具荧光素酶活性抗辐射菌的制备方法

摘要

具荧光素酶活性抗辐射菌的制备方法。以抗辐射菌Deinococcus radiopugnans由来的质粒为基础，与大肠杆菌中能自我复制的质粒进行重组而成穿梭载体。载体与具有北美产萤火虫(Photinus pyralis)的寄主DNA由来的荧光素酶基因lux领域的DNA片段重组成具有荧光素酶基因的质粒，将该质粒导入抗辐射菌属细菌，用构建的质粒转化Deinococcus grandis，得到氯霉素抗性的菌株。使用本发明制备的抗辐射菌可使用在野外开放封闭环境的各种领域，载体具有荧光素酶基因，在实时监控重组转化子的生育、分布及对环境的影响等方面有较好的使用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基因载体及其转化子的制备方法，即一种具荧光素酶活性的抗辐射菌的制备方法。

背景技术

不同的生物对放射线的抵抗性不同，自然界中存在对放射线抵抗性很强的微生物，这类微生物通常称为放射线抵抗性细菌，又称抗辐射菌或抗辐射奇球菌等，本文以下称抗辐射菌。代表性的抗辐射菌为Deinococcus属，现在已经鉴定的有7类菌种(D.radiodurans；D.radiopugnans；D.radiophilus；D.grandis；D.proteolyticus；D.geothermalis；D.murrayi)(Ferreira et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.，47：939-947，1997)。这些细菌对放射线的抵抗性约为大肠杆菌的100倍，人细胞的1000倍以上。利用基因工程的方法将外源基因导入该细菌，能够改变抗辐射菌的性状，能够从被放射性物质污染的废弃物中除去难分解的物质和有毒物质，及利用该改造菌进行放射性重金属的收集等。

迄今为止，将外源基因导入抗辐射菌Deinococcus属，诱导表达异种蛋白质的有：1、表达甲苯双加氧酶，将难分解的甲苯变成容易分解的物质(Lange et al.，Nature Biotechnol.，16：929-933，1998)，2、表达2价水银离子还原酶，将2价水银离子还原为毒性很低的挥发性金属水银(Brim et al.，Nature Biotechnol.，18：85-90，2000)。但到目前为止，将包含外源基因的质粒载体进行抗辐射菌Deinococcus radiodurans以外的Deinococcus属细菌(如上述的D.radiopugnans；D.grandis等)的转化的研究还没有。另外，上述重组转化子的制作存在一些弊端：使用了在Deinococcus属细菌中不能自我复制的整合质粒，不能控制拷贝数，表达的蛋白质数量少，培养液中需要添加抗生素等。为了克服这些缺点，已有抗辐射菌Deinococcus radiodurans-大肠杆菌穿梭载体pRAD1(用D.radiodurans Sark株由来的质粒pUE10的复制子和大肠杆菌载体pMTL23开发而成)(Meima&Lidstrom，Appl.Environ.Microbiol.，66：3856-3867，2000)，但没有发现用pRAD1进行抗辐射菌Deinococcus radiodurans以外的Deinococcus属细菌的重组转化的研究报告；同时pRAD1在含有抗生物质氯霉素的选择性培养基中能稳定复制，在不含氯霉素的非选择性培养基中不能稳定存在，这个缺点在将导入外源基因的抗辐射菌释放到野外开放环境时特别成为问题：在放射性物质污染的土壤及废水等环境中保持一定浓度的抗生物质是非常困难的，而且野外投放抗生物质不但极有可能出现没有必要的抗生物质的耐性细菌，同时引起环境的二次污染；其次，虽然作为野外开放环境的代替，可以用大规模的封闭环境来处理污染物质，但大量的抗生物质使用不可避免污染环境。另外，将导入外源基因的抗辐射菌释放到野外的时候，有必要随时监控投放野外以后的生育、分布及对环境的影响等状况，所以希望开发一种简便的、可实时监控重组转化子的方法。

