法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2011-08-24
授权
授权
2008-03-12
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-01-23
公开
公开
技术领域
本发明涉及人肿瘤坏死因子-α特异性人源化抗体及其制备方法。
背景技术
人肿瘤坏死因子-α(以下称为″hTNF-α″)是一种由3个17kDa蛋白亚基组成的同源三聚体(Eck M.J.et al.，JBG，267：2119-2122，1992；SmithR.A.et al.，JBC，262：6951-6954，1987)。hTNF-α是一种由巨噬细胞和单核细胞分泌的炎性细胞因子，在几种细胞反应(如坏死和编程性细胞死亡)中起着信号传递物的作用(Beyaert R.et al.，FEBS Lett.，340：9-16，1994)。hTNF-α造成促炎症反应引起组织破坏，如软骨和骨破坏(Saklatvala，Nature，322：547-549，1986))、诱导粘附分子、诱导血管内皮细胞中的促凝血活性(Pober JS et al.，J.Immunol.，136；1680-1687，1986)，并增加噬中性粒细胞和淋巴细胞粘附(Pober et al.，J.Immunol.138：3319-3324，1987)。另外，还发现hTNF-α在抗感染性疾病和肿瘤的防御机制中起着重要作用(Fiers W.，FEBSLett.，285：199-212，1991)。
hTNF-α参与炎性疾病、自身免疫性疾病、细菌感染、癌症和退行性疾病。在这些疾病中，hTNF-α被视为类风湿性关节炎、克隆氏病、牛皮癣性关节炎和强直性脊柱炎的特异生理治疗中的有用的靶蛋白。
同时，还建议使用hTNF-α抑制剂治疗类风湿性关节炎。据报道hTNF-α在从早期类风湿关节中分离出的滑膜细胞中过表达(Buchan G.etal.，Clin.Exp.Immunol.，73：449-455，1988)，并且，当使用抗-hTNF-α单克隆抗体对上述滑膜细胞进行治疗时，与类风湿性关节炎损伤相关的细胞因子减少(Butler D.M.et al.，Eur.Cytokine Netw.，6：225-230，1995)。另外，还发现抗-hTNF-α抗体或重组可溶性hTNF-α受体在胶原诱导小鼠关节炎模型中抑制了炎症和关节破坏(Piguet P.F.et al.，Immunology，77：510-514，1992；Wooley P.H.et al.，J.Immunol.，151：6602-6607，1993；Williams R.O.et al.，Immunology，84：433-439，1995)。另外，还观察到在过表达hTNF-α的转基因小鼠中诱导了炎症性关节炎(Keffer J.et al.，EMBO J.，10：4025-4031，1991)。
这些结果表明hTNF-α在类风湿性关节炎中起着控制炎性细胞因子的直接或间接调节子的重要作用。因此，需要开发一种对hTNF-α具有高度选择性和反应性的单克隆抗体用于治疗类风湿性关节炎。
通常，通过使用抗原对小鼠进行免疫来制备对特定抗原具有高度选择性和反应性的抗体(Kohler G.&Milstein C.，Nature，256；495-497，1975)。小鼠单克隆抗体具有易于制备抗体和选择具有高度反应性的抗体的优点。但是，它也存在问题，即当其被长时间给药后在人体内形成抗小鼠抗体(Dimaggio J.J.，et al.，Cancer Chemother.Biol.Response Modif.，11：177-203，1990)。
为克服小鼠单克隆抗体的不利特性，通过使用人抗体的框架区替换除抗原-结合部位以外的框架区研制出了人源化抗体。目前采用CDR(互补决定区)移植法作为一种制备这类人源化抗体的方法，其中仅小鼠抗体的CDR被移植入人抗体中。通过CDR移植法制备的人源化抗体具有降低体内免疫应答的优点(Riechmann et al.，Nature，332：323，1988；Nakataniet al.，Protein Engineering，7：435，1994)，但是，它常常丧失原始小鼠抗体的高度选择性和反应性(Carter P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289，1992)。
本发明人致力于克服传统人源化抗体的这类问题，并研制出了一种新的与hTNF-α特异性结合的人源化抗体，该抗体表现出了与原始小鼠单克隆抗体相似的抗原结合亲和力，并使免疫原性降至最小。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种hTNF-α特异性人源化抗体。
本发明的另一目的是提供一种编码所述人源化抗体的重链或轻链的DNA，和一种包含该DNA的表达载体。
本发明更进一步的目的是提供一种由所述表达载体转化的微生物。
本发明另一个更进一步的目的是提供一种用于治疗hTNF-α相关疾病的药物组合物，该药物组合物包含所述人源化抗体作为有效成分。
本发明的一方面提供了一种hTNF-α特异性人源化抗体，其包括：
a)互补决定区分别具有以下氨基酸序列的重链可变区：
HYGMN WINTNTGEPRYDEEFKG YDSRGFDC
(SEQ ID NO：41至43)；
b)互补决定区分别具有以下氨基酸序列的轻链可变区：
TASSSISYNYFH SSSNLAS HQYERSPWT
(SEQ ID NO：44至46)；
c)与人抗体的重链恒定区相同的重链恒定区；和
d)与人抗体的轻链恒定区相同的轻链恒定区。
附图说明
本发明的上述及其它目的和特征将在本发明的以下描述中，结合附图，得到清楚的说明，附图分别显示了：
图1：与TNF-α特异性结合的小鼠单克隆抗体重链(TSK114 H)可变区的氨基酸序列(SEQ ID NO：47)、人抗体重链亚群1(Hh1)氨基酸序列(SEQ ID NO：48)和本发明的人源化抗体重链(TNHV2、TNHV2k和TNHV1k)氨基酸序列(SEQ ID NO：36至3 8)的比较；
图2：与TNF-α特异性结合的小鼠单克隆抗体轻链(TSK114 L)氨基酸序列(SEQ ID NO：49)、人抗体轻链亚群1(Hk1)氨基酸序列(SEQ IDNO：50)和本发明的人源化抗体轻链(TNLV2和TNLV2d)氨基酸序列(SEQ ID NO：39和40)的比较；
图3：显示制备表达本发明的人源化抗体重链的pHAB-TNHV2 HF载体的过程的示意图；
图4：显示制备表达本发明的人源化抗体重链的pHAB-TNHV2k HF载体的过程的示意图；
图5：显示制备表达本发明的人源化抗体重链的pHAB-TNHV1k HF载体的过程的示意图；
图6：显示制备表达本发明的人源化抗体轻链的pHAB-TNLV2 LF载体的过程的示意图；
图7：显示制备表达本发明的人源化抗体轻链的pHAB-TNLV2d LF载体的过程的示意图；
图8：在动物细胞中制备和制备后提纯的本发明的人源化抗体的SDS-PAGE结果；和
图9：显示小鼠单克隆抗体和本发明的人源化抗体与TNF-α的结合亲和力的图示。
具体实施方式
