产生肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体的工程化肿瘤归巢细胞

摘要

本发明涉及表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的肿瘤归巢细胞，特别是用编码TRAIL的腺病毒载体转导的CD34+和NK细胞。本发明的细胞可用于以静脉内方式治疗肿瘤特别是淋巴瘤。

说明书

技术领域

本发明涉及表达肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的肿瘤归巢细胞(tumor-homing cells)及其在抗肿瘤治疗中的用途。

发明背景

调节异常的细胞凋亡机制在淋巴增生疾病的发病机理和发展中起着关键作用，可导致癌细胞的存活时间比其正常寿命长并最终获得化学-辐射抗性[1]。所以，细胞凋亡途径意味着有吸引力的治疗目标，可以恢复恶性细胞凋亡敏感性或者启动细胞凋亡激动剂[2]。为了调节细胞凋亡基因和蛋白质，可设计多种策略，针对细胞凋亡的内在途径(Bcl-2、Bcl-X_L)、外在途径(DR4、DR5、FLIP)或者会聚途径(cIAP2)[3]。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)属于死亡受体配体的TNF家族[4]。

WO 97/01633公开了编码TRAIL的分离DNA序列、含有所述DNA序列的表达载体以及重组TRAIL多肽。

TRAIL与在许多癌细胞的细胞表面上表达的死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)结合[5]。将可溶性TRAIL与DR4或DR5相结合可激活半胱天冬蛋白酶(caspase)并导致细胞凋亡[6]。

Liu Zhongyu等人(J Clin Invest.Vol 112，no.9，9.11.2003，1332-1341)揭示了通过重组腺病毒与TRAIL转换的树突状细胞以及治疗关节炎的潜在医学用途。但没有提及所述细胞可能在治疗肿瘤方面的应用。

体外和体内研究均提示，由于对癌细胞具有高的特异性以及具有有效的抗肿瘤活性，可溶性重组TRAIL可能在抗肿瘤治疗中扮演关键角色[7]。事实上，TRAIL选择性诱导许多转化细胞的凋亡，而不影响正常细胞[4]。另外，将TRAIL给予小鼠，对结肠癌[8，9]、乳腺瘤[10]、骨髓瘤[11]或者神经胶质瘤[12，13]的移植瘤有明显功效。

在小鼠和非人灵长类动物身上进行的毒性研究表明，正常肝细胞和角化细胞对TRAIL的三聚体产生抗性[14，15]，而它们对非优化TRAIL制剂或者配体的抗体交联变体所诱导的细胞凋亡表现出很高的敏感度[16]。当使用高剂量TRAIL三聚体时，肝毒是否是一个主要问题仍然存在争议。

使用可溶性TRAIL的另一个限制是，在大量的各种肿瘤细胞株中观察到凋亡应答受损，需要延长培育时间或者需要采用很高剂量的可溶性TRAIL来控制细胞凋亡[17，18]。对于任何体内治疗方案，当静脉注射TRAIL之后其药物动力学状况(血浆半衰期32分钟，消除半衰期4.8小时)确定，延长暴露时间以及高浓度等情况都是不可转移的[10]。为了克服可溶性重组TRAIL和特异性目标肿瘤细胞相关的限制，现时利用不同动物模型探索了多种腺病毒介导的TRAIL基因转移方法[19，20]。

不过，基因转移方法主要取决于肿瘤的有效感染以及避免要生效的免疫清除[21]。另外，仍要解决涉及全身性注射腺病毒载体的一些安全问题[22]。例如，TRAIL的腺病毒基因转移克服了肝细胞瘤细胞凋亡应答受损的问题，但也能导致初级人肝细胞发生严重凋亡[19]。目前，基于腺病毒的基因疗法主要依赖于编码TRAIL的腺病毒在肿瘤内传递[23]。尽管有局部抗肿瘤活性，但TRAIL的肿瘤内传递却缺乏系统性抗肿瘤活性，所以没有临床价值。

已经知道，各种类型细胞偏向返回肿瘤[24]，并与产生抗癌细胞分子所需的构造体一起被载入。由于它们的归巢特性，CD34+细胞[25]和天然杀伤(NK)细胞[26]可用作抗癌分子的传送载体。

在静脉输注后，CD34+细胞表现出特异的归巢性质，包括能够永久地定居于骨髓中以及瞬时定居于肝和脾内[27-30]。这些归巢性质与粘附受体(例如CXCR-4、VLA-4、VLA-5、CD44等等)的表达密切相关，这些粘附受体与特异性配体(例如SDF-1、VCAM-1等等)相互作用，后者在位于骨髓小环境和肿瘤小环境的基质细胞上表达[31-34]。

