食蟹猴的细胞色素P450酶及NADPH－细胞色素P450氧化还原酶

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，具体地说涉及食蟹猴细胞色素P450 3A5基因和食蟹猴NADPH－细胞色素P450氧化还原酶基因、分别含有该两个基因的的重组载体、用载体转化的宿主、以及转化体产生的重组病毒。包括生产具有酶活性的基因表达产物及它们在药物筛选中的应用。

说明书

[技术领域]

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及细胞色素P450 3A5的基因、含有该基因的的重组载体、用该载体转化的宿主、以及利用转化体生产的该基因的表达产物及其应用。

[背景技术]

细胞色素P450是重要的药物代谢I相酶，市场上80％以上的药物是通过细胞色素P450代谢的。3A亚家族是细胞色素P450基因家庭的主要成员，主要包括3A4、3A5及3A7几个成员。细胞色素P4503A5具有与3A4相似的代谢谱，能够代谢多种药物如midazolam，nifedipine及睾丸激素，孕酮等。

包括人、狗、大鼠、小鼠等多种动物的细胞色素P450基因序列已经被克隆，各种细胞色素P450也已经在大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞等宿主中表达。异源表达的细胞色素P450是研究药物代谢，进行体外药物筛选的重要手段。食蟹猴是常用的临床前安全性评价实验大动物，其与人的亲缘关系非常接近，因而在代谢上表现出较高的相似性。到目前为止，仍未见食蟹猴与人P450 3A5亚型相应的基因的克隆的报道。因此，克隆食蟹猴P450 3A5基因并进行异源表达对于体外药物筛选有重要意义。

P450酶在催化反应中需要两个电子和两个质子，其中的电子由内质网上的NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，还原型辅酶II)-细胞色素P450氧化还原酶(NADPH-cytochrome P450oxidoreductae)提供。在体外反应中，缺少NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的系统不具有催化活性。到目前为止，人及大鼠等的P450氧化还原酶基因已经被克隆，但仍未见食蟹猴P450氧化还原酶基因克隆的报道。

[发明内容]

本发明的目的在于克隆食蟹猴P450 3A5基因并在昆虫细胞中进行异源表达；还包括克隆食蟹猴NADPH-细胞色素P450氧化还原酶并在昆虫细胞中进行异源表达。

本发明通过以下方式达到克隆食蟹猴P450 3A5基因并进行异源表达的目的：根据已经发表的人P450基因序列(Genebank，AccessionNO.：NM_000777)，以逆转录自食蟹猴肝RNA的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增食蟹猴P450 3A5的编码区序列，扩增得到的PCR产物与pMD 18-T载体连接得到pT-cynoP3A5质粒。其中，设计的引物不包含除起始密码(ATG)外的食蟹猴P450 3A5的编码区序列。经测序，得到的编码区序列全长1512碱基对，编码503个氨基酸。

以上述克隆的食蟹猴P450 3A5的基因为模板，以包含RsrII及HindIII限制性内切酶位点的引物扩增食蟹猴P450 3A5的编码区序列并定向插入昆虫表达载体pFastBacl的RsrII及HindIII酶切位点之间，得到pFB-cynoP3A5表达载体。按照Bac-to-Bac BaculovirusExpression System Instruction Manual(由invitrogen公司提供)操作，在sf-9昆虫细胞中表达食蟹猴P450 3A5蛋白。异源表达的食蟹猴P450 3A5蛋白可以用作体外筛选，测试药物的代谢性质。

本发明通过以下方式达到克隆食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶并进行异源表达的的目的：根据已经发表的人NADPH-P450氧化还原酶基因序列(Genebank，Accession NO.：NM_000941)，以逆转录自食蟹猴肝RNA的cDNA为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶基因的编码区序列，扩增得到的PCR产物与pMD 18-T载体连接得到pT-cynoPOR质粒。。其中，设计的引物不包含除起始密码(ATG)外的食蟹猴P450 3A5的编码区序列。经测序，得到的编码区序列全长2034个碱基对，编码677个氨基酸。

以上述克隆的食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶基因为模板，以包含RsrII及HindIII限制性内切酶位点的引物扩增食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶的编码区序列并定向插入昆虫表达载体pFastBacl的RsrII及HindIII酶切位点之间，得到pFB-cynoPOR表达载体。按照Bac-to-Bac Baculovirus Expression System InstructionManual(由invitrogen公司提供)操作，在sf-9昆虫细胞中表达食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶。异源表达的食蟹猴NADPH-P450氧化还原酶可以用作体外筛选，测试药物的代谢性质。

本发明的有益效果在于：分离的食蟹猴P450 3A5基因可以通过基因工程的手段在多种宿主中异源表达。异源表达的蛋白仅代表3A5这一亚型，因此其代谢活性也仅反映该亚型的活性。而食蟹猴肝及其亚细胞成分虽然亦含有P450 3A5蛋白，但同时也含有其他亚型的P450蛋白，因此它们的代谢活性不能代表单一的P450 3A5亚型的活性。

此外，本发明提供同是来源于食蟹猴的P450氧化还原酶，与使用其他种属的氧化还原酶构建的体外检测系统相比，用这一氧化还原酶构建的系统显然更接近于食蟹猴体内代谢的真实情况。

[附图说明]