在本发明的人源化抗体中，重链和轻链可变区的CDR来自小鼠单克隆抗体，而除CDR以外的框架区以及重链恒定区和轻链恒定区来自人抗体。优选地，本发明的人源化抗体表现出1×10-9M至1×10-13M的抗原结合亲和力(Kd)。并且，当通过表面等离子共振(SPR)确定时，本发明的人源化抗体的解离常数(Koff)为1×10-6s-1至1×10-9s-1。
本发明的人源化抗体可由对hTNF-α具特异性的小鼠单克隆抗体TSK114(保藏号：KCTC 10514BP和KCTC 10515BP)通过CDR移植法制备，其中小鼠单克隆抗体TSK114的重链可变区包含SEQ ID NO：41至43的三个CDR，而轻链可变区包含SEQ ID NO：44至46的三个CDR。
首先，将小鼠单克隆抗体的轻链和重链可变区的氨基酸序列与GenBank数据库中的人序列进行比较，并选出被Kabat定义为与小鼠抗体重链具有最大的序列相似性的人类重链可变区亚群1(Hh1)和与小鼠抗体轻链具有最大相似性的人轻链κ可变区亚群1(Hk1)(Harris L.&Bajorath J.，Protein Science，4；306-310，1995)。
编码人源化抗体重链和轻链的基因可通过使用这些选择的人类基因作为模板进行扩增。在该过程中，可在已知基因研究和抗体结构分析信息的基础上对每个编码人源化抗体重链和轻链的核苷酸序列进行修饰。并且，如果小鼠单克隆抗体的某些氨基酸残基影响了抗原结合亲和力或者它们对维持抗体结构很重要，优选保留编码所述氨基酸残基的核苷酸序列而不进行修饰(Kabat E.A.et al.，D.H.H.S.Publication number(NIH)91-3242，1991；Chothia C.et al.，Nature，342；877-883，1989；Studnicka G.M.et al.，Protein Engineering，7；805-814，1994；Harris L.&Bajorath J.，Protein Science，4；306-310，1995)。
编码人源化抗体的重链可变区的基因可通过使用人抗体重链亚群1(Hh1)替换与hTNF-α特异性结合的小鼠单克隆抗体TSK114重链可变区中除抗原结合部位以外的框架区而制备。这种编码人源化抗体的重链可变区的基因可通过以下步骤制备：使用编码小鼠单克隆抗体TSK114的基因作为模板设计小鼠单克隆抗体人源化用引物；使用对应的引物进行PCR(聚合酶链反应)；并使用限制酶和DNA连接酶彼此连接如此扩增的PCR产物。由此制得的编码人源化抗体的重链可变区的基因被命名为TNHV2(SEQ ID NO：31)、TNHV2k(SEQ ID NO：32)和TNHV1k(SEQ ID NO：33)，它们分别编码具有SEQ ID NO：36、37和38的氨基酸序列的多肽(见图1)。
为制备编码人源化抗体全长重链的基因(包括编码人源化重链可变区的基因)，将TNHV2、TNHV2k或TNHV1k基因插入合适的载体中，如TOPO载体(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen，US)，以制备表达载体pCR-TNHV2 Hv、pCR-TNHV2k Hv和pCR-TNHV1k Hv。从表达载体pCR-TNHV2 Hv、pCR-TNHV2k Hv或pCR-TNHV1k Hv中分离出具有人源化抗体的重链可变区的基因片段，并插入含有编码人抗体的重链恒定区域的基因的载体pHAB-HC(保藏号：KCTC 10229BP；韩国专利公开号：2004-12266)中，以获取人源化抗体重链的表达载体。由此制得的表达载体被命名为pHAB-TNHV2 HF、pHAB-TNHV2k HF和pHAB-TNHV1k HF。
根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，由pHAB-TNHV2 HF载体和pHAB-TNHV2k HF载体转化的大肠杆菌(E.coli)TOP10F′转化株于2004年9月1日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：韩国生物科学与生物技术研究所(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，韩国)，保藏号分别为KCTC 10691BP和KCTC 10692BP，由pHAB-TNHV1k HF载体转化来的大肠杆菌TOP10F′转化株于2005年6月13日保藏于KCTC，保藏号为KCTC10818BP。
编码人源化抗体的全长重链的基因可从pHAB-TNHV2 HF、pHAB-TNHV2k HF和pHAB-TNHV1k HF重链表达载体中分离，并被分别命名为TNHV2 HF、TNHV2k HF和TNHV1k HF。
编码人源化抗体轻链可变区的基因可通过使用人抗体轻链亚群1(HK1)替换与hTNF-α特异性结合的小鼠单克隆抗体TSK114的轻链可变区中除抗原结合部位以外的框架区而制备。这种编码人源化抗体轻链可变区的基因可通过以下步骤制备：使用编码小鼠单克隆抗体TSK114的基因作为模板设计小鼠单克隆抗体人源化用引物；使用对应的引物进行PCR；并使用限制酶和DNA连接酶连接如此扩增的PCR产物。由此制得的编码人源化抗体轻链可变区的基因被命名为TNLV2和TNLV2d，它们分别编码具有SEQ ID NO：39和40的氨基酸序列的多肽(参见图2)。
为制备编码人源化抗体全长轻链的基因(包括编码人源化轻链可变区的基因)，将TNLV2或TNLV2d基因插入合适的载体中，如TOPO载体，以制备pCR-TNLV2 Lv和pCR-TNLV2d Lv表达载体。从pCR-TNLV2 Lv或pCR-TNLV2k Lv表达载体中分离出具有人源化抗体的轻链可变区的基因片段，并插入含有编码人抗体的轻链恒定区的基因的pHAB-KC载体(保藏号：KCTC 10230BP；韩国专利公开号：2004-12268)中，获取人源化抗体轻链的表达载体。由此制得的表达载体被命名为pHAB-TNLV2 LF和pHAB-TNLV2d LF。
根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定，由pHAB-TNLV2 LF表达载体转化来的大肠杆菌TOP10F′转化株于2004年9月1日保藏在KCTC，保藏号为KCTC 10690BP，由pHAB-TNLV2dLF表达载体装化来的大肠杆菌TOP10F′转化株于2005年6月13日保藏在KCTC，保藏号为KCTC 10817BP。
所述编码人源化抗体全长轻链的基因可从pHAB-TNLV2 LF和pHAB-TNLV2d LF轻链表达载体中分离，并被分别命名为TNLV2 LF和TNLV2d LF。
CHO细胞系可通过使用合适的转化液(如GenePORTER(GTS，US))由pHAB-TNHV2 HF人源化重链表达载体和pHAB-TNLV2 LF人源化轻链表达载体转化而来，以获得能产生hTNF-α特异性人源化抗体的转化株，转化株被命名为CHO-YHB1406。并且，可根据与上述相同的方法，通过使用pHAB-TNHV2k HF人源化重链表达载体和pHAB-TNLV2 LF或pHAB-TNLV2d LF人源化轻链表达载体制备另一种转化株。这些转化株被命名为CHO-YHB1411和CHO-YHB1411-2。另外，还可根据与上述相同的方法，通过使用pHAB-TNHV1k HF人源化重链表达载体和pHAB-TNLV2d LF人源化轻链表达载体制备另一种转化株，该转化株已被命名为CHO-YHB 1406-2。