NK细胞是淋巴细胞亚型，通过主要组织适合性复合非限制机制在针对肿瘤细胞的细胞免疫防御中起主导作用[35]。在静脉输注后，NK细胞返回骨髓基质和淋巴器官，并且在受到合适的细胞因子信号影响下渗出肿瘤部位。因此，许多机构已经寻求使用NK细胞返回肿瘤的性质以达到治疗目的[36-38]。

即使已经知道了NK细胞具有返回肿瘤的特性，但基因改造细胞能够进行一种取决于转导基因类型的应激。这种应激的结果是，当用TRAIL基因转导时，细胞可能失去原有的返回肿瘤的性质。所以，没法合理地预测成功的结果，需要进行实际试验以确认该种特别考虑的方法是否可行。

业已发现，对表达TRAIL的工程化CD34+细胞和NK细胞进行研究，能有利地达到在体内由细胞介导的抗肿瘤活性。

发明内容

根据本发明，通过腺病毒介导的基因转移将肿瘤归巢细胞改造成产生肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)。本发明的细胞能以全身性给药的方式给予，将TRAIL传送到肿瘤位置，而避免了上述提到的缺点。

所以，本发明涉及表达TRAIL的肿瘤归巢细胞和含有它们的细胞制剂。本发明还涉及所述细胞在制备用于抗癌治疗特别是治疗人淋巴瘤的细胞组合物中的用途。

在合适的启动子如CMV启动子的控制下，利用编码人TRAIL基因的复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)转导肿瘤归巢细胞可获得本发明的细胞。转导的实施可按照分子生物学家公知的方法，较佳地参照实施例公开的方法。

本发明用的术语“肿瘤归巢”细胞指的是这样的细胞，能够(1)在静脉输注后返回肿瘤组织，以及(2)表达足量的膜结合TRAIL(mTRAIL)至少持续几天。

能够从血液返回肿瘤沉积物的肿瘤归巢细胞的例子包括造血细胞，即来自用生长因子治疗的癌症病人外周血的CD34+造血细胞；来自外周血的NK细胞；通过外周血单核细胞的体外培养物获得的细胞因子诱导型杀伤细胞(CIK)；内皮细胞和内皮祖先细胞；肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)；巨噬细胞；间充质干细胞(MSC)(从外周血或人组织新鲜分离的，或者体外扩展的)；以及保留了趋肿瘤能力并改造成表达mTRAIL的人细胞株。要充分表达mTRAIL，可考虑多种方法，包括质粒和病毒载体与诸如组织特异性启动子和/或增强子等合适的可调节遗传因子联用。

特别优选的是CD34+和NK细胞。

使NK细胞与N-乙酰基半胱氨酸(10mM)一起预培养18小时，NK细胞的转导效率最佳。预培养之后，在37℃无血清条件下让NK细胞暴露于不同感染复数单位(MOI)(50至500)的Ad-TRAIL。然后加入补充了血清的培养基(RPMI-1640/FBS20％)，数小时后，向培养基加入基因激发剂(Gene Booster，1∶200)，接着再培养18小时。

除了与N-乙酰基半胱氨酸(10mM)一起预培养之外，CD34+细胞可采用相类似的条件。

采用适合肠胃外特别是适合静脉给药的载体，例如在REMINGTON’SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中记载的那些，可制备本发明的组合物。

例如，可采用的赋形剂包括对接受该组合物的个体来说无害的任何药物试剂，譬如说水、盐水、甘油和乙醇，可任选地掺合辅助物质，如湿润剂或乳化剂、缓冲液等等。合适的剂量主要取决于诸如接受治疗的受试者性别、年龄、身体状况、疾病的严重程度等因素。本领域技术人员很容易可确定合适的有效用量并可通过临床研究加以确定。治疗有效剂量一般为约10³至10¹⁵个转导细胞。当然，可通过常规实验确立其它剂量，例如根据剂量-反应曲线来测定最大可耐受剂量(MTD)或对有限数量的病人进行第I期临床研究。治疗时可采用单剂量或多剂量方案。此外，给予受试者的剂量可以是很多剂的，只要适当就可以了。本领域技术人员可以很容易确定最有效的剂量方案。

现在，通过以下实施例详细地描述本发明，更清楚和令人信服地证明了：

(i)通过表达TRAIL的腺病毒载体可在体外有效地转导CD34+干细胞和NK细胞；

(ii)转导后，这些细胞亚型在其细胞表面上瞬时地表达TRAIL；

(iii)TRAIL表达的短暂时间与大的细胞凋亡作用相关，这种作用可在与转导细胞共培养的TRAIL敏感肿瘤细胞和抗TRAIL肿瘤细胞上检测到；

(iv)给带有早期或晚期肿瘤的NOD/SCID小鼠体内注射转导细胞能大大地延长小鼠的存活时间，提示腺病毒转导的CD34+干细胞和NK细胞可作为起治疗目的的全身性传送TRAIL的有效载体。

