麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞周期基因药物中的应用

摘要

本发明靶细胞周期基因芯片用于研究与细胞周期调控相关的120条基因，经运用基因芯片技术研究显示，将H

说明书

一、技术领域

本发明涉及麦冬皂苷D在制药中的新用途，具体地说是涉及麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞周期基因药物中的应用，属中药技术领域。

二、背景技术

1.麦冬通过保护血管内皮细胞来完成养阴行血之功效

麦冬为临床滋养阴液的常用之品，是养阴生津的代表药物之一。麦冬，百合科植物麦冬Ophiogon japonicus(Thumb.)Ker-Gawl.的干燥块根。主要含多种糖甙：麦门冬皂苷B、D，23，24二羟基罗斯考皂苷，麦冬甙元-3-O-a-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖甙，甲基麦冬黄烷酮A、B，麦冬黄烷酮A、B，6-醛基异麦冬黄烷酮A、B，麦冬甙元，丙三醇以及β-谷甾醇、豆甾醇。另含挥发油，从中分得长叶烯、α-广藿香烯、β-广藿香烯、香附子烯、愈创奥烯、α-律草烯、樟脑、芳樟醇等成分。麦冬始载于《神农本草经》，味甘、微苦，性微寒，归肺、胃、心经。具有养阴生津、润肺清心的功效。

前期研究发现养阴代表中药麦冬的药物血清胚层有效部位群/组分/成分，具有不同程度的保护血管内皮细胞的作用，其中正丁醇部位的药效作用更为显著，以标准品麦冬皂苷D为对照进行高效液相分析发现，其中含有麦冬皂苷D成分。

2.麦冬皂苷D的研究进展

沿阶草属麦冬主产于四川绵阳，三台和浙江慈溪，萧山等地。杭麦冬与川麦冬的总皂苷的含量差异与栽培年限相关，杭麦冬生长周期为2～3年，川麦冬的栽培期为1年。不同产地麦冬的单体成分麦冬皂苷B、D含量也有较大差别，杭麦冬主含麦冬皂苷B、含少量皂苷D；而川麦冬主含麦冬皂苷D、含少量皂苷B。

研究发现麦冬皂苷D可显著抑制静脉血栓模型大鼠早期外周血中性粒细胞活化、粘附；减轻血栓重量；降低血清sICAM-1含量；其副作用低；麦冬皂苷D还可下调大鼠静脉血栓部位TF蛋白表达，并抑制MAPKp38和JNK磷酸化，提示麦冬皂苷D可通过影响上述信号通路，降低炎症反应，抑制血栓形成。另麦冬皂苷有显著性的抗炎作用，鲁斯可皂苷元和麦冬皂苷D为其中的两种活性成分。

同种不同产地样品中麦冬皂苷D的含量有较大差别，浙江产麦冬含量较低，四川产麦冬含量较高。对浙江产麦冬、四川产麦冬不同批次样品测定，发现麦冬皂苷D的含量差别较大，且同一产地浙江产麦冬中麦冬皂苷D的含量相差更大。生长年限对麦冬皂苷D的含量有一定的影响，年限长，含量略有增加。因此麦冬皂苷D含量的高低仅仅可作为川麦冬质量指标，而不适合作为浙麦冬质量的指标。

由于皂苷为一类极性较大，结构复杂的化合物，它无紫外吸收，无专一显色剂，再加上麦冬皂苷测定经常受糖的干扰，若采用紫外检测末端吸收法，则灵敏度低，且有干扰峰，无法使用。因此，我们采用比色法测定麦冬总皂苷含量为0.2855％，利用HPLC-ELSD法测定麦冬皂苷D的含量为0.03229％。为进一步获取其内在成分的信息，我们进行了ESI-TOF-MS测试，以ESI正离子为麦冬皂苷主要电离方式，乙腈-水梯度洗脱，205nm为检测波长提取紫外色谱图，确定35.52min为麦冬皂苷D，其裂解方式为先脱去与岩藻糖(1→2)连接的鼠李糖及(1→3)连接的木糖，后脱去岩藻糖。采用两种测试方法全面综合分析麦冬皂苷D。