为了从转化细胞系中纯化本发明的人源化抗体，可在合适的培养基中培养CHO-YHB1406、CHO-YHB1411、CHO-YHB1411-2或CHO-YHB1406-2转化株，并使用蛋白-A(Amersham Bioscience，瑞典)或山羊抗-人免疫球蛋白G(Zymed Laboratories Inc.，USA)对培养物上清进行柱层析。由此纯化来的人源化抗体被分别命名为YHB 1406、YHB 1411、YHB1411-2和YHB1406-2。
人源化抗体的抗原结合亲和力可通过，如，竞争ELISA、固相ELISA或表面等离子共振确定。与hTNF-α特异性结合的YHB1406、YHB1411、YHB1411-2和YHB1406-2人源化抗体表现出了从1×10-9M到1×10-13M的抗原结合亲和力，说明本发明的人源化抗体具有与原始小鼠单克隆抗体相似的抗原结合活性，而免疫原性显著减小，因此，可被有效用于治疗hTNF-α相关疾病。并且，通过SPR确定的本发明的人源化抗体的解离常数(Koff)在1×10-6s-1至1×10-9s-1的范围内，表明抗原-抗体复合物的解离度非常低。
为此，本发明的人源化抗体可被用作药物组合物中的有效成分，用于治疗hTNF-α相关疾病，例如类风湿性关节炎、克隆氏病、牛皮癣性关节炎、牛皮癣、败血症、哮喘、韦格纳氏肉芽肿病、炎症和强直性脊柱炎。
本发明的组合物被制备为在采用本领域已知的任何一种方法对病人进行给药后提供有效成分的快速、持久或缓慢释出。所述组合物可包含药学可接受的赋形剂、稀释剂、崩解剂、增甜剂、润滑剂和调味剂。所述药物组合物优选制备为通过快速浓注法或持续滴液法静脉给药，或通过植入胶囊释放。典型静脉给药剂型使用生理盐水作为稀释剂。
实际给予病人的抗体的剂量应由各种相关因素确定，包括将给药的特异性抗体、给药时间和组合物的剂型、给药途径、待治疗的疾病、病人的体重、年龄、性别、健康状况和饮食。典型剂量为0.01mg/kg/天到1,000mg/kg/天。更典型的剂量为0.1mg/kg/天到10mg/kg/天。
以下实施例旨在对本发明进行进一步说明，而不对本发明的范围构成限制。
实施例1：具有人源化抗体重链可变区编码的基因的构建
使用编码TNF-α特异性小鼠单克隆抗体TSK114(保藏号：KCTC10514BP和KCTC 10515BP)重链可变区的基因作为模板以及SEQ IDNO：1和14的引物对进行PCR，以扩增携带前导序列的编码人源化抗体重链可变区的基因A。将扩增的PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳，并使用QIAgel回收试剂盒(Qiagen，USA)从凝胶中回收。
使用SEQ ID NO：1和7或SEQ ID NO：6和14的引物对对由此获得的基因A进行PCR以扩增DNA片段，使用得到的DNA片段和SEQID NO：1和14的引物对进行重叠PCR。使用TOPO载体(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen lnc.，USA)在室温下对扩增的PCR产物孵育45分钟进行克隆，然后将克隆载体转化到大肠杆菌TOP10F′(Invitrogen lnc.，USA)中。将转化得到的大肠杆菌在含100μg/ml氨比西林的LB培养基中接种后，从大肠杆菌中分离出质粒，并使用EcoRI(BioLabs Inc.，USA)酶解制备约450bp的编码重链可变区的基因B。
使用基因B作为模板和SEQ ID NO：1和9或SEQ ID NO：8和14的引物对进行PCR以扩增DNA片段，使用得到的DNA片段和SEQ IDNO：1和14的引物对进行重叠PCR。按照与上述相同的方法，在TOPO载体中对扩增的PCR产物进行克隆，并使用EcoRI酶解，以制备编码重链可变区的基因C。
按照与上述相同的方法，使用SEQ ID NO：1和11或SEQ IDNO：10和14的引物对对基因C进行PCR以扩增DNA片段，使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：1和14的引物对进行重叠PCR。将由此扩增的PCR产物在TOPO载体中克隆以获得编码重链可变区的基因D。使用SEQ ID NO：4和14或SEQ ID NO：1和5的引物对对基因D进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：1和14的引物对进行重叠PCR。按照与上述同样的方式，在TOPO载体中对由此扩增的PCR产物进行克隆，以获得编码重链可变区的基因E。
另外，使用基因E作为模板和SEQ ID NO：1和3或SEQ ID NO：2和14的引物对进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：1和14的引物对进行重叠PCR。按照与上述相同的方法，在TOPO载体中对PCR产物进行克隆，以获得编码重链可变区的TNHV2基因(SEQ ID NO：31)，插入了TNHV2的TOPO载体被命名为pCR-TNHV2 Hv。
按照与上述相同的方法，使用TNHV2作为模板和SEQ ID NO：1和13或SEQ ID NO：12和14的引物对进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：1和14的引物对进行重叠PCR，并在TOPO载体中对PCR产品进行克隆以获得编码重链可变区的另一基因。该基因被命名为TNHV2k(SEQ ID NO：32)，而插入了TNHV2k基因的TOPO载体被命名为pCR-TNHV2k Hv。
另外，按照与上述相同的方法，使用TNHV2k基因作为模板和SEQ ID NO：1和15的引物对进行PCR，并在TOPO载体中对PCR产物进行克隆获得另一种编码重链可变区的基因。该基因被命名为TNHV1k(SEQ ID NO：33)，而插入了TNHV1k的TOPO载体被命名为pCR-TNHV1k Hv。
表1显示了每个PCR反应中采用的引物对和反应条件。每个PCR反应在表1所示的30个循环的以下条件下进行，预变性为95℃，7分钟，最后延伸为72℃，10分钟。
<表1>
实施例2：人源化抗体的全长重链基因的构建及其表达载体
为使用实施例1中制备的插入TNHV2 Hv载体中的编码重链可变区的基因构建编码人源化全长重链的基因，采用含有编码人抗体的重链恒定区的基因的pHAB-HC(KCTC 10229BP，韩国专利公开号2004-12266)载体。
首先，为了在表达载体pHAB-HC中插入编码人源化抗体重链可变区的基因TNHV2，使用Hind III/ApaI(BioLabs，Inc.，USA)在37℃对pCR-TNHV2 Hv处理2小时，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，并使用溴化乙啶(EtBr)染色，观察到约450bp的基因片段。
