施例1， B-1.1)，除了Vκ反义引物以外，其为：

b′)Vκ反义引物(SEQ ID No.29)

5’-TGAAGACACTTGGTGCAGCCACAGTCCGTTTATTTCCA GCCTGGT-3’

该引物连接鼠Vκ序列(斜体)与人恒定区(Cκ)(粗体)。下 划线的序列对应于DraIII限制性位点。

该引物还引入了突变AAC-＞AAA(在反义引物序列 SEQ ID No.29中加框的核苷酸)，相对于CAT-13.6E12的天然Vκ序 列(参见SEQ ID No.5与SEQ ID No.6)，其对应于突变N106K(参见 核苷酸序列与推测的肽序列SEQ ID No.25和SEQ ID No.26)。

该载体编码的嵌合EMAB603抗体的轻链序列的核苷酸序列如 SEQ ID No.27所示，其对应的推测的肽序列为SEQ ID No.28。

2.重链

类似的方法用于EMAB6与EMAB603抗体的重链的嵌合化。

首先使用下面的克隆引物，对克隆到pCR4Blunt-TOPO载体中的 VH序列进行扩增：

a)VH有义引物(SEQ ID No.15)

5’-CTCAGTACTAGTGCCGCCACCATGGGATTCAGCAGGATC TTTCTC-3’

下划线的序列对应于限制性位点SpeI，以粗体书写的序列对应于 Kozak共有序列，ATG起始密码子为斜体。

b)VH反义引物(SEQ ID No.16)

5’-GACCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGA CTGAGGTTCC-3’

该引物连接鼠VH序列(斜体)与人G1恒定区(粗体)。下划线 的序列对应于ApaI限制性位点。

扩增的VH片段包含编码CAT-13.6E12鼠抗体的天然信号肽的序 列。该VH PCR产物然后克隆到位于γ1人恒定区的5’端的对应于序列 SEQ ID No.17的重链嵌合化载体的SpeI与ApaI位点之间(图3)， 该PCR产物的核酸序列是序列SEQ ID No.23，而且其推测的肽序列是 序列SEQ ID No.24。该嵌合化载体含有RSV启动子和bGH(小牛生 长激素)聚腺苷酸化序列以及neo选择基因。

该载体编码的嵌合EMAB6与EMAB603抗体的重链序列的核苷 酸序列如SEQ ID No.19所示，其推测的肽序列如SEQ ID No.20所示。

3.最终的表达载体

3.1.EMAB6抗体表达载体

为了表达EMAB6抗体，用人EF-1α启动子置换κ轻链嵌合载体 的RSV启动子(参见实施例1，B-1.1)。最终的轻链表达载体 pEF-EMAB6-K如图2所示，并对应于序列SEQ ID No.12。

该载体编码的嵌合EMAB6抗体的轻链序列的核苷酸序列如 SEQ ID No.13所示，其对应的推测肽序列为SEQ ID No.14。

为了表达EMAB6抗体，用人EF-1α启动子置换重链嵌合化载体 的RSV启动子(参见实施例1，B-2)。这样获得的最终重链 pEF-EMAB6-H表达载体如图4所示，而且对应于序列SEQ ID No.18。

3.2EMAB603抗体表达载体

通过把含有轻链转录单元和dhfr基因的轻链载体的BglII-PvuII片 段，亚克隆到重链载体的XhoI位点，从两个轻链与重链嵌合化载体， 构建含有抗-CD20 EMAB603抗体的重链和轻链转录单元的独特表达载 体(参见实施例1，分别为B-1.2与B2)。该pRSV-HL-EMAB603表 达载体包括两个选择基因，也即neo(neo-磷酸转移酶II)和dhfr(二氢 叶酸还原酶)，以及在RSV启动子调控下的两个重链和轻链转录单元 (图12)。

实施例2：产生衍生自YB2/0系的能产生抗-CD20嵌合EMAB6与EMAB603抗体的细胞系

在含有5％胎牛血清(JRH Biosciences，ref.12107)的EMS培养基 (Invitrogen，ref.041-95181M)中培养大鼠YB2/0细胞系 (ATCC#CRL-1662)。为了进行转染，5百万个细胞在Optimix培养基 (Equibio，ref.EKITE 1)中，用使用AatII线性化的25μg轻链载体 pEF-EMAB6-K(图2)，和用使用ScaI线性化的27μg重链载体 pEF-EMAB6-H(图4)进行电穿孔(Biorad electroporator，model 1652077)，以表达EMAB6抗体，或用载体pRSV-HL-EMAB603，以表 达EMAB603抗体。应用的电穿孔条件是0.5mL小玻璃管中230伏特 和960微法拉。每个电穿孔的小玻璃管然后以5,000细胞/孔的密度分 散到5个P96孔板中。