发明内容

本发明的目的是：提供有关抗辐射菌Deinococcus radiopugnans ATCC19172由来的潜在性质粒pUE30、在抗辐射菌属及大肠杆菌细胞内能够复制的穿梭载体，及将这些穿梭载体导入到抗辐射菌属细菌，通过制备荧光素酶活性的转化子，制备一种具荧光素酶活性抗辐射菌的制备方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

以抗辐射菌Deinococcus radiopugnans由来的质粒为基础，与大肠杆菌中能自我复制的质粒进行重组，制作穿梭载体。其次，将上述穿梭载体与具有北美产萤火虫(Photinuspyralis)的寄主DNA由来的荧光素酶基因lux领域的DNA片段重组，成功构建具有荧光素酶基因的质粒。再将该质粒导入抗辐射菌Deinococcus属细菌，得到具有高荧光素酶活性的抗辐射菌，从而成功构建了本发明。

以抗辐射菌Deinococcus radiopugnans由来的质粒，包含SEQ ID NO：1所表示的碱基序列或其诱导体为基础，与大肠杆菌中能自我复制的质粒进行重组而成的穿梭载体，以及穿梭载体的转化子。

所述穿梭载体以及穿梭载体的转化子与具有北美产萤火虫(Photinus pyralis)的寄主DNA由来的荧光素酶基因lux领域的DNA片段重组成具有荧光素酶基因的质粒，将该质粒导入抗辐射菌Deinococcus属细菌，获得的荧光素酶活性抗辐射菌。

具体制备方法为以下步骤：

(1)质粒的分离精制

将抗辐射菌Deinococcus radiopugnans ATCC19172用含0.5％胰蛋白胨、0.1％葡萄糖、0.3％酵母提取物的TGY培养基进行培养，离心分离收集菌体，用QIAfilter Plasmid kit提取质粒成分，琼脂糖凝胶电泳进行分离精制，将2.45 kb的质粒作为pUE30；

(2)碱基序列的测定

制作pUE30的酶切图谱，获取HincII及Aor51HI的酶切位点，用HincII消化pUE30的2.5kb断片，或用Aor51HI消化2.5kb的断片与大肠杆菌载体质粒pGBM5的多克隆部位连接制成质粒，然后用Kilo-sequence Deletion kit制作上述质粒的嵌套缺失的克隆，再用这些嵌套缺失的克隆作为模板，用市场上的通用引物，采用荧光标记链终止循环测序法测定pUE30的DNA序列，电泳反应用DNA Sequencer ABI PRISM 377进行。测定得到如SEQ ID NO：1所示碱基序列；

(3)穿梭载体的构建

以pUE30为模板，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示的碱基序列(根据上述pUE30的碱基序列自行设计)合成的DNA为引物，用AmpliTaq Gold DNA polymerase进行PCR反应，得到两端设计有限制性内切酶SphI部位、包含pUE30的全碱基序列的PCR产物，用SphI消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆菌中有活性的Amp抗性基因、抗辐射菌Deinococcus radiodurans中有活性的氯霉素抗性基因的质粒pKatCAT，再与上述PCR产物的SphI消化物混合，用DNA连接酶连接，采用电穿孔法将上述连接物转化大肠杆菌JM109株，从抗Amp的转化株中选择具有pUE30和pKatCAT连接的质粒的株，获穿梭载体质粒。

(4)以抗辐射菌Deinococcus radioduransATCC13939的基因组DNA为模板，SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7所示的碱基序列合成的DNA为引物，用Pfu Turbo DNA polymerase进行PCR反应，增幅在抗辐射菌Deinococcus radiodurans中具有活性的已知的groEL启动子领域，然后用NcoI内切酶消化含有荧光素酶基因的质粒pSP-lux+，用T4 DNA polymerase进行DNA断片末端的平滑化，将本步骤所述的PCR反应产物与平滑化的pSP-lux+连接，得到pGroE-lux+2及pGroE-lux+4两种质粒；