并且，对pHAB-HC进行Hind III/ApaI处理、电泳和染色，观察到约6.5kb的酶解载体片段。然后，使用QIAgel回收试剂盒(Qiagen，USA)将观察到的基因片段从凝胶中回收，使用T4 DNA连接酶(BioLabs，Inc.，USA)在16℃处理过夜，并转化到大肠杆菌TOP10F′中以获得转化株。将转化株在加入了100μg/ml的氨比西林的LB培养基中培养过夜，并从中分离出质粒。使用Hind III/NotI对分离出的质粒进行处理，并进行琼脂糖凝胶电泳，以获得约1.4kb人源化抗体的全长重链基因。
由此制得的人源化抗体的全长重链基因被命名为TNHV2 HF。另外，插入了TNHV2 HF的表达载体被命名为pHAB-TNHV2 HF(图3)，并被转化到大肠杆菌TOP10F′中以获取转化株，转化株于2004年9月1日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：生物科学与生物技术研究所，#52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，305-333，韩国)，保藏号为KCTC10691BP。
按照与上述相同的方法，使用TNHV2k或TNHV1k基因也制备了人源化抗体的全长重链基因，由此制得的人源化抗体的全长重链基因被分别命名为TNHV2k HF或TNHV1k HF。另外，插入了TNHV2k HF或TNHV1k HF全长重链基因的人源化抗体的重链表达载体被分别命名为pHAB-TNHV2k HF或pHAB-TNHV1k HF(图4和5)，由pHAB-TNHV2k HF或pHAB-TNHV1k HF转化而来的大肠杆菌TOP10F′分别于2004年9月1日或2005年6月13日被保藏在韩国典型培养物保藏中心，保藏号分别为KCTC 10692BP和KCTC 10818BP。
实施例3：编码人源化抗体的轻链可变区的基因的构建
使用编码特异性识别TNF-α的小鼠单克隆抗体TSK114的轻链可变区的基因作为模板和SEQ ID NO：16和30的引物对进行PCR，以扩增含前导序列的编码轻链可变区的基因A。对基因A进行琼脂糖凝胶电泳和EtBr染色，并使用QIAgel回收试剂盒从凝胶中回收。
使用SEQ ID NO：16和25或SEQ ID NO：24和30的引物对对由此纯化的基因A进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：16和30的引物对进行重叠PCR。使用TOPO载体(TOPO TA克隆试剂盒，Invitrogen lnc.，USA)在室温下对扩增的PCR产物孵育45分钟，并将克隆得到的载体转化到大肠杆菌TOP10F′中以获得转化株。将转化株在含100μg/ml的氨比西林的LB培养基中孵育过夜后，从大肠杆菌中分离出质粒，并用EcoRI(BioLabs Inc.，USA)酶解，以获得约400bp编码轻链可变区的基因B。
使用基因B作为模板和SEQ ID NO：26和30或SEQ ID NO：16和27的引物对进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：16和30的引物对进行重叠PCR。按照与上述相同的方法，在TOPO载体中对扩增的PCR产物进行克隆，并使用EcoRI进行酶解，制备编码轻链可变区的基因C。
按照与上述相同的方法，使用SEQ ID NO：16和23或SEQ IDNO：22和30的引物对对基因C进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：16和30的引物对进行重叠PCR。按照与上述相同的方法，在TOPO载体中对由此扩增的PCR产物进行克隆，以获得编码轻链可变区的基因D。
通过使用基因D作为模板和SEQ ID NO：18和30或SEQ ID NO：16和19的引物对进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：16和30的引物对进行重叠PCR，按照与上述相同的方法，在TOPO载体中对由此扩增的PCR产物进行克隆，以获得编码轻链可变区的基因E。
通过使用基因E作为模板和SEQ ID NO：20和30或SEQ IDNO：16和21的引物放大DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQID NO：16和30的引物对进行重叠PCR。按照与上述相同的方法，在TOPO载体中对由此放大的PCR产品进行克隆，获得编码轻链可变区的基因F。
并且，使用基因F作为模板和SEQ ID NO：28和30或SEQ IDNO：16和29的引物对进行PCR以扩增DNA片段，并使用得到的DNA片段和SEQ ID NO：16和30的引物对进行重叠PCR。按照与上述相同的方法，在TOPO载体中对PCR产品进行克隆，以获得编码轻链可变区的基因TNLV2(SEQ ID NO：34)，而插入了基因TNLV2的TOPO载体被命名为pCR-TNLV2 Lv。
另外，按照与上述相同的方法，使用TNHV2作为模板和SEQ IDNO：16和17的引物对进行PCR以扩增DNA片段，并使用SEQ IDNO：30的引物片段作为大引物进行PCR，以获得编码人源化抗体的轻链可变区的基因。该基因被命名为TNLV2d(SEQ ID NO：35)，而插入了TNLV2d的TOPO载体被命名为pCR-TNLV2d Lv。
下表2中描述了上述PCR反应中采用的引物对和PCR条件。每个PCR反应在表2中所示的30个循环的条件下进行，预变性为95℃，7分钟，最后延伸为72℃，10分钟。
<表2>
实施例4：人源化抗体的全长轻链基因的构建及其表达载体
为使用实施例3中制备的插入pCR-TNLV2 Lv载体的编码轻链可变区的基因构建编码人源化全长轻链的基因，使用了含有编码人抗体的轻链恒定区的基因的pHAB-KC(KCTC 10230BP，韩国专利公开号2004-12268)表达载体。
首先，为将编码人源化抗体轻链可变区的基因TNLV2插入表达载体pHAB-KC中，使用Hind III/BsiWI(BioLabs，Inc.，USA)在37℃对pCR-TNLV2Lv处理2小时，在1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳并使用溴化乙啶(EtBr)染色，观察到约400bp的基因片段。
按照与上述相同的方法，也使用Hind III/BsiWI对表达载体pHAB-KC进行处理，观察到约6.5kb的酶解载体片段。然后，使用QIAgel回收试剂盒(Qiagen，USA)将观察到的基因片段从凝胶中回收恢复，使用T4 DNA连接酶(BioLabs，Inc.，USA)在16℃处理过夜，并转化到大肠杆菌TOP10F′中以获得转化株。将转化株在加入了100μg/ml的氨比西林的LB培养基中培养过夜，并从培养基中分离出质粒。使用Hind III/NotI(BioLabs，Inc.，USA)对分离出的质粒进行处理，并进行琼脂糖凝胶电泳，以获得约0.7kb的人源化抗体的全长轻链基因。
由此制得的人源化抗体的全长轻链基因被命名为TNLV2 LF。并且，插入了TNLV2 LF的表达载体被命名为pHAB-TNLV2 LF(图6)，并被转化到大肠杆菌TOP10F′中以获得转化株，转化株于2004年9月1日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC10690BP。