图1：食蟹猴P450 3A5基因的RT-PCR结果，Lane 1：MarkerDL2000；Lane 2：RT-PCR扩增产物。

图2：pFB-cynoP3A5的PCR鉴定结果，Lane 1，2，4，5：4个pFB-cynoP3A5单菌落；Lane 3：Marker DL2000。

图3：重组食蟹猴P450 3A5 Bacmid的PCR鉴定结果，Lane 1：Marker DL15000；Lane 2-4：3个转化单菌落的PCR结果。

图4：食蟹猴P450氧化还原酶的RT-PCR结果，Lane 1：MarkerDL2000；Lane 2：RT-PCR扩增产物。

图5：pFB-DU-cynoP3A5-OR重组质粒的双酶切鉴定结果，Lane 1：pFB-DU-cynoP3A5-OR重组质粒经BbsI，NsiI双酶切产物；Lane 2：Marker DL2000；Lane 3：pFB-DU-cynoP3A5-OR重组质粒经RsrII，HindIII双酶切产物。

图6：pFB-DU-cynoP3A5-OR重组bacmid的PCR鉴定结果，Lane1-4：4个pFB-DU-cynoP3A5-OR重组bacmid的PCR结果；Lane 2：MarkerDL15000。

图7：食蟹猴P450 3A5体外催化咪哒唑仑1-羟基化反应LC/MS图谱，

底物浓度：咪哒唑仑：100μM，反应条件：37℃，10min；

色谱柱：Zorbax SB-C18(2.1mm ID×100mm，3.5-Micro)；

流动相：A组成为CH₃OH/H₂O(10∶90，v/v，含0.1％HCOOH)，

B组成为CH₃OH/H₂O(90∶10，v/v，含0.1％HCOOH)；梯度(min，B％)：0，30％→0.2，30％→1.6，95％→2.6，95％→2.8，30％→4.0，30％；

采用TurboIonSpray离子源，在正离子检测方式下，选择MRM工作方式进行二级质谱分析。

[具体实施方式]

1.sf-9昆虫细胞重组表达的食蟹猴P450 3A5的代谢咪哒唑仑活性测定

按技术方案所述，用制备的含有食蟹猴P450 3A5基因的杆状病毒以MOI(multiplicity of infection)＝2感染培养到指数期的sf-9细胞，并在感染后2-3日收集细胞；

以0.1M磷酸盐缓冲液将收集的sf-9细胞匀浆；

以差速离心法分别在9000g，4℃离心20分钟及在100000g，4℃离心60分钟以制备微粒体；

将微粒体沉淀重悬，用BCA法测定蛋白含量，用一氧化碳结合法测定P450含量；

将上述微粒与系列稀释的咪哒唑仑混合物0.18mL置于反应管中，置37℃水浴保温5分钟。加20μL 10mM NADPH溶液启动反应。10分钟反应后加0.4mL含内标的反应终止液终止反应，混匀后置于冰水；

上述各反应管于2500g离心30分钟，取上清100μL加入到96孔板进样板，进行LC/MS/MS定量分析和数据处理，计算得到昆虫细胞重组表达的食蟹猴P450 3A5代谢咪哒唑仑的活性。

2.酮康唑(ketoconazole)体外抑制sf-9昆虫细胞重组表达的食蟹猴P450 3A5的活性测定

如实施例1中制备sf-9昆虫细胞重组表达的食蟹猴P450 3A5的微粒体；

将微粒体与固定浓度的睾酮以及系列稀释的酮康唑的混合物0.36mL置于反应管中，置37℃水浴保温5分钟。加40μL 10mM NADPH溶液启动反应。10分钟反应后加0.8mL含内标的反应终止液终止反应，混匀后置于冰水；

上述各反应管于2500g离心30分钟，取上清100μL加入到96孔板进样板，进行LC/MS/MS定量分析和数据处理，计算得到酮康唑抑制食蟹猴P450 3A5代谢睾酮的活性。

食蟹猴的细胞色素P450酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶

<110>中国科学院广州分院

<120>食蟹猴的细胞色素P450酶及NADPH-细胞色素P450氧化还原酶

<160>2

<210>1

<211>1512

<212>DNA

<213>食蟹猴(macaca fascicularis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1512)