静脉给予的效力使本发明明显优于肿瘤内传送的方案。

虽然表达mTRAIL的人细胞的体外抗肿瘤作用机理是细胞凋亡，最有可能由肿瘤细胞上mTRAIL与其关连受体之间的相互作用直接触发，但我们不知道它们的体内抗肿瘤活性机理。直接杀死肿瘤细胞可能与间接抑制生长效应关联起来，所述的效应是由嵌入肿瘤的表达TRAIL受体的非肿瘤细胞(血管、血管周围、间质以及在肿瘤发展和肿瘤细胞存活中起关键作用的其它类型细胞)凋亡引致。正在进行的实验目的在于更好地理解体内抗肿瘤活性机理，当然，本发明不限于任何有关实际观察到的活性机理的假设。

具体实施方式

实施例1-体外触发淋巴瘤细胞株凋亡，其中所述淋巴瘤细胞株与在腺病毒介导的基因转移后表达TRAIL的CD34+细胞或NK细胞共培养

本实施例评价了淋巴瘤细胞株与CD34+细胞或NK细胞共培养的作用，所述的CD34+细胞或NK细胞在经腺病毒介导的基因转移后被改造成表达TRAIL。

体外实验开始时，用表达TRAIL的腺病毒载体(Ad-TRAIL)建立CD34+细胞和NK细胞腺病毒感染的最佳条件。然后，采用PE-共轭的抗TRAIL单克隆抗体(克隆Rik-2)监测CD34+细胞和NK细胞表面上TRAIL表达的进度。最后，通过将Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞与淋巴瘤细胞株共培养来评价膜结合TRAIL诱导淋巴瘤细胞株凋亡的能力。

方法

编码人TRAIL基因的腺病毒：这些实验均采用表达自CMV启动子的编码人TRAIL基因的复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)[39]。Ad-TRAIL含有克隆至pAd5CMVK-NpA的XhoI和NotI位点的人TRAIL全编码序列。将得到的质粒和缺失E1基因的腺病毒主链序列(Ad5)转染至人胚胎肾293细胞中，分离病毒粒子并扩增以便分析TRAIL表达。通过A549空斑实验在重组腺病毒中筛选复制型感受态病毒(replication competent virus)，并对293细胞进行空斑实验以确定病毒滴度。将纯化的病毒储存在含有3％蔗糖的PBS中并保持在-80℃温度下直至使用。TRAIL基因产物在转导细胞的细胞表面上表达，可通过流式细胞术检测。

CD34+细胞的腺病毒转导：经同意后，从接受了化疗和以造血生长因子治疗的癌症病人外周血获得将要用Ad-TRAIL进行转导的CD34+细胞。通过免疫磁性技术和正向选择法(Miltenyi Biotech)自白细胞提取样品富集CD34+细胞。进行腺病毒转导时，将CD34+细胞以2×10⁶/ml的密度平铺在35mm Petri培养皿并置于1ml无血清培养基(IMDM)中，所述无血清培养基含有Ad-TRAIL母液的适当稀释液，使得最终感染复数单位(MOI)为100至1,000。在培养(37℃，5％CO₂)2小时之后，向培养基补充1ml IMDM/FBS20％，4小时后，加入Gene Booster(1∶200)。培育细胞多18小时，然后用含血清的培养基彻底洗涤(3x)细胞，最后利用直接免疫荧光法以PE-共轭的抗TRAIL抗体评价转导效率。

NK细胞的腺病毒转导：经同意后，从健康志愿者外周血获得将要用Ad-TRAIL进行转导的NK细胞。通过免疫磁性技术和正向选择法(Miltenyi Biotech)富集NK细胞。转导之前，先将NK细胞置于加入了10％FBS和N-乙酰基半胱氨酸(10mM)的RPMI-1640中培育(18小时，37℃)。进行腺病毒转导时，将NK细胞以2×10⁶/ml的密度平铺在Petri培养皿并置于1ml无血清培养基(RPMI-1640)中，所述无血清培养基含有Ad-TRAIL母液的适当稀释液，使得最终感染复数单位(MOI)为50至500。在培养(37℃，5％CO2)2小时之后，向培养基补充1ml RPMI-1640/FBS20％，4小时后，加入Gene Booster(1∶200)。培育细胞多18小时，然后用含血清的培养基彻底洗涤(3x)细胞，最后利用直接免疫荧光法以PE-共轭的抗TRAIL抗体评价转导效率。

