弱疏水骨架酰胺树脂合成及在银杏总内酯纯化中的应用

摘要

本发明根据银杏提取物中黄酮和内酯的结构特征，合成了一种弱疏水骨架的酰胺吸附树脂。其合成包括，丙烯酸甲酯及二乙烯苯共聚得到含酯基树脂，将酯基氨解后酰化得到弱疏水骨架酰胺树脂。利用该树脂的弱疏水性和氢键的协同作用可将银杏提取物中的黄酮类化合物吸附到树脂上，而银杏内酯单靠疏水作用难以被树脂吸附，所以随流出液流出。流出液中的内酯可以通过简单的重结晶析出。本发明工艺简单、环境友好、避免了现有分离工艺中使用大量强毒性、易挥发、易燃的有机溶剂且分离工艺烦琐的缺陷。只需吸附一步，即可达到银杏叶提取物中黄酮和内酯两种有效成分的完全分离，制备出纯度为90％以上的总内酯，可为进一步的银杏内酯药用开发提供大量试验样品。

说明书

【技术领域】

本发明属于中药有效成分的提取和分离技术领域，特别涉及一种具有弱疏水骨架的氢键吸附树脂的制备方法，并建立吸附-洗脱一步法树脂提取工艺，制备纯度高于90％的银杏总内酯。

【背景技术】

银杏内酯是银杏提取物中的有效成分之一，它是银杏叶中独有的具有特殊分子结构和显著药理活性的成分，是一种有效的PAF(血小板聚集诱导剂)天然拮抗剂，还可以具有提高SOD活性、消除自由基、延缓衰老的作用。近年来国内外对银杏内酯的提取与纯化开展了大量卓有成效的工作。现有的提取方法有有机溶剂萃取法和柱色谱法，溶剂萃取法的工艺过程繁琐、操作步骤多，溶剂的损失也比较大，不太适宜于工业化生产。黄酮类化合物是银杏提取物中的主要成分，所以除去黄酮是得到高纯度内酯的重要步骤。柱提取一般采用多柱法，填料聚酰胺一般是黄酮优良吸附剂，但聚酰胺的再生困难。活性炭柱脱除有色杂质，但其回收率很低。经溶剂萃取-柱纯化的提取工艺后，虽然得到内酯纯度很高的产品，但经过较多的纯化步骤萜内酯的损耗也较大。【韩金玉，颜迎春等，银杏萜内酯提取与纯化技术，中草药，2002年第33卷第11期】吸附树脂法近年来成为天然产物有效成分提取和分离的一种更经济更简便的方法。银杏提取物中的两类主要有效成分黄酮(见式1)和内酯(见式2、式3)都具有疏水骨架，目前现有树脂都是基于疏水性聚苯乙烯，所以难于将黄酮和内酯分离。史作清等利用改性天然大分子化合物固体吸附剂可以从银杏提取物中得到35％纯度的银杏内酯【改性天然大分子化合物吸附剂及其应用，许名成，史作清等，99100348.9，1999】。但是这种凝胶型的树脂在水中处于高溶胀状态，强度很差，在酒精中会收缩，在实际的柱操作过程会造成树脂的破裂。如何利用简便的吸附树脂法得到高纯度内酯仍然是目前研究的热点。

R₁＝H，山奈酚衍生物

R₁＝OH，槲皮素衍生物

R₁＝OCH₃，异鼠李素衍生物

式1、银杏黄酮的分子结构

式2、白果内酯的分子结构    式3、银杏内酯的分子结构。

【发明内容】

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种具有弱疏水骨架的氢键吸附树脂的制备方法，并建立吸附-洗脱一步法树脂提取工艺，制备纯度高于90％的银杏总内酯。

本发明为实现上述目的公开了一种弱疏水骨架的氢键吸附树脂，即酰胺树脂，该树脂的制备方法包括：

第一、在常温下，将分散剂聚乙烯醇溶解于水中，配成质量浓度为0.5％-2％的水相；

第二、聚合反应的总单体相由丙烯酸甲酯和二乙烯苯组成，其中丙烯酸甲酯的质量份数为总单体相的80-90％，余量为二乙烯苯，同时加入质量为总单体相质量的80-100％的庚烷作为致孔剂，占总单体相质量的1-3％的偶氮二异丁氰作引发剂，将上述各组分混合均匀后，配成反应的油相；

第三、反应开始前，先将水相倒入三口瓶中，并加热至30-50℃后，将反应油相加入三口瓶中，水相和油相的体积比为2∶1-4∶1；开动搅拌，调节搅拌速度，至油滴尺寸在0.3-1.0mm后开始升温，先至60-80℃反应2-6小时，再继续升温至85℃反应6小时，停止反应，静置至室温，最后经过滤、洗涤处理后得到白色树脂；

第四、将得到的白色树脂干燥后，在三口瓶中以N，N-二甲基甲酰胺充分溶胀后，加入占白球质量95～200％的二乙烯三胺或三乙烯四胺或多乙烯多胺在120-140℃反应8-12小时后，停止反应，静置至室温，经过滤、洗涤处理后得到黄色树脂；