<400>1

atggacctca tcccaaattt ggccatggaa acctggcttc tcctggctgt cagcctggtg 60

ctcctctatc tatacgggac ccgttcatat ggacttttta agagacaagg aattccaggg 120

cccacacctc tgcctttttt gggaaatatt ttgtcctatc gtcagggtct ctggaaattt 180

gacacagaat gttataaaaa gtatggaaaa atgtggagaa cgcaagatgg tcaactccct 240

gtgctgacca tcacagatcc cgacatgatc aaaacagtgc tagtgaaaga atgttattct 300

gtcttcacaa atcgaaggcc tttaggtcca gtgggactta tgaaaagtgc catctctata 360

gctgaggatg aagaatggaa gagaattcgg tcattgctgt ctccaacctt caccagcgga 420

aaactcaagg agatgttccc catcattgcc cagtatggag atatgttggt gagaaacttg 480

aggcgggaag cagagaaagg caagcctgtc accctgaaag acatctttgg ggcctacagc 540

atggatgtga tcactagcac atcatttgga gtaaacatcg actctctcaa caatccaaaa 600

gacccctttg tggaaagcgt taagaagttc ctaaaatttg atttcttaga tccattattt 660

ctcttaacaa tactctttcc attccttatc ccagcttttg aggcattaaa tgtctctctg 720

tttccaaaag atgccataaa ttttttaaat aaatctgtaa acagcatgaa aaaaagtcgc 780

ctcaacgaca aacaaaagca ccgagtggat ttccttcagc tgatgattga ctctcagaat 840

tcaaaagaaa ctgagtccca caaagctctg tctgatcagg agctcgtggc ccaatcaatt 900

atcttcattt ttgctggcta tgaaaccacc agcagtgttc tttccttcat tatatatgaa 960

ctggccactc accctgatgt ccagcagaaa ctgcagaagg agattgatgc agttttgccc 1020

aataaggcac ctgccactta tgatgccatg gtacagatgg agtaccttga catggtggtg 1080

aatgaaacac tcagattatt cccaattgct attagacttg agagggcctg caagaaagat 1140

gttgaaatca atggggtgtt cattcccaaa ggggcaatgg tggtgattcc aacctatgct 1200

cttcaccatg acccaaagta ctggacagag cctgaggagt tccgccctga aaggttcagt 1260

aagaagaaca aggacagcat agatccttac atatacacac cctttggaag tggacccaga 1320

aactgcattg gcatgaggtt tgctctcatg aacatgaaac ttgctataat caaagtcctt 1380

cagaacttct ccttcaaacc ttgtaaagaa acacagatcc ccttgaaatt aggcaaccaa 1440

ggccttcttc aatcagaaaa acccattgtt ctaaaggttg agtcaagaga tggaacccta 1500

agtggagaat ga                                                     1512

<210>2

<211>503

<212>PRT

<213>食蟹猴(macaca fascicularis)

<221>SIMILAR

<222>(1)...(503)

<222>本报道基因与人(homo sapiens)中的同源基因相似

<400>2

Met Asp Leu Ile Pro Asn Leu Ala Met Glu Thr Trp Leu Leu Leu Ala

1               5                   10                  15

Val Ser Leu Val Leu Leu Tyr Leu Tyr Gly Thr Arg Ser Tyr Gly Leu

            20                  25                  30

Phe Lys Arg Gln Gly Ile Pro Gly Pro Thr Pro Leu Pro Phe Leu Gly

        35                  40                  45

Asn Ile Leu Ser Tyr Arg Gln Gly Leu Trp Lys Phe Asp Thr Glu Cys

    50                  55                  60

Tyr Lys Lys Tyr Gly Lys Met Trp Arg Thr Gln Asp Gly Gln Leu Pro

65                  70                  75                  80

Val Leu Thr Ile Thr Asp Pro Asp Met Ile Lys Thr Val Leu Val Lys

                85                  90                  95

Glu Cys Tyr Ser Val Phe Thr Asn Arg Arg Pro Leu Gly Pro Val Gly

            100                 105                 110

Leu Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile Ala Glu Asp Glu Glu Trp Lys Arg

        115                 120                 125

Ile Arg Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr Ser Gly Lys Leu Lys Glu

    130                 135                 140

Met Phe Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Met Leu Val Arg Asn Leu

145                 150                 155                 160

Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gly Lys Pro Val Thr Leu Lys Asp Ile Phe

                165                 170                 175

Gly Ala Tyr Ser Met Asp Val Ile Thr Ser Thr Ser Phe Gly Val Asn

            180                 185                 190

Ile Asp Ser Leu Asn Asn Pro Lys Asp Pro Phe Val Glu Ser Val Lys

        195                 200                 205

Lys Phe Leu Lys Phe Asp Phe Leu Asp Pro Leu Phe Leu Leu Thr Ile

    210                 215                 220

Leu Phe Pro Phe Leu Ile Pro Ala Phe Glu Ala Leu Asn Val Ser Leu

225                 230                 235                 240

Phe Pro Lys Asp Ala Ile Asn Phe Leu Asn Lys Ser Val Asn Ser Met

                245                 250                 255

Lys Lys Ser Arg Leu Asn Asp Lys Gln Lys His Arg Val Asp Phe Leu

            260                 265                 270

Gln Leu Met Ile Asp Ser Gln Asn Ser Lys Glu Thr Glu Ser His Lys

        275                 280                 285

Ala Leu Ser Asp Gln Glu Leu Val Ala Gln Ser Ile Ile Phe Ile Phe

    290                 295                     300

Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ser Ser Val Leu Ser Phe Ile Ile Tyr Glu

305                 310                 315                 320

Leu Ala Thr His Pro Asp Val Gln Gln Lys Leu Gln Lys Glu Ile Asp

                325                 330                 335

Ala Val Leu Pro Asn Lys Ala Pro Ala Thr Tyr Asp Ala Met Val Gln

            340                 345                 350

Met Glu Tyr Leu Asp Met Val Val Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro

        355                 360                 365

Ile Ala Ile Arg Leu Glu Arg Ala Cys Lys Lys Asp Val Glu Ile Asn

    370                 375                 380

Gly Val Phe Ile Pro Lys Gly Ala Met Val Val Ile Pro Thr Tyr Ala

385                 390                 395                 400

Leu His His Asp Pro Lys Tyr Trp Thr Glu Pro Glu Glu Phe Arg Pro

                405                 410                 415

Glu Arg Phe Ser Lys Lys Asn Lys Asp Ser Ile Asp Pro Tyr Ile Tyr

            420                 425                 430

Thr Pro Phe Gly Ser Gly Pro Arg Asn Cys Ile Gly Met Arg Phe Ala

        435                 440                 445

Leu Met Asn Met Lys Leu Ala Ile Ile Lys Val Leu Gln Asn Phe Ser

    450                 455                 460

Phe Lys Pro Cys Lys Glu Thr Gln Ile Pro Leu Lys Leu Gly Asn Gln

465                 470                 475                 480

Gly Leu Leu Gln Ser Glu Lys Pro Ile Val Leu Lys Val Glu Ser Arg

                485                 490                 495

Asp Gly Thr Leu Ser Gly Glu

            500

atg gac ctc atc cca aat ttg gcc atg gaa acc tgg ctt ctc ctg gct gtc agc ctg gtg 60