共培养：通过共培养实验体外测试了在CD34+细胞或NK细胞膜上表达的TRAIL的细胞凋亡触发活性。简单地说，将Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞(效应细胞)与淋巴瘤细胞(目标细胞)一起培养。共培养开始后24和48小时分别评价所诱导的细胞凋亡。在这些实验中，基于效应细胞的转导效率计算效应细胞与目标细胞之比率。

结果

CD34+细胞的腺病毒转导：初步实验表明，在无血清条件(37℃)下将CD34+细胞(2×10⁶/ml)暴露于不同感染复数单位(MOI)(在100至1,000之间)的Ad-TRAIL 2小时，一致地获得了CD34+细胞的最佳转导效率。然后加入等体积含血清的培养基(IMDM/FBS 20％)，4小时后，向培养基加入Gene Booster(1∶200)，培育多18小时。最后，用含血清的培养基彻底洗涤(3x)细胞，并利用直接免疫荧光法以PE-共轭的抗TRAIL抗体评价转基因表达。

在对照细胞中检测不到背景TRAIL信号，而暴露于腺病毒的细胞则显示含有一定百分比的TRAIL阳性CD34+细胞，此百分比的增大与MOI有关。在一示范性实验中，当MOI分别是100和1000时，TRAIL阳性CD34+细胞的百分比对应为25％和84％。

当MOI为1000，表达TRAIL的CD34+细胞的平均百分比为83±8％(范围在70-95％之间，n＝5)，上述感染方案均能一致地获得一个最大基因转移效率。通过苔盼蓝(Trypan blue)染料排斥试验测得，高达1000MOI也没有影响到细胞存活率(有≥85％存活细胞)。

为了评价转基因表达的时间进程，以1000MOI转导CD34+细胞，并对其分析TRAIL表达，从转导后连续分析7天。在这些实验中，为了让CD34+细胞存活，向培养基补充低剂量(3ng/ml)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。如表1所示，有较大比例的CD34+细胞(25％)连续地表达TRAIL，直至转导后120小时。

表1-用Ad-TRAIL转导的CD34+细胞的延时基因表达

  转染后时间(小时)  24  48  72  120  168  表达TRAIL的CD34+细胞(％)  95  70  42  25  13

NK细胞的腺病毒转导：初步实验表明，将NK细胞与N-乙酰基半胱氨酸(10mM)预培育18小时，可一致地获得了NK细胞的最佳转导效率。预培育之后，在无血清条件(37℃)下将NK细胞(2×10⁶/ml)暴露于不同感染复数单位(MOI)(在50至500之间)的Ad-TRAIL 2小时。然后加入等体积含血清的培养基(RPMI-1640/FBS20％)，4小时后，向培养基补充Gene Booster(1∶200)，培育多18小时。最后，用含血清的培养基彻底洗涤(3x)细胞，并利用直接免疫荧光法以PE-共轭的抗TRAIL抗体评价转基因表达。

暴露于腺病毒的细胞显示含有一定百分比的TRAIL阳性NK细胞，此百分比的增大与MOI有关。在一示范性实验中，当MOI分别是50、100和500时，TRAIL阳性NK细胞的百分比对应为30％、45％和46％。

当MOI为100，表达TRAIL的NK细胞的平均百分比为61±18％(范围在45-84％之间，n＝4)，上述感染方案均能一致地获得一个最大基因转移效率。通过苔盼蓝染料排斥试验测得，高达100MOI也没有影响到细胞存活率(有≥85％存活细胞)。

为了评价转基因表达的时间进程，以100MOI转导NK细胞，并对其分析TRAIL表达，从转导后连续分析7天。如表2所示，转导NK细胞连续地表达TRAIL，直至转导后168小时。

表2-用Ad-TRAIL转导的NK细胞的延时基因表达

 转染后时间(小时)  24  48  72  120  168 表达TRAIL的NK细胞(％)  41  55  60  63  55

共培养：最后，我们通过将Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞(效应细胞)和肿瘤细胞株(目标细胞)共培养以评价膜结合TRAIL触发淋巴样细胞株细胞凋亡的能力。这些实验按照对可溶性TRAIL敏感度选取了两种细胞株。具体地说，这些实验采用TRAIL敏感KMS-11细胞株和抗TRAIL JVM-2细胞株。