转染3天以后，置于含有5％透析血清(Invitrogen，ref.10603-017)， 500μg/mL G418(Invitrogen，ref.10131-027)和25nM氨甲蝶呤(Sigma， ref.M8407)的选择RPMI培养基中。

使用对人Ig序列特异性的ELISA分析，对来自抗性转染孔的上清 液，筛选嵌合免疫球蛋白(Ig)的存在。

产生最大量抗体的10个转染子在P24平板上进行扩增，而且它们 的上清液使用ELISA再进行分析，以评估它们的生产力，并通过有限 稀释(40细胞/孔)筛选3个最好的生产者进行克隆。

克隆以后，选择R509.6A4克隆(R509-33903/046-6H1(1)6A4，生 产力：17μg/10⁶细胞)，此后称为“R509”，以及R603克隆，用于分 别生产嵌合EMAB6与EMAB603抗体，并逐渐适应CD杂交瘤生产培 养基(Invitrogen，ref.11279-023)。

通过在CD杂交瘤培养基中扩大，以及通过稀释到75-cm²和 175-cm²小瓶中3x10⁵细胞，然后稀释到滚瓶中4.5x10⁵细胞/mL，进 行的适应性培养，来生产嵌合EMAB6和EMAB603抗体。一旦获得 了最大体积(1L)，继续进行培养直到细胞成活力仅仅为20％。产生 以后，使用蛋白质-A亲和色谱法对嵌合EMAB6和EMAB603抗体进 行纯化(HPLC评估的纯度＜95％)，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 检验。

实施例3：嵌合抗体EMAB6与EMAB603的功能活性特征

A.特异性

通过研究与鼠抗体CAT-13.6E12(CAT13)竞争结合Raji细胞表达 的CD20抗原，来评估嵌合EMAB6抗体的抗原识别特异性。

为了该目的，在存在Raji细胞时(50μL 4x10⁶细胞/mL)， EMAB6抗体(10μL 0.5到50μg/mL)与固定量的CAT-13.6E12鼠抗 体(10μL 5μg/mL)，一起于4℃孵育20分钟。洗涤以后，与藻红蛋白 (PE)偶联的鼠抗-IgG抗体添加到Raji细胞中，以便特异性地检测 CAT-13.6E12鼠抗体的结合。在存在各种浓度的EMAB6时，获得的中 值荧光强度(MFI)被转换成百分数，而且100％对应于缺乏EMAB6 抗体时，与CAT-13.6E12细胞的结合。

因此获得了在存在增加浓度的EMAB6时，CAT-13.6E12(CAT13) 抗体与Raji细胞的结合的抑制曲线(图5)。

该研究证明，嵌合过程没有负面地影响EMAB6抗体的特异性， 其与亲本CAT-13.6E12鼠抗体竞争结合在Raji细胞表面表达的CD20。

EMAB603抗体的抗原识别特异性与EMAB6抗体的相当。

B.补体依赖的细胞毒性

在存在幼兔血清作为补体来源时，用Raji细胞检测EMAB6与 EMAB603抗体的补体依赖的细胞毒性；抗-CD20嵌合抗体Rituxan^包 括在一个检测中，用作比较。

为了该检测，把Raji细胞调整到在含有5％FCS(胎牛血清)的 IMDM(Iscove′s改良的Dulbecco′s培养基)中6x10⁵细胞/mL。抗体用 IMDM+0.5％FCS进行稀释。反应混合物由50μL抗体，50μL幼兔血 清(Cedarlane CL 3441试剂的1/10 IMDM+0.5％FCS稀释物)，50μL 靶细胞以及50μL IMDM+0.5％FCS培养基组成。最终抗体浓度是5,000， 1,250,250和50ng/mL。该检测中包括一个没有抗体的对照。5％CO₂气氛中37℃孵育1小时之后，对平板进行离心，释放到上清液中的细 胞内LDH的水平使用特定试剂(细胞毒性检测试剂盒1644793)进行评 估。