Met Asp Leu Ile Pro Asn Leu Ala Met Glu Thr Trp Leu Leu Leu Ala Val Ser Leu Val

l               5                   10                  15                  20

ctc ctc tat cta tac ggg acc cgt tca tat gga ctt ttt aag aga caa gga att cca ggg 120

Leu Leu Tyr Leu Tyr Gly Thr Arg Ser Tyr Gly Leu Phe Lys Arg Gln Gly Ile Pro Gly

                25                  30                  35                  40

ccc aca cct ctg cct ttt ttg gga aat att ttg tcc tat cgt cag ggt ctc tgg aaa ttt 180

Pro Thr Pro Leu Pro Phe Leu Gly Asn Ile Leu Ser Tyr Arg Gln Gly Leu Trp Lys Phe

                45                  50                  55                  60

gac aca gaa tgt tat aaa aag tat gga aaa atg tgg aga acg caa gat ggt caa ctc cct 240

Asp Thr Glu Cys Tyr Lys Lys Tyr Gly Lys Met Trp Arg Thr Gln Asp Gly Gln Leu Pro

                65                  70                  75                  80

gtg ctg acc atc aca gat ccc gac atg atc aaa aca gtg cta gtg aaa gaa tgt tat tct 300

Val Leu Thr Ile Thr Asp Pro Asp Met Ile Lys Thr Val Leu Val Lys Glu Cys Tyr Ser

                85                  90                  95                  100

gtc ttc aca aat cga agg cct tta ggt cca gtg gga ctt atg aaa agt gcc atc tct ata 360

Val Phe Thr Asn Arg Arg Pro Leu Gly Pro Val Gly Leu Met Lys Ser Ala Ile Ser Ile

                105                 110                 115                 120

gct gag gat gaa gaa tgg aag aga att cgg tca ttg ctg tct cca acc ttc acc agc gga 420

Ala Glu Asp Glu Glu Trp Lys Arg Ile Arg Ser Leu Leu Ser Pro Thr Phe Thr Ser Gly

                125                 130                 135                 140

aaa ctc aag gag atg ttc ccc atc att gcc cag tat gga gat atg ttg gtg aga aac ttg 480

Lys Leu Lys Glu Met Phe Pro Ile Ile Ala Gln Tyr Gly Asp Met Leu Val Arg Asn Leu

                145                 150                 155                 160

agg cgg gaa gca gag aaa ggc aag cct gtc acc ctg aaa gac atc ttt ggg gcc tac agc 540

Arg Arg Glu Ala Glu Lys Gly Lys Pro Val Thr Leu Lys Asp Ile Phe Gly Ala Tyr Ser

                165                 170                 175                 180

atg gat gtg atc act agc aca tca ttt gga gta aac atc gac tct ctc aac aat cca aaa 600

Met Asp Val Ile Thr Ser Thr Ser Phe Gly Val Asn Ile Asp Ser Leu Asn Asn Pro Lys

                185                 190                 195                 200

gac ccc ttt gtg gaa agc gtt aag aag ttc cta aaa ttt gat ttc tta gat cca tta ttt 660

Asp Pro Phe Val Glu Ser Val Lys Lys Phe Leu Lys Phe Asp Phe Leu Asp Pro Leu Phe

                205                 210                 215                 220

ctc tta aca ata ctc ttt cca ttc ctt atc cca gct ttt gag gca tta aat gtc tct ctg 720

Leu Leu Thr Ile Leu Phe Pro Phe Leu Ile Pro Ala Phe Glu Ala Leu Asn Val Ser Leu

                225                 230                 235                 240

ttt cca aaa gat gcc ata aat ttt tta aat aaa tct gta aac agc atg aaa aaa agt cgc 780

Phe Pro Lys Asp Ala Ile Asn Phe Leu Asn Lys Ser Val Asn Ser Met Lys Lys Ser Arg

                245                 250                 255                 260

ctc aac gac aaa caa aag cac cga gtg gat ttc ctt cag ctg atg att gac tct cag aat 840

Leu Asn Asp Lys Gln Lys His Arg Val Asp Phe Leu Gln Leu Met Ile Asp Ser Gln Asn

                265                 270                 275                 280

tca aaa gaa act gag tcc cac aaa gct ctg tct gat cag gag ctc gtg gcc caa tca att 900

Ser Lys Glu Thr Glu Ser His Lys Ala Leu Ser Asp Gln Glu Leu Val Ala Gln Ser Ile

                285         290                 295                 300

atc ttc att ttt gct ggc tat gaa acc acc agc agt gtt ctt tcc ttc att ata tat gaa 960

Ile Phe Ile Phe Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ser Ser Val Leu Ser Phe Ile Ile Tyr Glu

                305                 310                 315                 320

ctg gcc act cac cct gat gtc cag cag aaa ctg cag aag gag att gat gca gtt ttg ccc 1020

Leu Ala Thr His Pro Asp Val Gln Gln Lys Leu Gln Lys Glu Ile Asp Ala Val Leu Pro

                325                 330                 335                 340

aat aag gca cct gcc act tat gat gcc atg gta cag atg gag tac ctt gac atg gtg gtg 1080

Asn Lys Ala Pro Ala Thr Tyr Asp Ala Met Val Gln Met Glu Tyr Leu Asp Met Val Val

                345                 350                 355                 360

aat gaa aca ctc aga tta ttc cca att gct att aga ctt gag agg gcc tgc aag aaa gat 1140