(5)用HindIII消化上述两种质粒，进行切断末端的平滑化处理，再用EcoRV消化，得到含有groEL启动子和荧光素酶基因的DNA断片，将这一DNA断片插入步骤3所获穿梭载体质粒的EcoRV部位，构建具有荧光素酶基因的质粒，用构建的荧光素酶基因质粒转化Deinococcus grandis，得到具有荧光素酶基因以及氯霉素抗性的菌株。

发明的优点：

本发明除能解决前述穿梭载体的各种问题。如：已有的穿梭载体pRAD1不能在抗辐射菌Deinococcus radiodurans以外的Deinococcus属细菌内重组转化，而本发明的载体能提供在抗辐射菌Deinococcus属细菌中进行基因重组操作技术时有用的质粒，在抗辐射菌属及大肠杆菌细胞内能自我复制；其次，pRAD1在含有抗生物质氯霉素的选择性培养基中能稳定复制，在不含氯霉素的非选择性培养基中不能稳定存在，而本载体在没有抗生物质的非选择性培养基条件下，能在抗辐射菌Deinococcus属细菌中稳定存在。同时，本发明的载体中插入有荧光素酶基因lux领域的DNA片段，在抗辐射菌中具有高荧光素酶活性，可实时监控重组转化子。

发明的应用前景：

本发明的穿梭载体在抗辐射菌属细菌及大肠杆菌细胞内能够自我复制，可利用于载体DNA的基因重组及将外源基因导入到抗辐射菌属细菌中。特别在抗辐射菌中进行DNA损伤修复基因的克隆及表达方面有非常广泛的应用前景。其次可利用在从包含放射性物质污染的废弃物中除去难分解的物质和有毒物质、及进行放性线重金属的收集技术上。本发明的穿梭载体因为在非选择性培养基条件下能在寄主内稳定保持，所以可以使用在无论是野外开放环境或封闭环境的上述各种应用领域。另外，本发明的穿梭载体具有荧光素酶基因，在实时监控重组转化子的生育、分布及对环境的影响等方面也非常有用。

附图说明

图1是本发明的穿梭载体pZT15的限制性内切酶的酶切图。

图2是本发明的穿梭载体pZT17的限制性内切酶的酶切图。

图3是抗辐射菌Deinococcus radiopugnans ATCC43672株中本发明的穿梭载体的稳定性调查结果。○为用pZT15进行转化的转化株；●为用pZT17进行转化的转化株；▲为用pRAD1进行转化的转化株。纵坐标表示全细菌中具有氯霉素抗性基因的细菌的比率，横坐标表示繁殖世代。

图4是本发明中包含荧光素酶基因的穿梭载体pZTGL2及pZTGL4构建方法的略图。

图5是用本发明pZTGL2及pZTGL4转化到Deinococcus radiopugnans ATCC43672株中的荧光素酶活性的测定结果。荧光素酶活性单位用10⁶个菌中1秒的发光量RLU(RelativeLight Unit)表示。

具体实施方式

以下根据实施例详细介绍本发明，本发明没有限定这些实施例。

实施例1：质粒的调制

(1)质粒的分离精制

抗辐射菌Deinococcus radiopugnans ATCC19172用TGY培养基(含0.5％胰蛋白胨、0.1％葡萄糖、0.3％酵母提取物)进行培养，离心分离收集菌体。用QIAfilter Plasmid kit(德国QIAGEN)提取质粒成分，用琼脂糖凝胶电泳进行分离精制，结果发现了约2.45 kb的质粒。Mackay等(Arch.Microbiol.，141：91-94，1985)用电子显微镜观察抗辐射菌Deinococcusradiopugnans，报道了存在大小约2.5 kb的质粒pUE30。因此，这次分离精制的2.45 kb的质粒作为pUE30。