用使用triton X100(2％)裂解的各种稀释度的靶细胞，其分别对应 于100，50，25和0％裂解，获得的标度范围，来评估裂解百分数。 结果如图6(A)所示，其证明，EMAB6与Rituxan^都诱导Raji 细胞的补体依赖的裂解。不过，EMAB6的补体活性显示稍低于 Rituxan^。这种差异在该检测中使用较低浓度抗体时更大。因此对于 50与250ng/mL的浓度，EMAB6的活性是Rituxan^的活性的45％。 这种差异随着抗体浓度的增加而变小，而且EMAB6抗体的补体依赖的 细胞毒性％表示以最高浓度也即5,000ng/mL检测的Rituxan^补体依 赖活性的92％。

与Rituxan^相比，EMAB6抗体的较低补体依赖的细胞毒性认为 是一个优点，因为相较于Rituxan^，它限制了EMAB6潜在的体内毒 性，该毒性与传统的补体途径的激活相关，其导致产生各种具有不合 需要的炎性、过敏和血管活性的分子。

EMAB603抗体的补体活性如图6(B)所示。

C.ADCC

在存在Raji细胞或来自患有CLL的患者的B淋巴细胞时，对嵌合 EMAB6抗体的细胞毒性进行评估。抗-CD20嵌合抗体包括在Rituxan^检测中用作比较。

使用的钙黄绿素标记的ADCC测定技术如下：

使用来自Myltenyi的在磁珠上分离的技术(MACS)，从PBMC分 离NK细胞。洗涤细胞，并在IMDM+5％FCS(45x10⁵细胞/mL)中重悬。 效应细胞与靶细胞以15/1的比例使用。Ficoll处理之后获得的来自患有 B-CLL的患者的Raji细胞或PBMC(外周血单核细胞)(＞95％B细胞)， 事先用钙黄绿素进行标记(IMDM+5％FCS中3x10⁶细胞/mL的1mL 细胞+20μL钙黄绿素(20μM)中，以，37℃孵育20分钟，然后用HBSS (Hank′s缓冲的盐溶液)进行洗涤)，并在IMDM+5％FCS中调整到 3x10⁵细胞/mL。抗体用IMDM+0.5％FCS进行稀释(终浓度：500；50；5； 0.5；0.005和0.005ng/mL)。

反应混合物由P96微滴定板中的50μL抗体，50μL效应细胞， 50μL靶细胞和50μL IMDM培养基组成。使用两个阴性对照：

-不含NK的裂解：NK效应细胞用IMDM+5％FCS置换。

-不含抗体(Ab)的裂解：抗体用IMDM+5％FCS置换。

在5％CO₂氛围中37℃孵育4小时之后，离心平板，并使用荧光 计测定与上清液相关的荧光(激发光：485nm，发射光：535nm)。

用使用Triton X100(2％)裂解的各种稀释度的靶细胞，其分别对应 于100，50，25和0％裂解，获得的标度范围，来评估裂解百分数。

结果首先使用下面的公式进行计算：

裂解％＝(含抗体和NK的裂解％)-(不含抗体的裂解％)- (不含NK的裂解％)

然后表示为相对百分数，而且以最高浓度的Rituxan^获得的值为 100％。

EMAB6抗体在Raji细胞系中获得的结果如图7(A)所示，其证 实不考虑检测的浓度，EMAB6抗体诱导的细胞毒性高于Rituxan^诱导 的细胞毒性。这种差异在低抗体浓度时尤其大。因此，0.5ng/mL时， EMAB6与Rituxan^的裂解百分数分别为96％与4％。增加剂量500 倍(250ng/mL)，这种差异仍然是显著的，因为EMAB6与Rituxan^的ADCC相对百分数分别为164％与100％。当通过绘图评估计算 EC50(抗体浓度对应于50％的E Max，在最高的抗体浓度和平台处获 得的最大效力)(以ng/mL)，并假定Rituxan^和EMAB6达到相同的E Max时，则该检测中Rituxan^EC50/EMAB6 EC50比率等于300。