3.麦冬皂苷D的提取分离

取5~10目麦冬药粉，加10倍量70％乙醇，热回流提取3次，每次2h。合并提取液，减压浓缩至无醇味。然后，将其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振摇提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水层。将水层继续用3倍量正丁醇振摇提取3次，得到正丁醇提取物和水层，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振摇提取2次，弃去0.1mol/L NaOH。将正丁醇提取物进行大孔树脂柱洗脱，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脱，分别得到相应的洗脱物。60％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱，水饱和正丁醇洗脱，得到麦冬皂苷D。

三、发明内容

本发明的目的在于提供麦冬皂苷D在制药中的新用途，具体地说是提供麦冬皂苷D在制备调控血管内皮细胞周期基因药物中的应用。

保护血管内皮细胞是防治心脑血管病症的重要环节

血管内皮细胞(vascular endothelial cell，简称VEC)能合成多种血管活性物质，对血管的舒缩功能与血液的流动性有着不可替代的调节作用。血管内皮并非单纯的衬里，它有着活跃的生理功能。如对凝血和抗凝；纤溶抗纤溶；血小板聚集和抗聚集；白细胞粘附和抗粘附；血管舒缩以及平滑肌细胞间的调控(促增殖和抗增殖)都处于动态平衡状态，一旦受到损伤则失去平衡，有的学者称之为内皮功能障碍(Endothelial dysfunction)，是促进形成早期动脉粥样硬化的始动因素，也是目前研究的热点。VEC生理功能的动态平衡是维持血行正常的重要条件。因此，当VEC受到损伤时，不仅自身的生理功能被破坏，而且还会激活多种凝血和促凝因子，致使血液成分改变和粘度增高，导致血液速度减慢或出现旋涡，从而易于产生血瘀。VEC可因诸多因素受损，主要包括自由基、炎症介质、内毒素等。这些致病因素作用于VEC，可直接加速其凋亡而引起功能失衡，最终引起促栓作用形成微血栓而引发、加重心脑血管疾病。可见，VEC损伤心脑血管疾病中占有非常重要的地位。所以改善和保护血管内皮细胞形态及功能的完整性，是预防和治疗心脑血管疾病的重要着眼点。

本发明运用基因芯片技术，将H₂O₂损伤人脐静脉血管内皮细胞可以上调48条细胞周期基因：G1期与G1/S过渡期基因、S期与DNA复制基因、G2期与G2/M过渡期基因、M期基因、细胞周期检测和细胞周期停滞基因、细胞周期调节基因和细胞周期负调节基因。而麦冬皂苷D能下调上述的39条基因以及其它的15条基因。H₂O₂可以下调的细胞周期基因只有一条G2期与G2/M过渡期基因HERC5，而麦冬皂苷D恰恰可以上调该条基因的表达，从而达到保护血管内皮细胞形态及功能的完整性。

四、具体实施方式

实施例：麦冬皂苷D调控血管内皮细胞周期基因的研究

从中药材麦冬提取分离的有效成分麦冬皂苷D对人脐静脉血管内皮细胞有抗H₂O₂所致凋亡的作用。本发明运用基因芯片技术，针对细胞周期相关基因，发现了麦冬皂苷D所调控的血管内皮细胞基因表达谱。

1材料与方法

1.1主要试剂、仪器：RPMI-1640培养基(GIBCO，USA)(每升含20％小牛血清、L-谷氨酰胺0.33mg、青霉素100u、链霉素100u、pH-7.4)；消化剂为0.25％胰蛋白酶(MERCK，USA)；四川绵阳产麦冬，购自南京市药材公司，经南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定为Ophiopogon japonicus.(L.f.)Ker-Gawl.的块根。

RNA抽提试剂：TRIZOL^试剂(Invitrogen life technologies)，氯仿，异丙醇，75％乙醇(以DEPC处理的水配制)，无RNA酶的水，无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)。

RNA质量检测试剂：TE：10mM Tris-HCl pH 8，1mM EDTA，0.4M MOPS，pH 7.0，0.1M乙酸钠，0.01M EDTA，甲醛，甲醛上样染液(ambion)，溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)，琼脂糖。

cRNA标记与合成试剂：TrueLabeling-AMP^TM线性RNA扩增试剂盒(cDNA合成：G1：TrueLabeling引物，RI：RNA酶抑制剂，G2：cDNA合成酶混合液，G3：5× cDNA合成缓冲液，H2O：除RNA酶的H2O。RNA线性扩增以及cRNA合成：G4：2.5× RNA扩增缓冲液，G5：扩增酶类混合液)。Biotin-16-dUTP(Roche Cat.No.1-093-070)，SuperArray ArrayGrade cRNA纯化试剂盒。