Asn Glu Thr Leu Arg Leu Phe Pro Ile Ala Ile Arg Leu Glu Arg Ala Cys Lys Lys Asp

                365                 370                 375                 380

gtt gaa atc aat ggg gtg ttc att ccc aaa ggg gca atg gtg gtg att cca acc tat gct 1200

Val Glu Ile Asn Gly Val Phe Ile Pro Lys Gly Ala Met Val Val Ile Pro Thr Tyr Ala

                385                 390                 395                 400

ctt cac cat gac cca aag tac tgg aca gag cct gag gag ttc cgc cct gaa agg ttc agt 1260

Leu His His Asp Pro Lys Tyr Trp Thr Glu Pro Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Ser

                405                 410                 415                 420

aag aag aac aag gac agc ata gat cct tac ata tac aca ccc ttt gga agt gga ccc aga 1320

Lys Lys Asn Lys Asp Ser Ile Asp Pro Tyr Ile Tyr Thr Pro Phe Gly Ser Gly Pro Arg

                425                 430             435                     440

aac tgc att ggc atg agg ttt gct ctc atg aac atg aaa ctt gct ata atc aaa gtc ctt 1380

Asn Cys Ile Gly Met Arg Phe Ala Leu Met Asn Met Lys Leu Ala Ile Ile Lys Val Leu

                445                 450                 455                 460

cag aac ttc tcc ttc aaa cct tgt aaa gaa aca cag atc ccc ttg aaa tta ggc aac caa 1440

Gln Asn Phe Ser Phe Lys Pro Cys Lys Glu Thr Gln Ile Pro Leu Lys Leu Gly Asn Gln

                465                 470                 475                 480

ggc ctt ctt caa tca gaa aaa ccc att gtt cta aag gtt gag tca aga gat gga acc cta 1500

Gly Leu Leu Gln Ser Glu Lys Pro Ile Val Leu Lys Val Glu Ser Arg Asp Gly Thr Leu

                485                 490                 495                 500

agt                      gga                      gaa                       tga

1512

Ser Gly Glu

<210>3

<211>2034

<212>DNA

<213>食蟹猴(macaca fascicularis)

<221>CDS

<222>(1)...(2034)

<400>3

atgggagact cccacgtgga caccagctcc accgtgtccg aggcggtggc cgaagaagta 60

tctcttttca gcatgacgga cgtgattctg ttttcagtca tcgtgggcct cctaacctac 120

tggttcctct ttagaaagaa aaaagaagaa gtccctgagt tcaccaaaat tcagacattg 180

accagctctg tcagagagag cggcttcgtg gaaaagatga agaaaacggg gaggaacatc 240

atcgtgttct acggctccca gacggggact gcagaggagt ttgccaaccg cctgtccaag 300

gacgcccacc gctatgggat gcgaggcatg tcagcggacc ccgaggagta tgacttggcg 360

gacctgagca gcctgccgga gatcgacaac gccctggtgg ttttctgcat ggccacctac 420

ggcgaggggg accccaccga caatgcccag gacttctacg actggctcca ggagacggac 480

gtggatctct ctggggtcaa gtttgcggtg tttggtcttg ggaacaaaac ctacgagcac 540

ttcaatgcca tgggcaagta cgtggacaag cggctggagc agctcggcgc ccagcgcatc 600

tttgagctgg gcttgggcga cgacgatggg aacttggagg aggacttcat cacctggcga 660

gagcagttct ggccggccgt gtgcgagcac tttggggtgg aagccactgg cgaggagtcc 720

agcattcgcc agtacgagct tgtggtccac actgacatag acgcggccaa ggtgtacgtg 780

ggggagatgg gccggctgaa gagctacgag aaccagaagc ccccctttga tgccaagaat 840

ccattcctgg ctgcagtcac caccaaccgg aagctgaacc agggaaccga gcgccacctc 900

atgcacctgg aattggacat ctcggactcc aaaatcaggt atgaatctgg ggaccacgtg 960

gctgtgtacc cagccaacga ctctgctctc gtcaaccagc tgggcaaaat cctgggtgcc 1020

gacctggacg tcgtcatgtc cctgaacaac ctggatgagg agtccaacaa gaagcaccca 1080

ttcccgtgcc ctacgtccta ccgcacggcc ctcacctact acctggacat caccaacccg 1140

ccgcgtacca acgtgctgta cgagctggcg cagtacgcct cggagccctc ggagcaggag 1200

ctgctgcgca agatggcctc ctcctccggc gagggcaagg agctgtacct gagctgggtg 1260

gtggaggccc ggaggcacat cctggccatc ctgcaggact gcccgtcctt gcggcccccc 1320

attgaccacc tgtgtgagct gctgccgcgc ctgcaggccc gctactactc catcgcctca 1380

tcctccaagg tccatcccaa ctctgtacac atctgtgcgg tggttgtgga gtacgagacc 1440

aaggccggcc gcatcaacaa gggcgtggcc accaactggc tgcgggccaa ggagcctgct 1500

ggggagaacg gcggccgcgc gctggtgccc atgttcgtgc gcaagtccca gttccgcctg 1560

cccttcaagg ccaccacacc tgtcatcatg gtgggccccg gcactggggt ggcccccttc 1620

ataggcttca tccaggagcg ggcctggctg cggcagcagg gcaaggaggt gggggagacg 1680

ctgctgtact acggctgccg ccgctcggat gaggactacc tgtaccggga ggagctggcg 1740

cagttccaca gggacggcgc gctcacccag ctcaacgtgg ccttctcccg ggagcagtcc 1800

cacaaggtct acgtccagca cctgctaaag cgggaccgag agcacctgtg gaagctgatc 1860

gaaggcggcg cccacatcta tgtctgtggg gatgcacgga acatggccag ggacgtgcag 1920

aacaccttct atgacatcgt ggctgagctc ggggccatgg agcacgccca ggccgtggac 1980

tatgtcaaga agctgatgac caagggccgc tactccctgg acgtgtggag ctag       2034

<210>4

<211>677

<212>PRT

<213>食蟹猴(macaca fascicularis)