第五、将黄色树脂干燥后，在三口瓶中以醋酸酐充分浸泡后，升温至50-80℃反应7-10小时，停止反应，静置至室温，经过滤、洗涤后，得到本发明的树脂，命名为酰胺树脂。

本发明还公开了酰胺树脂在纯化银杏总内酯中的应用，该应用包括以下步骤：

第一、将市售银杏提取物(黄酮含量15～30％，总内酯含量5～10％)溶解在含有6～10％(v/v)乙醇的水溶液中，制得上柱液；

第二、将上述方法合成的吸附树脂装入吸附柱中，吸附柱直径与柱长的比为1∶5-1∶20；

第三、室温下，将上柱液以0.5～1.0BV/小时的流速通过树脂吸附柱，其中黄酮化合物被吸附在树脂柱上，而同时内酯从树脂柱上流出；

第四、将含有内酯的流出液浓缩，浓缩体积为上柱液体积的5％-10％，静置至室温，待析出大量结晶，过滤、重复洗涤结晶三次后，将结晶真空干燥，即得纯度为90％的总内酯。

第五、以体积百分比为60-80％的乙醇溶液洗脱树脂柱，树脂得以再生，洗脱液回收溶剂后真空干燥，得到纯度高于50％、且不含内酯的银杏黄酮样品。

本发明的有益效果是：

本发明根据银杏提取物中黄酮和内酯的结构特征，合成了一种弱疏水骨架的酰胺吸附树脂，该树脂仍然保持了传统大孔吸附树脂刚性的骨架，因而有好的使用强度，同时综合调控树脂骨架疏水部分、弱极性部分以及氢键功能基团部分的相对比例，达到了三者的最佳协同效应。利用该树脂的弱疏水性和氢键的协同作用可将银杏提取物中的黄酮类化合物吸附到树脂上，而由于树脂的疏水性很弱，银杏内酯单靠疏水作用难以被树脂吸附，所以随流出液流出。流出液中的内酯可以通过简单的重结晶析出。本发明工艺简单、环境友好、生产成本低，避免了现有分离工艺中使用大量强毒性、易挥发、易燃的有机溶剂且分离工艺烦琐的缺陷。本工艺只需吸附一步，即可达到银杏叶提取物中黄酮和内酯两种有效成分的完全分离，制备出纯度为90％以上的总内酯，可为进一步的银杏内酯药用开发提供大量试验样品。

【具体实施方式】

实施例1

本发明提供的弱疏水骨架的酰胺吸附树脂的制备方法，通过以下步骤实现：

在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成质量百分数为0.5％的水溶液450g，于1000ml三口瓶中水浴加热至40℃；以60.5g丙烯酸甲酯和14.5g二乙烯苯的混合物为总反应单体、以70g庚烷作为致孔剂、以0.75g偶氮二异丁腈为引发剂，混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠尺寸在0.3-1.0mm之间，经悬浮聚合，以1℃/min的升温速度缓慢升温至70℃反应4小时，，再继续升温至85℃反应6小时，停止反应，经过滤、洗涤处理后，得到白色树脂。

在500ml三口瓶中加入上述白色树脂100g，以400ml N，N-二甲基甲酰胺充分溶胀，加入120g二乙烯三胺，搅拌均匀后，升温至135℃反应10小时，反应完成后，经过洗涤处理后得到黄色树脂。

在250ml三口瓶中加入上述黄色树脂100g，加入200ml醋酸酐在80℃混合反应9小时，经过洗涤处理后得到肉色树脂，为本发明树脂，命名为酰胺树脂。

树脂的外观特征和结构参数为：树脂为球形，粒径0.3～1.0mm，比表面积为100～200m²/g干树脂，含水量为70～80％，平均孔径为10～30nm，孔隙率50～65％。

实施例2：

在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成质量百分数为1.0％的水溶液450g，于1000ml三口瓶中水浴加热至35℃；以64g丙烯酸甲酯和11g二乙烯苯的混合物为总反应单体、以75g庚烷作为致孔剂、以1.0g偶氮二异丁腈为引发剂，混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠尺寸在0.3-1.0mm之间，经悬浮聚合，以1℃/min的升温速度缓慢升温至65℃反应4小时，，再继续升温至85℃反应6小时，停止反应，经过滤、洗涤处理后，得到白色树脂。

在500ml三口瓶中加入上述白色树脂100g，以400mlN，N-二甲基甲酰胺充分溶胀，加入150g三乙烯四胺，搅拌均匀后，升温至125℃反应10小时，反应完成后，经过洗涤处理后得到黄色树脂。