芯片杂交试剂：Oligo GEArray^芯片Human Celll Cycle Microarray：OHS-020(美国SuperArray公司提供)，20× SSC：(900ml H2O中溶解175.3g的NaCl和88.2g的二水柠檬酸钠，用1M的HCl调节pH到7.0，加水至1L)，20％SDS：(1L H2O中溶解200g十二烷基磺酸钠)。

化学发光检测试剂：化学发光检测试剂盒Chemiluminescent DetectionKit(SuperArray Bioscience，Catalog Number D-01)，GEA封闭液Q，5×缓冲液F，AP，缓冲液G，CDP-Star化学发光底物。

1.2麦冬皂苷D的提取分离：取5~10目麦冬药粉，加10倍量70％乙醇，热回流提取3次，每次2h。合并提取液，减压浓缩至无醇味。然后，将其溶于1000mL水中，用3倍量乙酸乙酯振摇提取3次，得到乙酸乙酯提取物和水层。将水层继续用3倍量正丁醇振摇提取3次，得到正丁醇提取物和水层，合并正丁醇液，用0.1mol/L NaOH振摇提取2次，弃去0.1mol/L NaOH。将正丁醇提取物进行大孔树脂柱洗脱，依次用水、10％乙醇、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇和乙醇梯度洗脱，分别得到相应的洗脱物。60％乙醇洗脱物经硅胶柱色谱，水饱和正丁醇洗脱，得到麦冬皂苷D。

1.3药物分组：分为对照组、造模组(100umolH₂O₂)和麦冬皂苷D组(100umolH₂O₂+1.29ug/ml麦冬皂苷D)。

1.4血管内皮细胞的培养：无菌条件下取胎龄为37~40wk的新生儿脐带(长约30~50cm)，排尽残血，剪去钳夹部分，投入灭菌保存液(0.14mol/L NaCl、4mmol/L KCl、15mmol/L Hepse、11mmol/L葡萄糖、pH7.3)中，4℃保存。然后用D-Hanks液(pH 7.3~7.4)反复灌洗脐静脉，直至将余血冲洗干净。向静脉内注入0.25％的胰蛋白酶5~10ml，在37℃下孵育10min。收集脐静脉腔内的消化液，此后迅速注入适量(5ml)含20％小牛血清的培养液以终止酶消化作用并收集入刻度离心管中。收集细胞的全过程应在两分钟内完成。室温下1000rpm，离心10分钟，倒尽上清液，吸取1ml培养液于离心管中，吹打成悬液，用0.4％台酚蓝染色少量细胞悬液。计数活细胞在95％以上，再加入20％RPMI-1640培养基，调整细胞浓度为5×10⁷·L^-1，将此浓度的原代HUVEC移入细胞培养瓶中进行培养。置于5％CO₂培养箱内培养。第1个24h更换培养液的1/2，以后每隔24h换液1次。根据相差显微镜下细胞呈单层鹅卵石样排列、免疫细胞化学法染色细胞第VIII因子相关抗原呈阳性，确定培养细胞为内皮细胞。

1.5 RNA抽提

a.匀浆：直接在3.5cm直径的培养盘中加入1ml TRIZOL试剂裂解细胞，裂解时用枪吸打几次。加入TRIZOL试剂的量取决于培养盘的面积(每10cm2加1ml)而不是培养细胞的数量。

b.两相分离：匀浆后样品于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每1ml的TRIZOL试剂匀浆的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中。水相的体积大约使匀浆时加入的TRIZOL试剂的60％。

c.RNA沉淀：将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入1ml TRIZOL试剂的此时加0.5ml的异丙醇。混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃ 12,000×g离心10分钟。

d.RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃7,500×g离心5分钟。

e.重新溶解RNA沉淀：去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟。溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟。获得的RNA溶液保存于-70℃。