<221>SIMILAR

<222>(1)...(677)

<222>本报道基因与人(homo sapiens)中的同源基因相似

<400>4

Met Gly Asp Ser His Val Asp Thr Ser Ser Thr Val Ser Glu Ala Val

                5                   10                  15

Ala Glu Glu Val Ser Leu Phe Ser Met Thr Asp Val Ile Leu Phe Ser

            20                  25                  30

Val Ile Val Gly Leu Leu Thr Tyr Trp Phe Leu Phe Arg Lys Lys Lys

        35                  40                  45

Glu Glu Val Pro Glu Phe Thr Lys Ile Gln Thr Leu Thr Ser Ser Val

    50                  55                  60

Arg Glu Ser Gly Phe Val Glu Lys Met Lys Lys Thr Gly Arg Asn Ile

65                  70                  75                  80

Ile Val Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Glu Phe Ala Asn

                85                  90                  95

Arg Leu Ser Lys Asp Ala His Arg Tyr Gly Met Arg Gly Met Ser Ala

            100                 105                 110

Asp Pro Glu Glu Tyr Asp Leu Ala Asp Leu Ser Ser Leu Pro Glu Ile

        115                 120                 125

Asp Asn Ala Leu Val Val Phe Cys Met Ala Thr Tyr Gly Glu Gly Asp

    130                 135                 140

Pro Thr Asp Asn Ala Gln Asp Phe Tyr Asp Trp Leu Gln Glu Thr Asp

145                 150                 155                 160

Val Asp Leu Ser Gly Val Lys Phe Ala Val Phe Gly Leu Gly Asn Lys

                165                 170                 175

Thr Tyr Glu His Phe Asn Ala Met Gly Lys Tyr Val Asp Lys Arg Leu

            180                 185                 190

Glu Gln Leu Gly Ala Gln Arg Ile Phe Glu Leu Gly Leu Gly Asp Asp

        195                 200                 205

Asp Gly Asn Leu Glu Glu Asp Phe Ile Thr Trp Arg Glu Gln Phe Trp

    210                 215                 220

Pro Ala Val Cys Glu His Phe Gly Val Glu Ala Thr Gly Glu Glu Ser

225                 230                 235                 240

Ser Ile Arg Gln Tyr Glu Leu Val Val His Thr Asp Ile Asp Ala Ala

                245                 250                 255

Lys Val Tyr Val Gly Glu Met Gly Arg Leu Lys Ser Tyr Glu Asn Gln

            260                 265                 270

Lys Pro Pro Phe Asp Ala Lys Asn Pro Phe Leu Ala Ala Val Thr Thr

        275                 280                 285

Asn Arg Lys Leu Asn Gln Gly Thr Glu Arg His Leu Met His Leu Glu

    290                 295                 300

Leu Asp Ile Ser Asp Ser Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Gly Asp His Val