在存在Raji细胞时，使用与EMAB6抗体相同的方法，评估嵌合 EMAB603抗体的细胞毒性。它的活性与EMAB6抗体相当(参见图 7(B))。

利用来自患有B-CLL的患者的淋巴细胞，获得的结果，如图8所 示，证实，与检测的浓度无关，EMAB6抗体诱导的细胞毒性高于 Rituxan^诱导的细胞毒性。如同用Raji细胞已经观察到的，这种差异 在低抗体浓度时尤其大。浓度为0.5ng/mL的EMAB6诱导的裂解百分 数与500ng/mL Rituxan^诱导的裂解百分数相同，也即1,000的浓度比 率。5ng/mL时，EMAB6与Rituxan^的裂解百分数分别为269％与 9％。以最大的检测剂量(500ng/mL)时，差异仍然非常大，因为EMAB6 与Rituxan^的ADCC相对百分数分别为350％与100％。一个有趣的 结果相应于引起50％裂解的浓度。在该检测中，Rituxan^EC50/EMAB6 EC50比率估计为10,000(以ng/mL绘图估计EC50，假定Rituxan^与 EMAB6达到相同的E Max)。

在这些检测中，EMAB6与EMAB603的细胞毒性因此比 Rituxan^的细胞毒性高得多。

D.CD16的激活(IL-2分泌)

在存在Raji细胞或来自患有CLL的患者的B淋巴细胞时，测定嵌 合EMAB6抗体诱导的CD16(FcγRIIIA)的激活。该检测评估了抗体结 合在Jurkat-CD16细胞上表达的CD16(FcγRIIIA)受体，以及诱导IL-2 分泌的能力。抗-CD20嵌合抗体Rituxan^包括在该检测中用作比较。

在存在Raji细胞或来自患有CLL的患者的B淋巴细胞时，对 Jurkat-CD16细胞系以下面的方式测定CD16激活。

在96孔板中混合：50μL抗体溶液(来自患有B-CLL的患者的B 淋巴细胞用IMDM+5％FCS稀释到10,000，1,000，100和10ng/mL， Raji细胞稀释到10,000，2,000，1,000，200，100，50和25ng/mL)，50μL PMA(乙酸肉豆蔻佛波醇酯，用IMDM+5％FCS稀释到40ng/mL)， 50μL Raji或Ficoll处理后获得的来自患有B-CLL的患者的PBMC (＞95％B细胞)，用IMDM+5％FCS稀释到6x10⁵/mL，以及50μL Jurkat-CD16细胞(20x10⁶/mL于IMDM+5％FCS)。所有检测中都包 括不含抗体的对照。37℃孵育过夜之后，离心平板，并使用商业试剂 盒(来自R/D的Quantikine)，评估上清液中所含的IL-2。在450nm处 进行OD读数。

结果最初表示为IL-2水平，作为抗体浓度(从0到250ng/mL终 浓度)的函数，然后表示为相对百分数，其中100％是用Rituxan^以最 高检测浓度获得的值。

用Raji细胞系获得结果如图9(A)所示，其证实，在存在EMAB6 和Rituxan^时，Jurkat-CD16细胞分泌IL-2，其指示通过抗体的Fc部 分结合到CD16而激活细胞。不过，EMAB6抗体具有比Rituxan^抗体 强得多的诱导活性。因此，6.25ng/mL时，EMAB6与Rituxan^的IL-2 百分数分别为112％与21％。50ng/mL时，差异仍然大，IL-2百分数 分别为112％与65％。随着浓度增加这种差异降低，2,500ng/mL时 EMAB6与Rituxan^各自的IL-2相对百分数为124％与100％。在该检 测中，Rituxan^EC50/EMAB6 EC50比率估计为15(以ng/mL绘图估 计EC50，假定Rituxan^和EMAB6达到相同的E Max)。

这些结果确认了ADCC结果，都是CD-16依赖的。它们证实了， EMAB6抗体的Fc部分结合CD16之后是强的细胞激活，其导致诱导 效应器功能。

在存在Raji细胞时，嵌合EMAB603抗体诱导的CD16(FcγRIIIA) 的激活，与EMAB6抗体诱导的CD16(FcγRIIIA)的激活相当。

利用来自患有B-CLL的患者的淋巴细胞，获得的结果如图10所 示，其证实，在存在抗-CD20 Rituxan^与EMAB6时，Jurkat-CD16细 胞分泌IL-2，其指示通过抗体的Fc部分结合CD16进行细胞激活。不 过，EMAB6抗体具有比Rituxan^抗体高得多的诱导活性。事实上， Rituxan^的IL-2诱导分泌活性接近于浓度为2.5和25ng/mL时的基 线，然而EMAB6抗体的IL-2诱导分泌活性是显著的。因此，25ng/mL 时，EMAB6与Rituxan^的IL-2百分数分别为132％与34％。以最高 的浓度(2,500ng/mL)时，IL-2百分数分别为148％与100％。该检测中 Rituxan^EC50/EMAB6 EC50比率大于100：估计为300(以ng/mL绘图 估计EC50，假定Rituxan^和EMAB6达到相同的E Max)。