按照与上述相同的方法，使用TNLV2d基因制备人源化抗体的全长轻链基因，由此制得的人源化抗体的全长轻链基因被命名为TNLV2dLF。并且，插入了TNLV2d LF的表达载体被命名为pHAB-TNLV2d LF(图7)，并被转化到大肠杆菌TOP10F′中以获得转化株，转化株于2005年6月13日保藏在韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏号为KCTC10817BP。
实施例5：将人源化抗体转化到CHO细胞系中
为测量动物细胞中的人源化抗体活性，如下将实施例2中制备的重链表达载体pHAB-TNHV2 HF和实施例4中制备的轻链表达载体pHAB-TNLV2 LF转染到CHO细胞系(ATCC CRL-9096，USA)中。
首先，在37℃增湿二氧化碳培养箱中，在加入了2.0g/L碳酸氢钠(Sigma，USA)和10％热灭活FBS(Gibco BRL，USA)的DMEM/F 12培养基(JRH Inc.，USA)中对CHO细胞进行2至3天培养。通过在室温(25℃)对培养液进行5分钟1,200rpm离心收集培养细胞，使用0.4％台盼蓝(Gibco BRL，USA)染色，并用血细胞计数器计数。将细胞按约3×105的数量接种到T-75烧瓶中进行亚培养。
允许接种的CHO细胞增殖直至其以60-90％的密度占据烧瓶表面。将转染用10μgpHAB-TNHV2 HF、10μg pHAB-TNLV2 LF和80μlGenePORTER溶液(GTS，USA)与5mlDMEM/F12(无血清)培养基混合。然后将混合物置于室温下10至45分钟，将培养基从烧瓶中取出，将亚培养的CHO细胞和所述混合物在37℃增湿二氧化碳培养箱中孵育约3至5小时，以获取被命名为CHO-YHB1406的转染体。
按照与上述相同的方法，将分别在实施例2和4中制备的重链表达载体pHAB-TNHV2k HF和轻链表达载体pHAB-TNLV2 LF，重链表达载体pHAB-TNHV2k HF和轻链表达载体pHAB-TNLV2d LF，或重链表达载体pHAB-TNHV1k HF和轻链表达载体pHAB-TNLV2d LF转染到CHO细胞中以获得转染体，分别命名为CHO-YHB1411、CHO-YHB1411-2和CHO-YHB1406-2。
实施例6：人源化抗体的纯化
将2×105个实施例5中获得的转染体CHO-YHB1406细胞种入含有加入了10％胎牛血清的DMEM/F12培养基的T-75烧瓶中，并将烧瓶在37℃增湿二氧化碳培养箱中孵育7天以表达人源化抗体。收集培养基，离心并过滤以获得包含抗体的无细胞培养液。
为从溶液中纯化人源化抗体，分别采用A蛋白(Pharmacia)和山羊抗-人免疫球蛋白G(Zymed Laboratories Inc.，USA)与琼脂糖4快流柱相结合。含有抗体的培养基被施加于A蛋白结合琼脂糖4快流柱，以允许人源化抗体与A蛋白结合，并将甘氨酸缓冲液(pH 2.5)加入柱中洗提人源化抗体。然后，将洗提液与1M Tris-Cl(pH8.0)按1∶10的体积比混合进行中和，并置于与山羊抗-人免疫球蛋白结合的琼脂糖4快流柱中，使柱特异性捕获所述抗体蛋白。
根据与上述相同的方法洗提人源化抗体，纯化的人源化抗体被命名为YHB1406。
按照与上述相同的方法，分别培养实施例5中制备的转染体CHO-YHB 1411、CHO-YHB 1411-2和CHO-YHB1406-2，并从中纯化产生的抗体，以获得被分别命名为YHB 1411、YHB1411-2和YHB 1406-2的纯化人源化抗体。
作为使用SDS-PAGE对纯化人源化抗体进行分析的结果，观察到了约50kDa和约25kDa的带，被分别鉴定为人源化抗体的重链和轻链(图8)。
实施例7：人源化抗体与hTNF-α的抗原结合亲和力测量
使用竞争ELISA对实施例6中纯化的人源化抗体进行量化，并通过使用重组hTNF-α(Biosource，USA)分析其抗原结合活性。为了进行抗体的量化，将100ng山羊抗-人免疫球蛋白G.A.M(Zymed Laboratories Inc.，USA)分配到微量培养板(Dynatech Laboratories Inc.，USA)的每个孔中，并将孔板置于4℃保存过夜使其表面覆盖免疫球蛋白。此时，小鼠单克隆抗体TSK114被作为对照。
为测量人源化抗体与重组hTNF-α抗原的抗原结合亲和力，将浓度为10-11至10-7M的不同浓度的抗原溶液(每种100μl)分别与5ng小鼠单克隆抗体TSK114、人源化抗体YHB1406、YHB1411、YHB 1406-2和YHB1411-2混合，并在37℃反应2小时。将各反应物加到包被有0.4μg抗原的孔板上，并将孔板置于37℃约1.5小时。将与辣根过氧化物酶结合的山羊抗-人多克隆抗体(BioRad，USA)按1∶1000的比例稀释并将100μl稀释的抗体溶液加入每个孔中。将孔板置于37℃1小时。反应完成后，使用辣根过氧化物酶底物试剂盒(BioRad，USA)测量每个孔的光密度。
根据测得的光密度计算出与抗原结合和未结合的抗体的浓度，并由此确定人源化抗体的抗原结合亲和力(Friguet B.et al.，J.Immunol.Meth.，77：305-319，1985)。结果示于表3和图9中。
<表3>
如表3和图9中可见，人源化抗体YHB 1406、YHB 1411、YHB1411-2和YHB1406-2的抗原结合亲和力与小鼠单克隆抗体TSK114的相似。
实施例8：人源化抗体体外抗原中和能力测试
采用WHEI 164细胞系(ATCC CRL-1751，USA)，按以下方法确定本发明的人源化抗体的体外hTNF-α抗原中和能力(Khabar KSA et al.，Immunol.Lett.46；107-110，1995)。
将小鼠单克隆抗体TSK114和人源化抗体YHB1406、YHB1411、YHB1411-2和YHB1406-2分别在PBS缓冲液中稀释为从0.024ng/mL至1.0μg/rnL的不同浓度，并将各100μl所得溶液加到96-孔培养板的孔中。将50ul的hTNF-α溶液(100pg/mL)加到每个孔并在37℃反应1小时。然后，将50ul经2ug/ml放线菌素D(Sigma，USA)处理的WHEI164细胞系(1×106细胞/ml)加到每个孔。
在37℃培养细胞24小时，并取出100ul培养液。将在PBS缓冲液中稀释为5mg/mL的浓度的20ul甲基噻唑基四唑(MTT，Sigma，USA)溶液加到培养板的每个孔，并将板在37℃孵育4小时以显色。然后将100ul的0.1N HCl-10％SDS溶液(Sigma，USA)加到每个孔中以彻底溶解有色沉淀，在595nm测量每个孔的吸光度。
根据以上获得的吸光度数据绘制出WHEI 164细胞系对比抗体浓度的存活率曲线。根据曲线计算出抑制50％细胞死亡的抗体浓度(IC50)，结果显示于表4中。
<表4>抗体的抗原中和能力
如表4中所示，小鼠单克隆抗体(TSK114)的IC50为4.7ng/mL，而本发明的人源化抗体YHB1406、YHB1411、YHB1411-2和YHB1406-2的IC50分别为9.2ng/mL、6.7ng/mL、5.5ng/mL和6.5ng/mL。该结果表明人源化抗体具有与小鼠单克隆抗体类似的体外抗原中和能力。
实施例9：通过SPR测量人源化抗体与hTNF-α的抗原结合亲和力