305                 310                 315                 320

Ala Val Tyr Pro Ala Asn Asp Ser Ala Leu Val Asn Gln Leu Gly Lys

                325                 330                 335

Ile Leu Gly Ala Asp Leu Asp Val Val Met Ser Leu Asn Asn Leu Asp

            340                 345                 350

Glu Glu Ser Asn Lys Lys His Pro Phe Pro Cys Pro Thr Ser Tyr Arg

        355                 360                 365

Thr Ala Leu Thr Tyr Tyr Leu Asp Ile Thr Asn Pro Pro Arg Thr Asn

    370                 375                 380

Val Leu Tyr Glu Leu Ala Gln Tyr Ala Ser Glu Pro Ser Glu Gln Glu

385                 390                 395                 400

Leu Leu Arg Lys Met Ala Ser Ser Ser Gly Glu Gly Lys Glu Leu Tyr

                405                 410                 415

Leu Ser Trp Val Val Glu Ala Arg Arg His Ile Leu Ala Ile Leu Gln

            420                 425                 430

Asp Cys Pro Ser Leu Arg Pro Pro Ile Asp His Leu Cys Glu Leu Leu

        435                 440                 445

Pro Arg Leu Gln Ala Arg Tyr Tyr Ser Ile Ala Ser Ser Ser Lys Val

    450                 455                 460

His Pro Asn Ser Val His Ile Cys Ala Val Val Val Glu Tyr Glu Thr

465                 470                 475                 480

Lys Ala Gly Arg Ile Asn Lys Gly Val Ala Thr Asn Trp Leu Arg Ala

                485                 490                 495

Lys Glu Pro Ala Gly Glu Asn Gly Gly Arg Ala Leu Val Pro Met Phe

            500                 505                 510

Val Arg Lys Ser Gln Phe Arg Leu Pro Phe Lys Ala Thr Thr Pro Val

        515                 520                 525

Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Ile Gly Phe Ile

    530                 535                 540

Gln Glu Arg Ala Trp Leu Arg Gln Gln Gly Lys Glu Val Gly Glu Thr

545                 550                 555                 560

Leu Leu Tyr Tyr Gly Cys Arg Arg Ser Asp Glu Asp Tyr Leu Tyr Arg

                565                 570                 575

Glu Glu Leu Ala Gln Phe His Arg Asp Gly Ala Leu Thr Gln Leu Asn

            580                 585                 590

Val Ala Phe Ser Arg Glu Gln Ser His Lys Val Tyr Val Gln His Leu

        595                 600                 605

Leu Lys Arg Asp Arg Glu His Leu Trp Lys Leu Ile Glu Gly Gly Ala

    610                 615                 620

His Ile Tyr Val Cys Gly Asp Ala Arg Asn Met Ala Arg Asp Val Gln

625                 630                 635                 640

Asn Thr Phe Tyr Asp Ile Val Ala Glu Leu Gly Ala Met Glu His Ala

                645                 650                 655

Gln Ala Val Asp Tyr Val Lys Lys Leu Met Thr Lys Gly Arg Tyr Ser

            660                 665                 670

Leu Asp Val Trp Ser

        675

atg gga gac tcc cac gtg gac acc agc tcc acc gtg tcc gag gcg gtg gcc gaa gaa gta 60

Met Gly Asp Ser His Val Asp Thr Ser Ser Thr Val Ser Glu Ala Val Ala Glu Glu Val

                5                   10                  15                  20

tct ctt ttc agc atg acg gac gtg att ctg ttt tca gtc atc gtg ggc ctc cta acc tac 120

Ser Leu Phe Ser Met Thr Asp Val Ile Leu Phe Ser Val Ile Val Gly Leu Leu Thr Tyr

                25                  30                  35                  40

tgg ttc ctc ttt aga aag aaa aaa gaa gaa gtc cct gag ttc acc aaa att cag aca ttg 180

Trp Phe Leu Phe Arg Lys Lys Lys Glu Glu Val Pro Glu Phe Thr Lys Ile Gln Thr Leu

                45                  50                  55                  60

acc agc tct gtc aga gag agc ggc ttc gtg gaa aag atg aag aaa acg ggg agg aac atc 240

Thr Ser Ser Val Arg Glu Ser Gly Phe Val Glu Lys Met Lys Lys Thr Gly Arg Asn Ile

                65                  70              75                      80

atc gtg ttc tac ggc tcc cag acg ggg act gca gag gag ttt gcc aac cgc ctg tcc aag 300

Ile Val Phe Tyr Gly Ser Gln Thr Gly Thr Ala Glu Glu Phe Ala Asn Arg Leu Ser Lys

                85                  90                  95                  100

gac gcc cac cgc tat ggg atg cga ggc atg tca gcg gac ccc gag gag tat gac ttg gcg 360

Asp Ala His Arg Tyr Gly Met Arg Gly Met Ser Ala Asp Pro Glu Glu Tyr Asp Leu Ala

                105                 110                 115                 120

gac ctg agc agc ctg ccg gag atc gac aac gcc ctg gtg gtt ttc tgc atg gcc acc tac 420

Asp Leu Ser Ser Leu Pro Glu Ile Asp Asn Ala Leu Val Val Phe Cys Met Ala Thr Tyr

                125                 130                 135                 140

ggc gag ggg gac ccc acc gac aat gcc cag gac ttc tac gac tgg ctc cag gag acg gac 480

Gly Glu Gly Asp Pro Thr Asp Asn Ala Gln Asp Phe Tyr Asp Trp Leu Gln Glu Thr Asp

                145                 150                 155                 160

gtg gat ctc tct ggg gtc aag ttt gcg gtg ttt ggt ctt ggg aac aaa acc tac gagc ac 540

Val Asp Leu Ser Gly Val Lys Phe Ala Val Phe Gly Leu Gly Asn Lys Thr Tyr Glu His

                165                 170                 175                 180

ttc aat gcc atg ggc aag tac gtg gac aag cgg ctg gag cag ctc ggc gcc cag cgc atc 600

Phe Asn Ala Met Gly Lys Tyr Val Asp Lys Arg Leu Glu Gln Leu Gly Ala Gln Arg Ile

                185                 190                 195                 200

ttt gag ctg ggc ttg ggc gac gac gat ggg aac ttg gag gag gac ttc atc acc tgg cga 660

Phe Glu Leu Gly Leu Gly Asp Asp Asp Gly Asn Leu Glu Glu Asp Phe Ile Thr Trp Arg

                205                 210                 215                 220

gag cag ttc tgg ccg gcc gtg tgc gag cac ttt ggg gtg gaa gcc act ggc gag gag tcc 720

Glu Gln Phe Trp Pro Ala Val Cys Glu His Phe Gly Val Glu Ala Thr Gly Glu Glu Ser

                225                 230                 235                 240

agc att cgc cag tac gag ctt gtg gtc cac act gac ata gac gcg gcc aag gtg tac gtg 780

Ser Ile Arg Gln Tyr Glu Leu Val Val His Thr Asp Ile Asp Ala Ala Lys Val Tyr Val

                245                 250                 255                 260

ggg gag atg ggc cgg ctg aag agc tac gag aac cag aag ccc ccc ttt gat gcc aag aat 840

Gly Glu Met Gly Arg Leu Lys Ser Tyr Glu Asn Gln Lys Pro Pro Phe Asp Ala Lys Asn

                265                 270                 275                 280

cca ttc ctg gct gca gtc acc acc aac cgg aag ctg aac cag gga acc gag cgc cac ctc 900

Pro Phe Leu Ala Ala Val Thr Thr Asn Arg Lys Leu Asn Gln Gly Thr Glu Arg His Leu

                285                 290                 295                 300

atg cac ctg gaa ttg gac atc tcg gac tcc aaa atc agg tat gaa tct ggg gac cac gtg 960

