人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗

摘要

本发明涉及一种人乳头瘤病毒的病毒样颗粒疫苗，属于生物技术领域。每毫升疫苗中各组份的含量分别为：HPV6L1VLPs：10～60μg、HPV16L1VLPs：5～40μg和HPV58L1VLPs10～60μg。本发明具有如下优点：分别分泌表达HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1蛋白，所得各种L1蛋白可自组装成VLPs。根据在亚洲和中国部分地区进行的人乳头瘤病毒感染流行病学调查结果，应用HPV6、HPV16和HPV58等型别的L1蛋白形成的VLPs制备的疫苗能预防60％HPV引起的感染。附加的HPV型别可以进一步提高疫苗的预防效力。

说明书

技术领域

本发明涉及利用纯化的不同型别人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)晚期蛋白L1自组装成的病毒样颗粒(VLPs)经过适当比例配伍，制备HPV疫苗，用于预防HPV引起的部分疾病。

背景技术

HPV是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和粘膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。根据感染部位可分为皮肤型和粘膜型两组，粘膜型HPV又根据引起病变的性质分为两类：引起粘膜上皮良性增生病变的低危型和与人类多种器官恶性肿瘤(如宫颈癌、阴茎癌、喉及头颈癌、支气管癌、食管癌、口腔癌等)密切相关的高危型。根据核酸序列同源性，HPV可分为100多型，不同型别的HPV引起不同的疾病。HPV1、2、3、4、7、10、26-29在正常或免疫缺损个体中引起良性疣。HPV5、8、9、12、14、15、17、19-25、36、46-50在免疫缺损个体中引起扁平状损伤。HPV6、11、34、39、41-44、51-55引起生殖道或呼吸道粘膜发生非恶性湿疣。

完整的HPV病毒颗粒直径约55nm，由病毒基因组DNA与衣壳两部分组成，无包膜，衣壳呈二十面体，由72个壳粒组成，病毒颗粒在CsCl中的浮力密度为1.34g/cm³。病毒基因组是双链环状DNA，约8kb。基因组含至少8个开放阅读框(ORF)，各ORF间可部分或全部重叠，基因组根据功能分为三个功能区：早期区，编码6个非结构蛋白(E1、E2、E4、E5、E6、E7)，编码的蛋白与病毒的复制、转录和转化作用有关：晚期区，含L1、L2两个ORF，编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2两个结构蛋白，参与病毒粒子的组装；长控制区(LCR)，又称非编码区或上游调控区，不编码任何蛋白，但含有复制起点、启动子、增强子、沉默子等多种调控元件，影响病毒的复制和转录。HPV衣壳是由L1和L2蛋白共同构成，二者比例约5∶1。单独的L1蛋白可以自发组装成直径与HPV成熟病毒大小相近(约55nm)的VLPs，VLPs和天然HPV病毒的形态相似，都是二十面体结构，只是VLP内部无病毒核酸。

疫苗防治HPV相关疾病是近几年来的研究热点。由于目前无法通过组织培养获得大量的HPV病毒，并且考虑到HPVE6、E7基因的潜在致癌性，因此，不能通过减毒活疫苗或灭活疫苗等传统疫苗制备方式获得HPV疫苗。伴随分子生物学和基因工程技术的发展，目前HPV疫苗研究主要集中在VLPs疫苗、重组病毒疫苗、亚单位疫苗等。VLPs疫苗主要是以HPV主衣壳蛋白L1为首选目的蛋白，HPVL1蛋白分别在原核表达系统、酵母表达系统和杆状病毒表达系统中得以表达，且可自组装成VLPs，其动物实验及部分临床实验结果表明L1蛋白装配成的VLPs具有良好的免疫原性。

最早关于HPV疫苗组份的研究主要集中于HPV6、HPV11、HPV16和HPV18，英国葛兰素公司在杆状病毒表达系统分别表达HPV16和HPV18，美国默克公司在酿酒酵母表达系统中分别表达了HPV16、18、6和11等型别的L1蛋白，所得蛋白能形成病毒样颗粒。这些疫苗的配伍成分是基于欧美部分地区的流行病学调查结果，也主要是针对当地的病毒流行株。然而全世界流行病学总体调查研究结果表明，HPV引起恶性肿瘤的型别在世界各地不尽相同。其中HPV16是最主要的致癌因素，其他型别在世界各地与肿瘤发生的相关性不同，在中国及亚洲的流行病学调查结果显示，HPV58与宫颈癌的发生高度相关，相关文献报道HPV58的感染率达到10％以上，远远超过HPV18(4％)，这与在欧洲、美洲及非洲的流行病调查结果不同。

发明内容

本发明提供了一种能够预防人乳头瘤病毒感染的由不同型别HPV病毒样颗粒配伍的疫苗组合物：其中包括HPV6L1VLPs、HPV16L1VLPs和HPV58L1VLPs等不同型别的VLPs，其中每毫升疫苗中各组份的含量分别为：HPV6L1VLPs：10～60μg、HPV16L1VLPs：5～40μg和HPV58L1：VLPs10～60μg。其中所述疫苗组分可附加一种或两种其他HPV型别的VLPs。其中附加HPV型别包括：HPV1、HPV2、HPV3、HPV5、HPV8、HPV10、HPV11、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV45、HPV52、HPV53、HPV57和HPV59。