(2)碱基序列的测定

制作上述精制的pUE30的酶切图谱，发现在pUE30中各存在一个HincII及Aor51HI的酶切位点。接下去将用HincII(New England Biolabs，Inc.)消化pUE30的2.5kb的断片，或用Aor51HI(Takara Shuzo公司生产)消化的2.5kb的断片与大肠杆菌载体质粒pGBM5的多克隆部位连接制作质粒，然后用Kilo-sequence Deletion kit(Takara Shuzo公司)制作上述质粒的嵌套缺失的克隆，再用这些嵌套缺失的克隆作为模板，用市场上的通用引物，采用荧光标记链终止循环测序法(BioDye Terminator cycle Sequencing kit，AppliedBiosystems公司)测定pUE30的DNA序列，电泳反应用DNA Sequencer ABI PRISM 377(AppliedBiosystems公司)进行。测定得到的碱基序列如序列表SEQ ID N0：1所示。

实施例2：穿梭载体pZT15、pZT17的构建

(1)pZT15的构建

以pUE30为模板，SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所示的碱基序列(根据上述pUE30的碱基序列自行设计)合成的DNA为引物，用AmpliTaq Gold DNA polymerase(AppliedBiosystems)进行PCR反应，得到两端设计有限制性内切酶SphI部位、包含pUE30的全碱基序列的PCR产物。接着，用SphI消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆菌中有活性的Amp抗性基因、抗辐射菌Deinococcus_radiodurans中有活性的氯霉素抗性基因的质粒pKatCAT(Funayama等，Mutat.Res.，435：151-161，1999)，再与上述PCR产物的SphI消化物混合，用DNA连接酶连接。采用电穿孔法将上述连接物转化大肠杆菌JM109株。从抗Amp的转化株中选择具有pUE30和pKatCAT连接的质粒(大小约为6.1 kb)的株，将该质粒命名为穿梭载体pZT15，pZT15的构造如图1。

(2)pZT17的构建

以pUE30为模板，SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5所示的碱基序列合成的DNA为引物，用与(1)同样的方法进行PCR反应，得到包含部分pUE30的碱基序列(约2.3kb)，同时两端设计有限制性内切酶SphI部位的PCR产物。接着，与(1)同样，和质粒pKatCAT连接，再转化大肠杆菌JM109株。从抗Amp的转化株中选择具有pUE30的一部分和pKatCAT连接的质粒(大小约为5.8kb)的株，将该质粒命名为穿梭载体pZT17，pZT17的构造如图2。

实施例3：本发明穿梭载体pZT15及pZT17性质验证

(1)用穿梭载体进行抗辐射菌Deinococcus grandis ATCC43672株的重组转化

用上述穿梭载体pZT15或pZT17重组转化抗辐射菌Deinococcus grandis ATCC43672株，重组转化参考Kitayama等的方法(J.Bacteriol.，155：1200-1207，1983)，采用CaCl2法。无论用pZT15还是pZT17穿梭载体，都能得到含有氯霉素抗性基因的菌株。用QIAprepMiniprep Plasmid kit(Qiagen)从这些株中提取质粒成分，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，确认在重组转化株中保持有导入的质粒。

(2)穿梭载体在抗辐射菌Deinococcus grandis的稳定性验证

将包含穿梭载体pZT15或pZT17的抗辐射菌Deinococcus grandis在含有氯霉素的TGY培养基中培养24 Hr，将上述培养液稀释256倍后在没有含有氯霉素的TGY培养基中接种，30℃培养。经过8世代分裂后的培养液再稀释256倍，然而再在没有含有氯霉素的TGY培养基中接种，30℃培养。重复上述操作直到在非选择培养基中分裂40代为止。每分裂8世代后提取一部分培养液，分别在没有含有氯霉素的TGY平板培养基及含有氯霉素的TGY平板培养基上涂抹接种，测定培养液中氯霉素抗性细菌占全细菌数的比率；作为对照，用Meima&Lidstrom(Appl.Environ.Microbiol.，66：3856-3867，2000)记载的抗辐射菌Deinococcus-大肠杆菌穿梭载体pRAD1导入抗辐射菌Befnococcus grandis后得到的重组转化株中pRAD1的稳定性。其结果，pRAD1在非选择培养基中不能稳定存在，而pZT15及pZT17在非选择培养基条件下能够在Deinoooccus grandis中稳定存在(图3)。