1.6 RNA质量检测

a.紫外吸收测定法：取少量液体用TE稀释(一般1∶100稀释)后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，可以测定RNA溶液浓度和纯度。用来稀释的TE不需要经过无RNA酶处理，因为RNA的微量降解不会明显影响分光光度计的读值。测量前需先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。浓度测定在A260下读值为1表示40μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。RNA溶液的A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围1.8到2.1。

b.变性琼脂糖凝胶电泳：制胶：1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10× MOPS电泳缓冲液(0.4M MOPS，pH 7.0，0.1M乙酸钠，0.01MEDTA)和18ml的37％甲醛溶液(12.3M)。灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1× MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。取3μg RNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。上样于胶孔中，5-6V/cm电压下电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。

紫外透射光下观察并拍照。

1.7 cRNA标记与合成

a.cDNA合成：先配制退火混合液：每个RNA样品均如下配制于一个灭菌的PCR管中：0.1-3.0μg总RNA，1.0μl G1，加去RNA酶的H2O至总体积为10μl。用移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。70℃水浴10min后立刻放于冰中。再配制cDNA合成混合液，在离心管中依次加入，按每张芯片4μl除RNA酶的H2O，4μl 5× cDNA合成缓冲液(G3)，1μl RNA酶抑制剂(RI)，1μl cDNA合成酶混合液(G2)，总体积10μl。用移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。置于冰上待用。cDNA合成反应：每10μl退火混合液中加入10μl的cDNA合成混合液。移液枪轻轻吸打几次混合均匀，稍微离心使液体聚集于管底。42℃水浴50分钟。短暂离心(约2秒)使液体聚集于管底。然后进行cRNA合成步骤或-20℃保存过夜。

b.cRNA合成，标记和扩增：先配制扩增混合液：试剂盒中所有管溶解后离心溶液至管底，置冰中待用。在离心管中依次加入扩增混合液：按每张芯片：16μl 2.5× RNA扩增缓冲液(G4)，2μl Biotin-16-UTP(Roche or ENZO)，2μl扩增酶类混合液(G5)，总体积为20μl。分别加入20μl扩增混合液。吸打混匀并离心至管底。37℃水浴4小时以上。

c.cRNA纯化：使用SuperArray ArrayGrade cRNA纯化试剂盒(货号：GA-012)。按步骤配制cRNA样品，将cRNA结合至纯化柱上，清洗纯化柱，再将cRNA从纯化柱中洗脱。

d.质量控制：取499μl的TE(pH 8.0)至比色管中，确认管壁无气泡。比色管放入紫外分光光度计，调零。在比色管中直接加入1μl cRNA，吸打混合均匀。读出其在230，260和280nm的吸光率。取出比色管，弃去液体，洗干净凉干。计算浓度：A260×40×500(稀释倍数)＝样品浓度(μg/ml)。计算260/280和260/230比值以确定样品纯度。纯化的样品具有如下比值：RNA的260/280比值＞2.0，RNA的260/230比值＞2.0。

1.8芯片杂交

a.预杂交：加约5ml去离子水于杂交管中预湿芯片膜，拧紧管盖倒放5分钟。60℃预热GEAhyb杂交液(GEAhyb Hybridization Solution)多次颠倒试剂瓶以彻底溶解瓶中组分。去除杂交管中的水，加入2ml预热的GEAhyb杂交液，转动管子。确定管盖拧紧。将杂交管放在杂交炉中，旋紧盖子。加热后检测杂交管盖是否仍然密封。以转速5-10rpm 60℃预杂交1到两小时。

b.杂交：配制样品杂交液：加入4到20μg用TrueLabeling-AMP试剂盒制备的生物素标记的cRNA样品至0.75ml预热的GEAhyb杂交液中，混合均匀放于60℃。弃去杂交管中的预杂交液，加入含有标记的cRNA的样品杂交液。于60℃保持5到10rpm旋转杂交过夜。

c.洗膜：每张芯片需配制5ml的洗液1和5ml的洗液2。洗液1：2× SSC，1％SDS(混合10ml 20× SSC，5ml 20％SDS，和85ml ddH2O)。洗液2：0.1×SSC，0.5％SDS(混合0.5ml 20× SSC，2.5ml 20％SDS和97ml ddH2O)。洗液1和洗液2使用前均需要预热至60℃。加入5ml洗液1至杂交管中，简单转动几下，放回杂交炉中。60℃ 20到30rpm转动洗膜15分钟。弃去洗液。加入5ml洗液2至杂交管中，简单转动几下，放回杂交炉中。60℃ 20到30rpm转动下，洗膜15分钟。立刻弃去洗液，盖上杂交管盖以保持膜湿润，冷却至室温。