通过表面等离子共振(SPR)法测量小鼠单克隆抗体和人源化抗体与hTNF-α的结合亲和力。具体地说，在传感器芯片CM5(Biacore，瑞典)上以200ug/ml的浓度对hTNF-α(Biosource，USA)进行固定化，并分别与25、50、100、200和400nM小鼠单克隆抗体TSK114或人源化抗体YHB1411-2反应。然后，通过Biacore2000(Biacore，瑞典)测量反应的结合常数和解离常数。
由以上测得的结合常数和解离常数计算抗体的抗原结合亲和力，结果显示在表5中。
<表5>小鼠单克隆抗体和人源化抗体与hTNF-α的结合亲和力比较
如表5中所示，本发明的人源化抗体YHB1411-2表现出了皮摩尔水平(10-12M)的高抗原结合亲和力和低解离常数。另外，人源化抗体YHB1411-2的抗原结合亲和力比小鼠单克隆抗体TSK114高约3倍。
尽管已从上述具体实施方式对本发明进行了描述，应认识到由本领域技术人员对本发明作出的各种修改和更改也属于所附权利要求书限定的本发明的范围之内。
序列表
<110>株式会社柳韩洋行
<120>肿瘤坏死因子-α特异性人源化抗体
<130>PCA51264-YUH
<150>KR10-2004-0115709
<151>2004-12-29
<160>50
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>1
aaagcttatg gattgggtgt ggaacttgct attcctgatg
40
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<400>2
cctggagcgt cagtcaaggt ctcctgcaag gct
33
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<400>3
cttgcaggag accttgactg acgctccagg cttctt
36
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<223>primer
<400>4
gtgaggcagg ctccaggaca gggtttagag tggatgggc
39
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gcccatccac tctaaaccct gtcctggagc ctgcctcacc cagtt
45
<210>6
<211>39
<212>DNA
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<220>
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<400>6
ggacgggtta ccatgactag ggacacctct gccagcact
39
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<400>7
ggcagaggtg tccctagtca tggtaacccg tccctt
36
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<400>8
gcctatatgg agctcagcag cctcagaagt gaggacacg
39
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cgtgtcctca cttctgaggc tgctgagctc catataggca gt
42
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<211>36
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gacacggctg tatattactg tgcaagatat gattcc
36
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atcatatctt gcacagtaat atacagccgt gtcctc
36
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gtgaggcagg ctccaggaaa gggttta
27
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gcccatccac tctaaaccct ttcctgg
27
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<220>
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tgggcccttg gtggaggctg aggagactgt gacagtgg
38
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tgggcccttg gtggaggctg aggagactgt gagagtggt
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aaagcttatg gatttacaag tgcagatttt cagcttcctg cta
43
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<211>29
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<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>17
cataacaata tctcctctgg acattatga
29
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<211>36
<212>DNA
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<220>
<223>primer
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gttatgaccc agtctccatc aagcctgtct gcatct
36
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<220>
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agacaggctt gatggagact gggtcataac aatttg
36
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<212>DNA
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<220>
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gcatctgtag gggaacgggt caccatcacc tgc