在500ml三口瓶中加入上述黄色树脂100g，以200ml醋酸酐在70℃混合反应9小时，经过洗涤处理后得到肉色树脂，为本发明树脂，命名为酰胺树脂。

实施例3：

在常温下，将聚乙烯醇溶解于水中，配成质量百分数为1.5％的水溶液4.5kg，于10升三口瓶中水浴加热至45℃；以0.60kg丙烯酸甲酯和0.15kg二乙烯苯的混合物为反应单体、以0.68kg庚烷作为致孔剂、以0.015kg偶氮二异丁腈为引发剂，混合均匀后加入三口瓶中，开动搅拌，调节油珠尺寸在0.3-1.0mm之间，经悬浮聚合，以1℃/min的升温速度缓慢升温至60℃反应4小时，再继续升温至85℃反应6小时，停止反应，经过滤、洗涤处理后，得到白色树脂。

在5升三口瓶中加入上述白色树脂1kg，以4升N，N-二甲基甲酰胺充分溶胀，加入1kg多乙烯多胺，搅拌均匀后，升温至130℃反应10小时，反应完成后，经过洗涤处理后得到黄色树脂。

在5升三口瓶中加入上述黄色树脂2kg，以3升醋酸酐在60℃混合反应9小时，经过洗涤处理后得到得到肉色树脂，为本发明树脂，命名为酰胺树脂。

实施例4

上述吸附树脂在从银杏提取物中制备高纯度内酯中的应用，包括：

第一、将黄酮含量24％(w％)、内酯含量6％(w％)的市售银杏叶提取物溶解在含有6％～10％(v/v)乙醇水溶液中，制得上柱液，上柱液浓度为5-10mg提取物/ml；

第二、将以上制得的酰胺树脂装入吸附柱中，吸附柱直径与柱长的比为1∶5-1∶20；

第三、室温下，将上柱液以0.5-1.0BV/小时的流速通过树脂吸附柱，其中黄酮化合物被吸附在树脂柱上，而同时内酯从树脂柱上流出；

第四、将含有内酯的流出液浓缩，浓缩体积为上柱液体积的5％-10％，静置至室温，待析出大量结晶，过滤、重复洗涤结晶三次后，将结晶真空干燥，即得纯度为90％的总内酯。

第五、以60-80％(v/v)乙醇溶液洗脱树脂柱，树脂得以再生，同时将洗脱液回收溶剂，真空干燥后，得到纯度高于50％、且不含内酯的银杏黄酮样品。

实施例5

将含有黄酮含量24％(w％)、内酯含量6％(w％)的银杏提取物300mg溶解于40ml 8％(v/v)乙醇水溶液中，制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱(柱长30cm，内径18mm，装有40ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用80％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h。将流出液浓缩至5ml，静置至析出结晶，重复过滤、洗涤步骤三次后，将结晶滤出，干燥，Waters484高效液相色谱仪检测内酯纯度为93.2％。

实施例6

将含有黄酮20％(w％)、内酯含量5％(w％)的银杏提取物3g溶解于400ml 10％(v/v)乙醇水溶液，制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱(柱长40cm，内径40mm，装有400ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用80％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h。将流出液浓缩至30ml，静置至析出结晶，重复过滤、洗涤步骤三次后，将结晶滤出，干燥，Waters484高效液相色谱仪检测内酯纯度为93.8％。

实施例7

将含有黄酮24％(w％)、内酯含量6％(w％)的银杏提取物300mg溶解于50ml 7％(v/v)乙醇水溶液，制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱(柱长30cm，内径18mm，装有40ml湿树脂)，吸附速度为1BV/h，吸附完成后，用80％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h。将流出液重结晶后可得到混合内酯晶体。将流出液浓缩至5ml，，静置至析出结晶，重复过滤、洗涤步骤三次后，将结晶滤出，干燥，Waters484高效液相色谱仪检测内酯纯度为92.2％。

实施例8

将含有黄酮30％(w％)、内酯含量8％(w％)的银杏提取物3g溶解于400ml 8％(v/v)乙醇水溶液，制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱(柱长40cm，内径40mm，装有400ml湿树脂)，吸附速度为1BV/h，吸附完成后，用70％(v％)乙醇水溶液洗脱，流速为1BV/h。将流出液浓缩至40ml，静置至析出结晶，重复过滤、洗涤步骤三次后，将结晶滤出，干燥，Waters484高效液相色谱仪检测内酯纯度为92.9％。

实施例9

将含有黄酮24％(w％)、内酯含量6％(w％)的银杏提取物300mg溶解于40ml 10％(v/v)乙醇水溶液，制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱(柱长30cm，内径18mm，装有40ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用70％(v/v)乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h。将流出液浓缩至4ml，静置至析出结晶，重复过滤、洗涤步骤三次后，将结晶滤出，干燥，Waters484高效液相色谱仪检测内酯纯度为93.6％。

实施例10

将含有黄酮24％(w％)、内酯含量6％(w％)的银杏提取物200mg溶解于40ml 8％(v％)乙醇水溶液。制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱(柱长30cm，内径18mm，装有40ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用80％(v％)乙醇水溶液洗脱，流速为0.5BV/h。将流出液浓缩至4ml，静置至析出结晶，重复过滤、洗涤步骤三次后，将结晶滤出，干燥，Waters484高效液相色谱仪检测内酯纯度为91.8％。