首次暴露于腺病毒24小时后，收集按照上述感染方案的最佳条件下转导的CD34+细胞或NK细胞，彻底洗涤并与KMS-11或JVM-2细胞共培养。

以效应细胞与目标细胞之比率为0.8∶1来共培养Ad-TRAIL/CD34+细胞，在共培养24小时后检测到KMS-11细胞中有相当大比例(81％)的细胞凋亡或坏死。经过共培养48小时后，凋亡细胞的数量进一步上升(有93％细胞凋亡)。

以效应细胞与目标细胞之比率为0.6∶1来共培养Ad-TRAIL/NK细胞，在共培养24小时后检测到KMS-11细胞中有相当大比例(83％)的细胞凋亡或坏死。经过共培养48小时后，凋亡细胞的数量进一步上升(有85％细胞凋亡)。

对于TRAIL敏感KMS-11细胞株，由膜结合TRAIL导致的凋亡作用与暴露于高剂量(100ng/ml)可溶性TRAIL 24至48小时所导致的凋亡作用相类似(见表3)。但是，由于静脉输注后TRAIL的药物动力学状况((血浆半衰期32分钟，消除半衰期4.8小时)，体内无法达到连续暴露48小时或者甚至24小时(100ng/ml)。

            表3-可溶性TRAIL对KMS-11细胞的影响

  可溶性TRAIL的数量  24小时后存活细胞(％)  48小时后存活细胞(％)  0ng/ml  78  75  100ng/ml  27  2

使Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞与可溶性抗TRAIL JVM-2细胞株一起培育，进行了共培养实验。

以效应细胞与目标细胞之比率为0.8∶1来共培养Ad-TRAIL/CD34+细胞，在共培养48小时后检测到抗TRAIL JVM-2细胞中有相当大比例(51％)的细胞凋亡或坏死。

以效应细胞与目标细胞之比率为0.6∶1来共培养Ad-TRAIL/NK细胞，在共培养48小时后检测到抗TRAIL JVM-2细胞中有相当大比例(53％)的细胞凋亡或坏死。

对于抗TRAIL JVM-2细胞株，由膜结合TRAIL导致的凋亡作用远远大于暴露于高剂量(100ng/ml)可溶性TRAIL 48小时后所导致的凋亡作用(见表4)。

            表4-可溶性TRAIL对JVM-2细胞的影响

  可溶性TRAIL的数量  24小时后存活细胞(％)  48小时后存活细胞(％)  0ng/ml  87  84  100ng/ml  86  80

为了进一步研究细胞介导的TRAIL传送的细胞凋亡活性的效力，将效应细胞(Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞)与目标细胞(KMS-11细胞株)在不同效应细胞与目标细胞比率下共培养24小时。

如表5所示，当效应细胞与目标细胞之比为0.4∶1时，在共培养装置中Ad-TRAIL/CD34+细胞触发相当大比例(66％)的KMS-11细胞发生凋亡或坏死。

表5-Ad-TRAIL/CD34+细胞和KMS-11细胞共培养24小时诱导的细胞凋亡，

            其中效应细胞与目标细胞之比率递增

  CD34+/KMS-11之比率  0∶1  0.08∶1  0.4∶1  0.8∶1  剩余存活细胞(％)  71  67  34  22

如表6所示，当效应细胞与目标细胞之比为0.3∶1时，在共培养装置中Ad-TRAIL/NK细胞触发相当大比例(64％)的KMS-11细胞发生凋亡或坏死。

    表6-Ad-TRAIL/NK细胞和KMS-11细胞共培养24小时诱导的细胞凋亡，其

                    中效应细胞与目标细胞之比率递增

  NK/KMS之比率  0∶1  0.06∶1  0.3∶1  0.6∶1  剩余存活细胞(％)  66  68  36  19

实施例2-体内评价CD34+细胞或NK细胞在NOD/SCID小鼠中的抗癌活性，其中所述CD34+细胞或NK细胞在腺病毒介导的基因转移后被改造成表达TRAIL

为了研究Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞的治疗能力，用TRAIL-敏感KMS-11多发性骨髓瘤细胞株再灌注NOD/SCID小鼠。然后，给小鼠注射Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞，以小鼠存活率作为基于细胞的TRAIL传送的抗肿瘤功效的读数。

方法

评价Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞的抗肿瘤活性：向CharlesRiver(意大利，米兰)购买重20至25g 6至8周龄雌性NOD/SCID小鼠。按照本公司指引在标准实验条件下饲养这些动物。对动物实施的实验程序得到了国际肿瘤学院(Istituto Nazionale Tumori)动物实验伦理委员会的批准，并按照英国统筹委员会(United Kingdom Coordinating Committee)有关癌症研究的指引来进行。