33
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<212>DNA
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<220>
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<400>21
ggtgatggtg acccgttccc ctacagatgc aga
33
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<212>DNA
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<220>
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<400>22
cagcagaagc caggatccgc ccccaaactc tgg
33
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<220>
<223>primer
<400>23
gagtttgggg gcggatcctg gcttctgctg ata
33
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<400>24
tctgggaccg atttcacttt cacaatcagc agc
33
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<220>
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gctgctgatt gtgaaagtga aatcggtccc aga
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<220>
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agcagcctgc agcctgaaga tattgccact tat
33
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<212>DNA
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<220>
<223>primer
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agtggcaata tcttcaggct gcaggctgct gat
33
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<212>DNA
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<220>
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ggagtcccat ctcgcttcag tggcagt
27
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<212>DNA
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<220>
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cccactgcca ctgaagcgag atgggactcc
30
<210>30
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
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gccaccgtac gtttgatttc caccttggt
29
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<212>DNA
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<220>
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caggtccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcgtc agtcaaggtc
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tcctgcaagg cttctggata taccttcaca cactatggaa tgaactgggt gaggcaggct
120
ccaggacagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaagatat
180
gatgaagagt tcaagggacg ggttaccatg actagggaca cctctgccag cactgcctat
24O
atggagctca gcagcctcag aagtgaggac acggctgtat attactgtgc aagatatgat
300
tccaggggat ttgactgctg gggccaaggc accactgtca cagtctcctc a
351
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<211>35l
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Variable regiOn Of humanized heaVy chain，TNHV2k
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caggtccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcgtc agtcaaggtc
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tcctgcaagg cttctggata taccttcaca cactatggaa tgaactgggt gaggcaggct
120
ccaggaaagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaagatat
18O
gatgaagagt tcaagggacg ggttaccatg actagggaca cctctgccag cactgcctat
240
atggagctca gcagcctcag aagtgaggac acggctgtat attactgtgC aagatatgat
300
tccaggggat ttgactgctg gggccaaggc accactgtca cagtctcctc a