1.9化学发光检测

a.膜封闭：最后一次洗膜后，弃去洗液，立刻加入1.5ml GEAb封闭液Q，在杂交仪中30到40rpm孵育40分钟。

b.加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶(AP)：配制1×缓冲液F：用水将5×缓冲液F稀释5倍。(每杂交管准备18ml的1×缓冲液F)。配制结合混合液：AP∶1×缓冲液F(1∶7,500)混合。(每杂交管配制2ml结合缓冲液)。弃去杂交管中的GEA封闭液Q，加入2ml结合缓冲液，在杂交仪中轻轻摇动孵育10分钟。

c.洗膜：洗膜4次：加入4ml的1×缓冲液F温和振荡5分钟，弃去1×缓冲液F。加入3ml缓冲液G温和震荡分钟；倒掉，再用3ml缓冲液G重复洗一次。

d.检测：加入1.0ml CDP-Star化学发光底物至杂交管中，室温孵育2分钟。取出膜，放在一张滤纸上以去除多余的CDP-Star溶液，然后用干净的塑料膜两面包住，驱除气泡，用X-射线胶片曝光。

2.0图象采集和数据分析

a.图象和数据采集：X-射线胶片曝光后，将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为Microsoft Excel文件。

b.数据分析：使用芯片配套软件GEArray Analyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。每张芯片都点有负对照(PUC18DNA和空白)以及管家基因，包括β-actin，GAPDH，Cyclophilin A和核糖体蛋白L13a。原始数据将首先被减掉背景最小值，继而用管家基因来进行校正，校正后的数据用来进行样品间基因转录的相对丰度分析。

2.结果

细胞周期基因芯片可检测以下基因：

G1期和G1/S过渡期基因：ANAPC2，CCND1，CCNE1，CDC7，CDC34，CDK4，CDK6，CDKN1B，CDKN1C，CDKN3，CUL1，CUL2，CUL3，CUL4A，CUL5，E2F1，SKP2.S期和DNA复制基因：ABL1，MCM2，MCM3，MCM4，MCM5，MCM6，MCM7，PCNA，RPA3，SUMO1，UBE1.G2期和G2/M过渡期基因：ANAPC2，ANAPC4，ANAPC5，ARHI，BCCIP，BIRC5，CCNA1，CCNB1，CCNG1，CCNH，CCNT1，CCNT2，CDC25A，CDC25C，CDC37，CDK5R1，CDK5R2，CDK5RAP1，CDK5RAP3，CDK2，CDK7，CDKN3，CKS1B，CKS2，DDX11，DNM2，GTF2H1，GTSE1，HERC5，KPNA2，MNAT1，PKMYT1，RGC32，SERTAD1.M期基因：CCNB2，CCNF，CDC2，CDC16，CDC20，CDC25A，CDC25C，MRE11A，RAD50，RAD51.细胞周期检测和细胞周期停滞基因：ATM，ATR，BRCA1，BRCA2，CCNA2，CCNE2，CCNG2，CDC2，CDC25A，CDC34，CDC45L，CDC6，CDK2，CDKN1A，CDKN1B，CDKN1C，CDKN2A，CDKN2B，CDKN2C，CDKN2D，CDKN3，CHEK1，CHEK2，CUL1，CUL2，CUL3，CUL4A，CUL5，GADD45A，HUS1，KNTC1，MAD2L1，MAD2L2，NBS1，RAD1，RAD17，RAD9A，RB1，RBBP8，TP53.细胞周期调节基因：ABL1，ANAPC2，ANAPC4，ANAPC5，ARHI，ATM，ATR，BCCIP，BCL2，BRCA2，CCNA1，CCNA2，CCNB1，CCNB2，CCNC，CCND1，CCND2，CCND3，CCNE1，CCNE2，CCNF，CCNH，CCNT1，CCNT2，CDC16，CDC2，CDC20，CDC25A，CDC25C，CDC37，CDC45L，CDC6，CDK2，CDK4，CDK5R1，CDK5R2，CDK6，CDK7，CDK8，CDKN1A，CDKN1B，CKS1B，CUL5，DDX11，E2F1，E2F2，E2F3，E2F4，E2F5，E2F6，GADD45A，KNTC1，MKI67，PCNA，PKMYT1，RAD9A，RB1，SKP2，TFDP1，TFDP2.细胞周期负调节基因：ATM，BAX，BRCA1，CDC7，CDKN2B，CDKN2D，RBL1，RBL2，TP53.