通过静脉途径(IV)给小鼠接种KMS-11细胞(每只小鼠0.5×10⁶)。从接种肿瘤细胞之后第7天或第17天开始，连续4个星期持续每周静脉注射Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞(每只小鼠1×10⁶)进行治疗。再灌注Ad-TRAIL/CD34+细胞或Ad-TRAIL/NK细胞的平均转导效率分别是83±8％和61±18％。所以，经过4次注射后每只小鼠平均接受了3.32×10⁶个表达TRAIL的CD34+细胞和2.44×10⁶个表达TRAIL的NK细胞。每周检查两次小鼠的肿瘤外貌、体重测定值和毒性。记录每组动物的存活时间并以统计学分析法评价各组间之差异。合适的对照组动物包括：(i)仅接受注射肿瘤细胞的小鼠，(ii)接受注射肿瘤细胞加上非转导CD34+细胞或NK细胞的小鼠。

结果

Ad-TRAIL/CD34+细胞：按照两个不同的时间表(即在注射KMS-11细胞后第7天开始的早期肿瘤治疗和在第17天开始的晚期肿瘤治疗)，给接受了异种移植KMS-11细胞(每只小鼠0.5×10⁶)的小鼠每周静脉注射4次Ad-TRAIL/CD34+细胞。因为再灌注Ad-TRAIL/CD34+细胞的平均转导效率是83±8％(平均值±SD，n＝9)，所以每只小鼠经过4次注射后平均接受了3.32×10⁶个表达TRAIL的CD34+细胞。

如图1所示，仅注射了KMS-11细胞的NOD/SCID小鼠的存活中值是56天。注射野生型CD34+细胞对存活中值(56天)没有任何影响，而以Ad-TRAIL/CD34+细胞治疗早期肿瘤NOD/SCID小鼠，其存活中值是111天(P≤0.0001)。

图2所示为以Ad-TRAIL/CD34+细胞治疗晚期肿瘤的影响。仅注射了KMS-11细胞的NOD/SCID小鼠的存活中值是56天。注射野生型CD34+细胞对存活中值(56天)没有任何影响，而以Ad-TRAIL/CD34+细胞治疗晚期肿瘤，则大大地提高了存活中值(98天，P≤0.007)。

Ad-TRAIL/NK细胞：给接受了异种移植KMS-11细胞(每只小鼠0.5×10⁶)的小鼠每周静脉注射4次Ad-TRAIL/NK细胞。在注射KMS-11细胞后第7天(即肿瘤生长早期)开始再灌注NK细胞。此实验中再灌注Ad-TRAIL/NK细胞的平均转导效率是61±18％。所以每只小鼠经过4次注射后平均接受了2.44×10⁶个表达TRAIL的NK细胞。

如图3所示，仅注射了KMS-11细胞的NOD/SCID小鼠的存活中值是56天。注射野生型NK细胞对存活中值(56天)没有任何影响，而以Ad-TRAIL/NK细胞治疗早期肿瘤NOD/SCID小鼠，其存活中值则大幅提高(74天，P≤0.03)。

实施例3-CD34/Ad-TRAIL细胞抗乳癌细胞株的体外抗肿瘤活性

由于存在多种机理，包括TRAIL诱饵受体导致的TRAIL遮蔽、R1和R2受体表达的丧失、FLIP过度表达等等[40]，所以有很大比例的乳癌细胞株抵抗TRAIL诱导的细胞凋亡。我们以前得到的结果是，当抗sTRAIL淋巴瘤细胞株暴露于mTRAIL时会应答TRAIL，根据这些结果，我们研究了两种乳癌细胞株对sTRAIL和mTRAIL的敏感度。

实验评价了乳癌细胞株对sTRAIL杀伤作用的敏感度，同时评价了与CD34/Ad-TRAIL细胞一起培养的sTRAIL敏感乳癌细胞株和抗sTRAIL乳癌细胞株细胞凋亡的体外触发，并进行了比较。

实验采用两种乳癌细胞株，即MCF-7和MDA-MB-361。为了评价各细胞株对sTRAIL杀伤作用的敏感度，将肿瘤细胞(5-10×10⁴/ml)暴露于低剂量(10ng/ml)和高剂量(100ng/ml)的sTRAIL，暴露时间持续72小时。然后，通过膜联蛋白-V/碘化丙啶双重染色法来评价细胞凋亡的情况。

方法

细胞株：乳癌细胞株MCF-7和MDA-MB-361分别购自DSMZ(德国Braunschweig，EU)和ATCC(美国弗吉尼亚洲Manassas)。用聚合酶链反应定期测量细胞的支原体感染情况。用指数生长的细胞进行所有体外实验。