总之，对Raji细胞进行的所有检测证实，EMAB6与EMAB603抗 体，不像Rituxan^，是高细胞毒性的，而且诱导表达CD16(FcγRIIIA) 的细胞激活，尤其是在低抗体浓度时。相反地，相同条件下，相比于 Rituxan^，EMAB6的补体依赖细胞毒性降低大约50％。

使用分离自患有B-CLL的患者的细胞进行的研究证实了这些结 果，其表明对来自患有B-CLL的患者的B淋巴细胞，EMAB6抗体比 Rituxan^的细胞毒性大得多。利用来自患有B-CLL的患者的淋巴细胞 比利用Raji细胞，两种抗体之间的差异更显著，其证实相较于 Rituxan^，EMAB6对这种疾病有显著的治疗益处。

这种增加的差异的原因可能是，其中，相较于Raji细胞，在来自 患有B-CLL的患者的B淋巴细胞上CD20的抗原表达较低。

根据Raji细胞类推，可以表明EMAB6抗体对来自患有B-CLL的 患者的淋巴细胞的补体依赖的细胞毒性，一定低于Rituxan^诱导的补 体依赖的细胞毒性，从而显示体内较低毒性的优点，该毒性是作为与 传统补体途径的强激活相关的不合需要的作用的结果。

实施例4：通过HPCE-LIF进行EMAB6与EMAB603聚糖的分析

EMAB6与EMAB603抗体的重链的N-聚糖结构使用HPCE-LIF进 行分析。也分析Rituxan^的重链的N-聚糖结构用作比较。

为了该目的，抗-CD20单克隆抗体在Sephadex G-25柱(HiTrap Desalting，Amersham Biosciences)上脱盐，蒸发，并在存在50mMβ-巯 基乙醇时，在PNGase F(G1yko)的水解缓冲液中重悬。37℃孵育16小 时后，通过添加绝对乙醇来沉淀蛋白质级分，而且含有N-聚糖的上清 液被蒸发。得到的低聚糖使用荧光染料：APTS(1-氨基-pyrene-3，6，8-三 磺酸盐)直接标记，或者用APTS标记之前，经受特异性外切糖苷酶的 作用。得到的标记的低聚糖注入到N-CHO毛细管中，分离，并使用激 光诱导的荧光测定(HPCE-LIF)，通过毛细管电泳进行定量。

通过添加分离的岩藻糖基化形式，或更具体地在神经氨酸酶，β- 半乳糖苷酶和N-乙酰氨基己糖苷酶同时作用之后，测定岩藻糖水平， 其导致在电泳图上获得对应于岩藻糖基化或非岩藻糖基化的戊糖类 [GlcNac2-Man3]的2个峰：

    表1     抗-CD20 EMAB603与Rituxan^N-聚糖的分析     抗-CD20     ％岩藻糖     ％半乳糖  岩藻糖/半乳糖     EMAB603     15     37  0.4     Rituxan^    93     57  1.63

岩藻糖水平，表示为％，使用下面的公式进行计算：

半乳糖水平，表示为％，通过添加低聚糖形式的百分数进行计算， 其含有神经氨酸苷酶与岩藻糖苷酶作用之后获得的半乳糖。使用的公 式如下所示：

半乳糖水平＝(G1+G1B)+2x(G2+G2B)

把岩藻糖水平除以半乳糖水平，如上计算获得岩藻糖/半乳糖比 率。

从该分析(参见表1)，显示与Rituxan^(岩藻糖％＝93％)相比， EMAB6和EMAB603抗体较少岩藻糖基化(岩藻糖％＜25％)。而且， EMAB6和EMAB603的Fuc/Gal比率(岩藻糖/半乳糖比率)较低(Fuc/Gal 比率＜0.6)，不像在CHO细胞中表达的抗体如Rituxan^(Fuc/Gal比率 ＝1.63)。

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