三组细胞周期芯片经过分析比较，不同组间基因上、下调有显著差异：造模与对照组相比较有49条基因有显著差异，占检测基因的43.75％，其中48条基因显示H₂O₂对其有显著的上调作用：

  基因文库  符号    描述  对照标准值  模型标准值 NM_001184 NM_001168 NM_007294 NM_001237 NM_031966 NM_001238 NM_004702 NM_004354 NM_001241 NM_001255 NM_001790 NM_004359 NM_007065 NM_001798 NM_016408 NM_078626 NM_001800 NM_005192 NM_001274 NM_007194 NM_001826 NM_003591 ATR BIRC5 BRCA1 CCNA2 CCNB1 CCNE1 CCNE2 CCNG2 CCNT2 CDC20 CDC25C CDC34 CDC37 CDK2 CDK5RAP1 CDKN2C CDKN2D CDKN3 CHEK1 CHEK2 CKS1B CUL2  Ataxia telangiectasia and  Rad3 related  Baculoviral IAP  repeat-containing 5  (survivin)  Breast cancer 1，early  onset  Cyclin A2  Cyclin B1  Cyclin E1  Cyclin E2  Cyclin G2  Cyclin T2  CDC20 cell division cycle  20 homolog(S.cerevisiae)  Cell division cycle 25C  Cell division cycle 34  CDC37 cell division cycle  37 homolog(S.cerevisiae)  Cyclin-dependent kinase 2  CDK5 regulatory subunit  associated protein 1  Cyclin-dependent kinase  inhibitor 2C(p18，  inhibits CDK4)  Cyclin-dependent kinase  inhibitor 2D(p19，  inhibits CDK4)  Cyclin-dependent kinase  inhibitor 3  (CDK2-associated dual  specificity phosphatase)  CHK1 checkpoint homolog  (S.pombe)  CHK2 checkpoint homolog  (S.pombe)  CDC28 protein kinase  regulatory subunit 1B  Cullin 2  1.3173E-1  1.7282E-1  4.2326E-2  2.1630E-2  1.9824E-1  3.7713E-2  8.4293E-2  3.5541E-2  1.5670E-2  3.0843E-1  6.9646E-3  3.8269E-2  4.1285E-3  2.2430E-1  8.2929E-3  5.7619E-3  1.1865E-2  2.2832E-2  1.3786E-2  8.3288E-3  1.7322E-1  2.0553E-2  2.9475E-1  5.5345E-1  1.8026E-1  6.9971E-2  4.3047E-1  2.2490E-1  1.7203E-1  1.1014E-1  3.9569E-2  7.1598E-1  2.3407E-2  1.7486E-1  1.9722E-2  5.4852E-1  3.0117E-2  2.7109E-2  5.2616E-2  1.1912E-1  5.4556E-2  1.9704E-2  5.6578E-1  8.2573E-2

 NM_003590 NM_003478 NM_004399 NM_005225 NM_004091 NM_005316 NM_016426 NM_002358 NM_006341 NM_005914 NM_005916 NM_002417 NM_002431 NM_182687 NM_002853 NM_002873 NM_004584 NM_002894 NM_005611  CUL3  CUL5  DDX11  E2F1  E2F2  GTF2H1  GTSE1  MAD2L1  MAD2L2  MCM4  MCM7  MKI67  MNAT1  PKMYT1  RAD1  RAD17  RAD9A  RBBP8  RBL2    Cullin 3    Cullin 5    DEAD/H    (Asp-Glu-Ala-Asp/His)box    polypeptide 11(CHL1-like    helicase homolog，S.    cerevisiae)    E2F transcription factor 1    E2F transcription factor 2    General transcription    factor IIH，polypeptide 1，    62kDa    G-2 and S-phase expressed    1    MAD2 mitotic arrest    deficient-like 1(yeast)    MAD2 mitotic arrest    deficient-like 2(yeast)    MCM4 minichromosome    maintenance deficient 4    (S.cerevisiae)    MCM7 minichromosome    maintenance deficient 7    (S.cerevisiae)    Antigen identified by    monoclonal antibody Ki-67    Menage a trois 1(CAK    assembly factor)    Membrane-associated    tyrosine-and    threonine-specific    cdc2-inhibitory kinase    RAD1 homolog(S.pombe)    RAD17 homolog(S.pombe)    RAD9 homolog A(S.pombe)    Retinoblastoma binding    protein 8    Retinoblastoma-like 2    (p130)    3.5182E-3    2.1432E-2    8.1134E-3    2.3873E-2    3.7515E-3    5.3832E-2    2.5848E-3    1.2278E-2    8.7380E-2    6.2466E-3    5.1480E-2    1.7304E-2    5.2593E-3    1.2762E-2    1.3373E-2    6.3722E-3    2.3802E-2    5.4640E-2    1.0267E-2    8.0811E-3    7.2623E-2    6.4506E-2    3.5963E-1    3.1879E-2    1.4608E-1    7.0131E-3    1.3035E-1    4.8919E-1    2.7465E-2    3.5051E-1    2.7508E-1    2.2962E-2    1.4420E-1    5.6105E-2    5.0409E-2    1.5256E-1    1.4945E-1    2.9904E-2