膜联蛋白-V表达：采用膜联蛋白V-FITC试验(PharMingen)定量分析发生早期或晚期细胞凋亡或坏死的细胞百分比。简单地说，待分析的细胞先用冻PBS洗二次，再悬于结合缓冲液(10nM HEPES，140nM NaCl，5nM CaCl2，pH 7.4)中。培育后，将0.1ml细胞悬浮液转移到5ml培养试管内并加入5microl膜联蛋白V-FITC和10microL碘化丙啶。经过涡旋操作后，使样品在室温和黑暗条件下培养15分钟。培养结束时加入0.4ml结合缓冲液，立即用流式细胞术分析细胞。

结果

为了研究与sTRAIL一起培育是否与触发细胞凋亡相关联，将MCF-7和MDA-MB-361细胞株暴露于sTRAIL(10-100ng/ml，72小时)，并以FACS分析法检测凋亡细胞和坏死细胞的百分比。如表7所示，MCF-7细胞暴露于sTRAIL在并不能诱导任何凋亡应答，而当MDA-MB-361细胞暴露于100ng/ml sTRAIL 72小时则导致发生明显的细胞死亡应答。根据这些结果，MCF-7是抗sTRAIL细胞株，而MDA-MB-361是sTRAIL敏感细胞株。

         表7-乳癌细胞株对sTRAIL的敏感度

  细胞株  表型  sTRAIL(ng/ml)  0  10  100  凋亡细胞+坏死细胞(％)  MCF-7  MDA-MB-361  BC  BC  10  6  9  9  13  46

接着，评价了与CD34+细胞共培养的乳癌细胞株凋亡的体外触发，其中所述CD34+细胞经过腺病毒介导的基因转移后表达TRAIL(CD34/Ad-TRAIL)。

方法

编码人TRAIL基因的腺病毒：这些实验采用表达自CMV启动子的编码人TRAIL基因的复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)[39]。Ad-TRAIL含有克隆至pAd5CMVK-NpA的XhoI和NotI位点的人TRAIL全编码序列。将得到的质粒和缺失E1基因的腺病毒主链序列(Ad5)转染至人胚胎肾293细胞中，分离出病毒粒子并扩增以便分析TRAIL表达。通过A549空斑实验在重组腺病毒中筛选复制型感受态病毒，并对293细胞进行空斑实验以确定病毒滴度。将纯化的病毒储存在含有3％蔗糖的PBS中并保持在-80℃温度下直至使用。TRAIL基因产物在转导细胞的细胞表面上表达，可通过流式细胞术检测。

CD34+细胞的腺病毒转导：经同意后，从接受了化疗和以造血生长因子治疗的癌症病人外周血获得将要用Ad-TRAIL进行转导的CD34+细胞。通过免疫磁性技术和正向选择法(Miltenyi Biotech)自白细胞提取样品富集CD34+细胞。进行腺病毒转导时，将CD34+细胞以2×10⁶/ml的密度平铺在35mm Petri培养皿并置于1ml无血清培养基(IMDM)中，所述无血清培养基含有Ad-TRAIL母液的适当稀释液，使得最终感染复数单位(MOI)为500。在培养(37℃，5％CO₂)2小时之后，向培养基补充1ml IMDM/FBS20％，4小时后，加入Gene Booster(1∶200)。培育细胞多18小时，然后用含血清的培养基彻底洗涤(3x)细胞，最后利用直接免疫荧光法以PE-共轭的抗TRAIL抗体评价转导效率。

共培养：通过共培养实验体外测试了mTRAIL的细胞凋亡触发活性。简单地说，将CD34+/Ad-TRAIL细胞(效应细胞)与乳癌细胞(目标细胞)一起培养。共培养开始后48小时评价所诱导的细胞凋亡。在这些实验中，效应细胞与目标细胞之比率为1∶1和4∶1。

结果

CD34+细胞的腺病毒转导：在无血清条件(37℃)下将CD34+细胞(2×10⁶/ml)暴露于感染复数单位(MOI)为500的Ad-TRAIL 2小时，一致地获得了CD34+细胞的最佳转导效率。在对照细胞中检测不到背景TRAIL信号，而表达TRAIL的细胞却含有93±8％(平均值±SD)的TRAIL阳性CD34+细胞。经苔盼蓝染料排斥试验测得，高达1000MOI也没有影响到细胞存活率(有≥85％存活细胞)。

共培养：我们通过将CD34/Ad-TRAIL细胞(效应细胞)和肿瘤细胞株(目标细胞)共培养以评价mTRAIL触发乳癌细胞株细胞凋亡的能力。将CD34/Ad-TRAIL细胞与腺病毒进行首次暴露，24小时后收集这些细胞，彻底洗涤并与MCF-7或MDA-MB-361细胞共培养。这些实验采用两种比率的效应细胞与目标细胞，分别为1∶1和4∶1。实验结果见表8。