实施例4：具有荧光素酶基因的穿梭载体的构建及性质测定

(1)pZTGL2及pZTGL4的构建

以抗辐射菌Deinococcus radiodurans ATCC13939的基因组DNA为模板，SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7所示的碱基序列(根据Meima等的论文自行设计，J.Bacteriol.183：3169-3175，2001)合成的DNA为引物，用Pfu Turbo DNA polymerase(Stratagene)进行PCR反应，增幅Meima等(J.Bacteriol.183：3169-3175，2001)记载的在抗辐射菌Deinococcus_radiodurans中具有活性的已知的groEL启动子领域(131 bp)。然而用NcoI内切酶消化含有荧光素酶基因的质粒pSP-lux+(Promega)，用T4 DNA polymerase(Takara)进行DNA断片末端的平滑化。最后，将上述的PCR产物与平滑化的pSP-lux+连接，得到pGroE-lux+2及pGroE-lux+4(4235 bp)。

用HindIII消化这些质粒，进行切断末端的平滑化处理后，再用EcoRV进行消化，得到含有groEL启动子和荧光素酶基因的DNA断片。接着将这个DNA断片插入穿梭载体pZT17的EcoRV部位，构建pZTGL2及pZTGL4(7618bp)。pZTGL2及pZTGL4的构建略图如图4。用构建的质粒转化Defnococcus grandis，得到氯霉素抗性的菌株。

(2)荧光素酶活性的测定

将上述得到的重组转化子在TGY培养基中30℃培养，24Hr后将培养液与等量的Bright-Glo Luciferase Assay Solution(Promega)混合，1分钟后用Lumi Imager F1(RocheMolecular Biochemicals)测定1分钟间的化学发光活性。测定结果如图5。由测定得知，含有groEL启动子和荧光素酶基因顺向连接的pZTGL2的重组转化子发现荧光素酶活性，而在含有groEL启动子和荧光素酶基因逆连接的pZTGL4的重组转化子中没有发现荧光素酶活性。