Met His Leu Glu Leu Asp Ile Ser Asp Ser Lys Ile Arg Tyr Glu Ser Gly Asp His Val

                305                 310                 315                 320

gct gtg tac cca gcc aac gac tct gct ctc gtc aac cag ctg ggc aaa atc ctg ggt gcc 1020

Ala Val Tyr Pro Ala Asn Asp Ser Ala Leu Val Asn Gln Leu Gly Lys Ile Leu Gly Ala

                325                 330                 335                 340

gac ctg gac gtc gtc atg tcc ctg aac aac ctg gat gag gag tcc aac aag aag cac cca 1080

Asp Leu Asp Val Val Met Ser Leu Asn Asn Leu Asp Glu Glu Ser Asn Lys Lys His Pro

                345             350                     355                 360

ttc ccg tgc cct acg tcc tac cgc acg gcc ctc acc tac tac ctg gac atc acc aac ccg 1140

Phe Pro Cys Pro Thr Ser Tyr Arg Thr Ala Leu Thr Tyr Tyr Leu Asp Ile Thr Asn Pro

                365                 370                 375                 380

ccg cgt acc aac gtg ctg tac gag ctg gcg cag tac gcc tcg gag ccc tcg gag cag gag 1200

Pro Arg Thr Asn Val Leu Tyr Glu Leu Ala Gln Tyr Ala Ser Glu Pro Ser Glu Gln Glu

                385                 390                 395                 400

ctg ctg cgc aag atg gcc tcc tcc tcc ggc gag ggc aag gag ctg tac ctg agc tgg gtg 1260

Leu Leu Arg Lys Met Ala Ser Ser Ser Gly Glu Gly Lys Glu Leu Tyr Leu Ser Trp Val

                405                 410                 415                 420

gtg gag gcc cgg agg cac atc ctg gcc atc ctg cag gac tgc ccg tcc ttg cgg ccc ccc 1320

Val Glu Ala Arg Arg His Ile Leu Ala Ile Leu Gln Asp Cys Pro Ser Leu Arg Pro Pro

                425                 430                 435                 440

att gac cac ctg tgt gag ctg ctg ccg cgc ctg cag gcc cgc tac tac tcc atc gcc tca 1380

Ile Asp His Leu Cys Glu Leu Leu Pro Arg Leu Gln Ala Arg Tyr Tyr Ser Ile Ala Ser

  4             45                  450                 455                 460

tcc tcc aag gtc cat ccc aac tct gta cac atc tgt gcg gtg gtt gtg gag tac gag acc 1440

Ser Ser Lys Val His Pro Asn Ser Val His Ile Cys Ala Val Val Val Glu Tyr Glu Thr

  4             65                  470                 475                 480

aag gcc ggc cgc atc aac aag ggc gtg gcc acc aac tgg ctg cgg gcc aag gag cct gct 1500

Lys Ala Gly Arg Ile Asn Lys Gly Val Ala Thr Asn Trp Leu Arg Ala Lys Glu Pro Ala

                485                 490                 495                 500

ggg gag aac ggc ggc cgc gcg ctg gtg ccc atg ttc gtg cgc aag tcc cag ttc cgc ctg 1560

Gly Glu Asn Gly Gly Arg Ala Leu Val Pro Met Phe Val Arg Lys Ser Gln Phe Arg Leu

                505                 510                 515                 520

ccc ttc aag gcc acc aca cct gtc atc atg gtg ggc ccc ggc act ggg gtg gcc ccc ttc 1620

Pro Phe Lys Ala Thr Thr Pro Val Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe

                525                 530                 535                 540

ata ggc ttc atc cag gag cgg gcc tgg ctg cgg cag cag ggc aag gag gtg ggg gag acg 1680

Ile Gly Phe Ile Gln Glu Arg Ala Trp Leu Arg Gln Gln Gly Lys Glu Val Gly Glu Thr

                545                 550                 555                 560

ctg ctg tac tac ggc tgc cgc cgc tcg gat gag gac tac ctg tac cgg gag gag ctg gcg 1740

Leu Leu Tyr Tyr Gly Cys Arg Arg Ser Asp Glu Asp Tyr Leu Tyr Arg Glu Glu Leu Ala

                565                 570                 575                 580

cag ttc cac agg gac ggc gcg ctc acc cag ctc aac gtg gcc ttc tcc cgg gag cag tcc 1800

Gln Phe His Arg Asp Gly Ala Leu Thr Gln Leu Asn Val Ala Phe Ser Arg Glu Gln Ser

                585                 590                 595                 600

cac aag gtc tac gtc cag cac ctg cta aag cgg gac cga gag cac ctg tgg aag ctg atc 1860

His Lys Val Tyr Val Gln His Leu Leu Lys Arg Asp Arg Glu His Leu Trp Lys Leu Ile

                605                 610                 615                 620

gaa ggc ggc gcc cac atc tat gtc tgt ggg gat gca cgg aac atg gcc agg gac gtg cag 1920

Glu Gly Gly Ala His Ile Tyr Val Cys Gly Asp Ala Arg Asn Met Ala Arg Asp Val Gln

                625                 630                 635                 640

aac acc ttc tat gac atc gtg gct gag ctc ggg gcc atg gag cac gcc cag gcc gtg gac 1980

Asn Thr Phe Tyr Asp Ile Val Ala Glu Leu Gly Ala Met Glu His Ala Gln Ala Val Asp

                645                 650                 655                 660

tat gtc aag aag ctg atg acc aag ggc cgc tac tcc ctg gac gtg tgg agc tag         2034

Tyr Val Lys Lys Leu Met Thr Lys Gly Arg Tyr Ser Leu Asp Val Trp Ser

                665                 670                 675