        表8-mTRAIL对乳癌细胞株的杀癌作用

  细胞株  培养条件 凋亡+坏死  MDA-MB-361  对照  CD34/Ad-TRAIL(E∶T比率＝1∶1)  CD34/Ad-TRAIL(E∶T比率＝4∶1)  CD34/Ad-Mock(E∶T比率＝1∶1)  CD34/Ad-Mock(E∶T比率＝5∶1)  Ad-TRAIL 10⁶pfu  6  28  50  12  19  6  MCF-7  对照  CD34/Ad-TRAIL(E∶T比率＝1∶1)  CD34/Ad-TRAIL(E∶T比率＝4∶1)  CD34/Ad-Mock(E∶T比率＝1∶1)  5  17  64  21

  CD34/Ad-Mock(E∶T比率＝4∶1)  Ad-TRAIL 10⁶pfu  22  9

E∶T比率为效应细胞与目标细胞之比率

Mock为模拟物

将CD34/Ad-TRAIL细胞与sTRAIL敏感MDA-MB-361细胞以1∶1E∶T比率(细胞死亡率＝28％)和4∶1E∶T比率(细胞死亡率＝50％)共培养48小时，检测到相当大比例的细胞死亡。

对于sTRAIL敏感MDA-MB-361细胞株，暴露于mTRAIL 48小时导致的凋亡作用与暴露于高剂量(100ng/ml)sTRAIL 72小时所导致的凋亡作用相类似(见表7)。

为了证实CD34/Ad-TRAIL的细胞毒性作用确实是由mTRAIL所引致的，将MDA-MB-361细胞与模拟物转导(mock-transduced)的CD34+细胞共培养。如表2所示，MDA-MB-361细胞与模拟物转导的CD34+细胞共培养，只有在最高E∶T比率的情况下检测到中度细胞死亡效应。这种中度细胞死亡的发生可能与培养物过多和压迫有关。

在用Ad-TRAIL感染CD34结束时没有洗去的自由腺病毒粒子有可能导致CD34/Ad-TRAIL产生细胞死亡活性，为了消除这种可能性，将MDA-MB-361细胞暴露于10⁶个空斑形成单位(pfu)。将MDA-MB-361细胞暴露于10⁶个病毒粒子可能检测不到细胞毒性的证据(表8)。

按以下方法计算pfu数目。

为了感染MOI为500的5×10⁵CD34+细胞，我们采用250×10⁶pfu，它们被加在1ml CD34+细胞悬液中。

感染结束时，用培养基洗涤(3x)CD34+细胞。每次洗涤程序的稀释因子都是1∶20，即将悬液培养基稀释至少8000倍。

假设洗涤程序结束时悬液培养基中仍含有250×10⁶pfu，将它们稀释8000倍，即预期有少于50,000残留pfu将要加到共培养物中。

所以，为了消除由没有被洗去的自由腺病毒粒子导致的在共培养物中检测到的细胞死亡活性，将乳癌细胞株暴露于大量pfu，其数目相等于残留pfu乘以20的理论值(即50,000×20＝10⁶pfu(见#3)。

然后，使CD34/Ad-TRAIL细胞与抗sTRAIL MCF-7细胞株一起培育，进行共培养实验。在这些实验中，CD34/Ad-TRAIL细胞与抗sTRAIL MCF-7细胞以4∶1E∶T比率共培养48小时，检测到有相当大比例的细胞发生死亡(细胞死亡率为64％)，而在1∶1E∶T比率的情况下则检测不到任何细胞死亡。

对于抗sTRAIL MCF-7细胞株，暴露于mTRAIL 48小时导致的凋亡作用远远大于暴露于高剂量(100ng/ml)sTRAIL 72小时所产生的凋亡作用(见表7和8)。

为了证实CD34/Ad-TRAIL的细胞毒性作用确实是由mTRAIL所引致的，将MCF-7细胞与模拟物转导的CD34+细胞共培养。如表8所示，MCF-7细胞与模拟物转导的CD34+细胞共培养，发生中度细胞死亡效应。这种中度细胞死亡的发生可能与培养物过多和压迫有关。

在用Ad-TRAIL感染CD34结束时没有洗去的自由腺病毒粒子有可能导致CD34/Ad-TRAIL产生细胞死亡活性，为了消除这种可能性，将MCF-7细胞暴露于10⁶pfu。将MCF-7细胞暴露于10⁶pfu可能检测不到细胞毒性的证据(表8)。

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