 NM_014059 NM_002947 NM_013376 NM_005983 NM_007111 NM_000546 NM_003334  RGC32  RPA3  SERTAD1  SKP2  TFDP1  TP53  UBE1  Response gene to  complement 32  Replication protein A3，  14kDa  SERTA domain containing 1  S-phase kinase-associated  protein 2(p45)  Transcription factor Dp-1  Tumor protein p53  (Li-Fraumeni syndrome)  Ubiquitin-activating  enzyme E1(A1S9T and BN75  temperature sensitivity  complementing) 9.2388E-2 5.1516E-3 1.3249E-1 5.7799E-3 2.8872E-1 3.3566E-2 3.0414E-1  3.7146E-1  4.4677E-2  4.6297E-1  4.1936E-2  6.2691E-1  2.4190E-1  7.6729E-1

1条基因显示H₂O₂对其有显著的下调作用：

  基因文库  符号    描述  对照标准值  模型标准值  NM_016323  HERC5  Hect domain and RLD 5  1.5437E-3  7.1199E-4

麦冬组与模型组相比较有55条基因有显著差异，占检测基因的49.1％，其中54条基因显示麦冬皂苷D可对抗H₂O₂的上调作用，对其有显著的下调作用：

  基因文库  符号    描述模型标准值麦冬标准值  NM_005157  NM_013367  NM_016237  NM_000051  NM_001184 ABL1 ANAPC4 ANAPC5 ATM ATR    V-abl Abelson murine    leukemia viral oncogene    homolog 1    Anaphase promoting    complex subunit 4    Anaphase promoting    complex subunit 5    Ataxia telangiectasia    mutated(includes    complementation groups A，    C and D)    Ataxia telangiectasia and    Rad3 related 8.0441E-1 3.9047E-1 3.6739E-1 7.1555E-2 2.9475E-11.5292E-11.6300E-15.3737E-22.4143E-29.1085E-2

  NM_016567  NM_001168  NM_007294  NM_001237  NM_031966  NM_005190  NM_001238  NM_004702  NM_004060  NM_004354  NM_001241  NM_001255  NM_004359  NM_007065  NM_001798  NM_016408  NM_001799  NM_001260  NM_004064  NM_078626  NM_001800    BCCIP    BIRC5    BRCA1    CCNA2    CCNB1    CCNC    CCNE1    CCNE2    CCNG1    CCNG2    CCNT2    CDC20    CDC34    CDC37    CDK2    CDK5RAP1    CDK7    CDK8    CDKN1B    CDKN2C    CDKN2D    BRCA2 and CDKN1A    interacting protein    Baculoviral IAP    repeat-containing 5    (survivin)    Breast cancer 1，early    onset    Cyclin A2    Cyclin B1    Cyclin C    Cyclin E1    Cyclin E2    Cyclin G1    Cyclin G2    Cyclin T2    CDC20 cell division cycle    20 homolog(S.cerevisiae)    Cell division cycle 34    CDC37 cell division cycle    37 homolog(S.cerevisiae)    Cyclin-dependent kinase 2    CDK5 regulatory subunit    associated protein 1    Cyclin-dependent kinase 7    (MO15 homolog，Xenopus    laevis，cdk-activating    kinase)    Cyclin-dependent kinase 8    Cyclin-dependent kinase    inhibitor 1B(p27，Kip1)    Cyclin-dependent kinase    inhibitor 2C(p18，    inhibits CDK4)    Cyclin-dependent kinase    inhibitor 2D(p19，    inhibits CDK4)    2.6678E-1    5.5345E-1    1.8026E-1    6.9971E-2    4.3047E-1    4.8487E-2    2.2490E-1    1.7203E-1    4.0281E-2    1.1014E-1    3.9569E-2    7.1598E-1    1.7486E-1    1.9722E-2    5.4852E-1    3.0117E-2    2.4316E-1    5.3257E-2    2.1737E-1    2.7109E-2    5.2616E-2  8.8689E-2  3.1331E-2  2.1235E-2  8.4501E-3  3.6672E-2  8.5598E-3  3.9982E-2  4.0513E-2  9.6207E-3  2.1948E-2  8.6513E-3  5.3042E-2  1.9461E-2  3.8227E-3  6.6522E-2  2.4509E-3  3.5337E-2  5.5785E-3  1.9662E-2  6.0724E-3  1.4431E-2