首先获得重组VLPs，纯度大于95％，混合所得各种型别VLPs，将VLPs混合物与佐剂混合，制备出能预防人乳头瘤病毒感染的疫苗。

本发明具有如下优点：1)分别分泌表达HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1蛋白，所得各种L1蛋白可自组装成VLPs。2)根据在亚洲和中国部分地区进行的人乳头瘤病毒感染流行病学调查结果，应用HPV6、HPV16和HPV58等型别的L1蛋白形成的VLPs制备的疫苗能预防60％HPV引起的感染。附加的HPV型别可以进一步提高疫苗的预防效力。

附图说明

图1示出重组HPV6、HPV16和HPV58VLPs混合物电镜照片。

图2示出重组HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58VLPs混合物电镜照片。

图3示出小鼠免疫中，针对单价HPV6疫苗与针对HPV6、HPV16和HPV58疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

图4示出小鼠免疫中，针对单价HPV6疫苗与针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

图5示出小鼠免疫中，针对单价HPV11疫苗与针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

图6示出小鼠免疫中，针对单价HPV16疫苗与针对HPV6、HPV16和HPV58疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

图7示出小鼠免疫中，针对单价HPV16疫苗与针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

图8示出小鼠免疫中，针对单价HPV18疫苗与针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

图9示出小鼠免疫中，针对单价HPV58疫苗与针对HPV6、HPV16和HPV58疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

图10示出小鼠免疫中，针对单价HPV58疫苗与针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18和HPV58VLPs疫苗中HPV6的抗体应答的比较。

具体实施方式

以下实施例是用于说明本发明，但不是限制其范围。

实施例1HPV6L1VLPs、HPV16L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1三种VLPs按40μg∶20μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例2HPV6L1VLPs、HPV11L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV18L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV11L1、HPV16L1、HPV18L1和HPV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例3单价VLPs和混合VLPs疫苗免疫原性比较

将制备好的单价VLPs和混合VLPs疫苗分别接种Balb/C小鼠，小鼠随机分组，每组5只，腹腔接种，分别于0、14、28天接种。于接种后28天取血用ELISA法检测抗体滴度。

实施例4ELISA法检测小鼠血清抗体

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。待检样品经2倍系列稀释，最高稀释度为1∶4096，取稀释后的样品0.1ml加到上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm测OD值。以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

实施例5HPV6L1VLPs、HPV16L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1三种VLPs按10μg∶5μg∶1μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例6HPV6L1VLPs、HPV16L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV16L1和HPV58L1三种VLPs按60μg∶25μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例7HPV6L1VLPs、HPV11L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV18L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV11L1、HPV16L1、HPV18L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例8HPV6L1VLPs、HPV11L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV18L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV11L1、HPV16L1、HPV18L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶20μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例9HPV6L1VLPs、HPV1L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV31L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV1L1、HPV16L1、HPV31L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶20μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例10HPV6L1VLPs、HPV1L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV31L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV1L1、HPV16L1、HPV31L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例11HPV6L1VLPs、HPV1L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV31L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HpV1L1、HPV16L1、HPV31L1和HPV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例12HPV6L1VLPs、HPV33L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV45L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV33L1、HPV16L1、HPV45L1和HPV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例13HPV6L1VLPs、HPV33L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV45L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV33L1、HPV16L1、HPV45L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例14HPV6L1VLPs、HPV33L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV45L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV33L1、HPV16L1、HPV45L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶25μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例15HPV6L1VLPs、HPV33L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV45L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV33L1、HPV16L1、HPV 45L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶25μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例16HPV6L1VLPs、HPV2L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV52L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV2L1、HPV16L1、HPV52L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶25 μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例17HPV6L1VLPs、HPV2L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV52L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV2L1、HPV16L1、HPV52L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例18HPV6L1VLPs、HPV2L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV52L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV2L1、HPV16L1、HPV52L1和HPV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例19HPV6L1VLPs、HPV3L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV53L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV3L1、HPV16L1、HPV53L1和HPV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例20HPV6L1VLPs、HPV3L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV53L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV3L1、HPV16L1、HPV53L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例21HPV6L1VLPs、HPV3L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV53L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV3L1、HPV16L1、HPV53L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶25μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例22HPV6L1VLPs、HPV5L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV35L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV5L1、HPV16L1、HPV35L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶25μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例23HPV6L1VLPs、HPV5L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV35L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV5L1、HPV16L1、HPV35L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例24HPV6L1VLPs、HPV5L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV35L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV5L1、HPV16L1、HPV35L1和HPV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例25HPV6L1VLPs、HPV8L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV57L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV8L1、HpV16L1、HpV57L1和HpV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例26HPV6L1VLPs、HPV8L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV57L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV8L1、HPV16L1、HPV57L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例27HPV6L1VLPs、HPV8L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV57L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV8L1、HPV16L1、HPV57L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶25μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例28HPV6L1VLPs、HPV10L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV59L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV10L1、HPV16L1、HPV 597L1和HPV58L1五种VLPs按60μg∶60μg∶25μg∶60μg∶60μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例29HPV6L1VLPs、HPV10L1VLPs、HPV 16L1VLPs、HPV59L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV10L1、HPV16L1、HPV597L1和HPV58L1五种VLPs按40μg∶40μg∶20μg∶40μg∶40μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。

实施例30HPV6L1VLPs、HPV10L1VLPs、HPV16L1VLPs、HPV59L1VLPs和HPV58L1VLPs混合VLPs疫苗的制备

将纯化的HPV6L1、HPV10L1、HPV16L1、HPV597L1和HPV58L1五种VLPs按10μg∶10μg∶5μg∶10μg∶10μg的比例配制成混合疫苗，同时加入佐剂氢氧化铝，终浓度约为1mg/ml，充分混合后，于4℃保存。