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caggtccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagcgtc agtcaaggtc
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tcctgcaagg cttctggata taccttcaca cactatggaa tgaactgggt gaggcaggct
120
ccaggaaagg gtttagagtg gatgggctgg ataaacacca acactggaga gccaagatat
180
gatgaagagt tcaagggacg ggttaccatg actagggaca cctctgccag cactgcctat
240
atggagctca gcagcctcag aagtgaggac acggctgtat attactgtgc aagatatgat
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tccaggggat ttgactgctg gggccaaggc accactctca cagtctcctc a
351
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<212>DNA
<213>Artificial Sequence
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<223>Variable region of humanized light chain，TNLV2
<400>34
caaattgtta tgacccagtc tccatcaagc ctgtctgcat ctgtagggga acgggtcacc
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atcacctgca ctgccagctc aagtataagt tacaattact ttcactggta tcagcagaag
120
ccaggatccg cccccaaact ctggatttat agctcatcca atctggcttc tggagtccca
180
tctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc gatttcactt tcacaatcag cagcctgcag
240
cctgaagata ttgccactta ttactgccac cagtatgagc gttccccgtg gacgttcggt
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ggaggcacca aggtggaaat caaacgt
327
<210>35
<211>327
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Variable region of humanized light chain，TNLV2d
<400>35
gatattgtta tgacccagtc tccatcaagc ctgtctgcat ctgtagggga acgggtcacc
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atcacctgca ctgccagctc aagtataagt tacaattact ttcactggta tcagcagaag
120
ccaggatccg cccccaaact ctggatttat agctcatcca atctggcttc tggagtccca
180
tctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc gatttcactt tcacaatcag cagcctgcag
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cctgaagata ttgccactta ttactgccac cagtatgagc gttccccgtg gacgttcggt
300
ggaggcacca aggtggaaat caaacgt
327
<210>36
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Variable region of humanized heavy chain，TNHV2
<400>36
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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe
50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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115
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Variable region of humanized heavy chain，TNHV2k
<400>37
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe
50 55 60
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Variable region of humanized heavy chain，TNHVlk
<400>38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Asp Glu Glu Phe
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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115
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<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Variable region of humanized light chain，TNLV2
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
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35 40 45
Ile Tyr Ser Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln
65 70 75 80
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机译： 肿瘤坏死因子α特异性人源化抗体
机译： 人体肿瘤坏死因子特异性人源化抗体？
机译： 肿瘤坏死因子-α特异性人源化抗体