本发明所涉及的序列表：

SEQ ID NO：1

catatgaccq catgaggaca tctgttaata gcgtaaaaat ctctctgctc taatqacatt  60

tagggcagag aaactataga aaacttattc ggtttttctt gcagaagaga ttagaactag  120

tccgccgccc actatacata acagagctaa ggcgtttatt agaaagttgg gggacagaat  180

ttcgtaattg aaacttattt tactagtaat cagttctatt tttttattaa acagatttat  240

tctctcaact attataattc ctataccgaa gagtacgaag atggatgcca agagcatagt  300

cattactccc ttttgcattg tcgctccttt caaatcgtat gatacagtgt tctgacgcgg  360

gtaaaatttt ggtttcacca ctcacgcact tttggaggcc cgatcatgtc tgagggtgaa  420

caatatgaaa gggagtgacg tgctgctgtg cctgtcgctt gaggaacagc agcaggatga  480

aatccatgat cggctgacca gacgcggaca cctgtcggac tcgtcgtctt tgcgtaaggc  540

cctggatcgg ctcatcactg ctggattagt ggtcacgagg aggactgaga atcgggagcg  600

cttctactgg ttggcggagg gcgaggccgt cgaagtggcc ttaaatgaag catgggccaa  660

ggctgaggcg gagcgaaacc gggctaggta ggccaaatcc tgaccgtgcc aaagccccag  720

caaaaacagg aattgggtgc cgattttctg cgggtgctgg ggtgttacgc aagattagca  780

ctaaagtgca tcttgcctct gaaactgcgt tccagagggg aaaaaaccag ggtgctgtta  840

attttaatta ctggtcaact tttgggccgt ttttcgaggg gtcaatgcgc gagaaatggc  900

ccaaaaaatc agcagggagg gaggtgctgg acctgccgtt caccccaact ggcaacaccc  960

cgctgggagg cggggtgcta aggtaattct cgaagccagt caaaagtgtc tccaaacacc 1020

gttgattgag ccatcccact ccgaaggacc acttccgatg aacaatcaaa agcaggacag 1080

ctataccgat agggtacggc aaatcgcccc cgtagttcca ctcctggacc tcattgttaa 1140

gcccctcatc cctgaacgag cagcccctaa tccctatctg gagatgggcc tagccgccct 1200

gcgtggcgag ccggtggaca cccgccgcgc ccaggtgcag cccagcaagc agttccagaa 1260

ggccagccgc ccagccccag ccgccccccc ccttgtgctg acctcagacc agggcgagga 1320

ccaggaggcc gccatgctgc tgcccgagat cgtcgaagag acgcgccgcc gcctggagaa 1380

gcaggcccgc gagaaccgcg agacgcgccg cgccgaacag cgcgcccgct ttcaccagct 1440

cgtgaccgcc cccaccgacg aggccgcgcc ggacttcgtg ccgcctgtga gccttcagga 1500

aggccgtcag ccccccagcg gcagtgtgcg cgtcaccttg ccccgccctg aagtccctgg 1560

gcctgcctgg ggcgagctga gcgccgacgc ggtgcttgat tcggtgccgt ggctgagcaa 1620

gggcgcgcgg ctggtgttcc gcatcatgca catgctggct gtggcgaagg cccaggactg 1680

ccggtatccg gtgatcccca actcggcggc cttccacacg ccccaactgt tgctggcctt 1740

cgtggcgcgg tacaccaccc ggcacttccg gcgactgacc aatgagctgg agcacgctgg 1800

ggtgattgac ggcggcgcgc acgccgcgaa ggtcaagacc ggcatcggca ccacccggca 1860

cctgtgggac ggctcgatct gggcggtcaa gctacggccc agcacctgtg acgcctacct 1920

gtcccccgag gactggcagc acgagtggcg agacttccag gcggacttgg agtcgggcag 1980

gacggcgaaa aagctaatgt cctatctaaa cacctgtgag ggtttagcca ggcaggagca 2040

cgtcctgaaa acctgggccg ttaatcccaa tgcgaaaatg acttcgttgt gtttagagcg 2100

gacatttcag gccgagcaga aaatgaccct ccaggacacg gtttatgccc tgccgctgat 2160

cggggaactg agcgaactca agcaggccgg agccatcgga aacgcggcgt cgatcatctc 2220

gcacgccctg ggcgacagcc acagccgaag attctggtgt gggttgctgt gggcagccac 2280

ccggaacggc tctttagagg cgttctcggc ccagttgctg cggttgctgg cggatgtgca 2340

ggagtccagc gagctgagaa accccggcgc gctgttcgcg gcccgccttc gcagcgcctg 2400

accttcgggg accgcgcccg aagaccaggc gctgctcagt tgggcttgag ggtgattacg 2460

ttctgag

2467

SEQ ID NO：2

cgcggtacca tcttgcctct gaaactgcgt t                                31

SEQ ID NO：3

gcgggtaccg cactttagtg ctaatcttgc g                                31

SEQ ID NO：4

gaaaccgggc taggtacccc aaatcctgac                                  30

SEQ ID NO：5

Ggtggtaccc tcagacatga tcgggcctc    29

SEQ ID NO：6

ttgtcagctt cggtcagttg acat         24

SEQ ID NO：7

tggggtcctc ctgtgagtga              20