 NM_005192 NM_001274 NM_001826 NM_003591 NM_003589 NM_003478 NM_005225 NM_001924 NM_005316 NM_002358 NM_006341 NM_005914 NM_005916 NM_002417 NM_002431 NM_182649 NM_182687 NM_002853  CDKN3  CHEK1  CKS1B  CUL2  CUL4A  CUL5  E2F1  GADD45A  GTF2H1  MAD2L1  MAD2L2  MCM4  MCM7  MKI67  MNAT1  PCNA  PKMYT1  RAD1    Cyclin-dependent kinase    inhibitor 3    (CDK2-associated dual    specificity phosphatase)    CHK1 checkpoint homolog    (S.pombe)    CDC28 protein kinase    regulatory subunit 1B    Cullin 2    Cullin 4A    Cullin 5    E2F transcription factor 1    Growth arrest and    DNA-damage-inducible，    alpha    General transcription    factor IIH，polypeptide 1，    62kDa    MAD2 mitotic arrest    deficient-like 1(yeast)    MAD2 mitotic arrest    deficient-like 2(yeast)    MCM4 minichromosome    maintenance deficient 4    (S.cerevisiae)    MCM7 minichromosome    maintenance deficient 7    (S.cerevisiae)    Antigen identified by    monoclonal antibody Ki-67    Menage a trois 1(CAK    assembly factor)    Proliferating cell    nuclear antigen    Membrane-associated    tyrosine-and    threonine-specific    cdc2-inhibitory kinase    RAD1 homolog(S.pombe)  1.1912E-1  5.4556E-2  5.6578E-1  8.2573E-2  4.1721E-1  7.2623E-2  3.5963E-1  6.7445E-1  1.4608E-1  1.3035E-1  4.8919E-1  2.7465E-2  3.505lE-1  2.7508E-1  2.2962E-2  8.3559E-1  1.4420E-1  5.6105E-2 5.6517E-3 1.0883E-2 1.7118E-1 5.4688E-3 1.1248E-2 2.9209E-2 6.2425E-2 1.6683E-1 4.8487E-2 3.5666E-3 2.3942E-2 9.0537E-3 4.5360E-3 3.0728E-3 6.4747E-3 3.9253E-1 4.6146E-2 1.0755E-2

 NM_002873 NM_004584 NM_002894 NM_005611 NM_014059 NM_002947 NM_013376 NM_007111 NM_000546 NM_003334 RAD17 RAD9A RBBP8 RBL2 RGC32 RPA3 SERTAD1 TFDP1 TP53 UBE1    RAD17 homolog(S.pombe)    RAD9 homolog A(S.pombe)    Retinoblastoma binding    protein 8    Retinoblastoma-like 2    (p130)    Response gene to    complement 32    Replication protein A3.    14kDa    SERTA domain containing 1    Transcription factor Dp-1    Tumor protein p53    (Li-Fraumeni syndrome)    Ubiquitin-activating    enzyme E1(A1S9T and BN75    temperature sensitivity    complementing) 5.0409E-2 1.5256E-1 1.4945E-1 2.9904E-2 3.7146E-1 4.4677E-2 4.6297E-1 6.2691E-1 2.4190E-1 7.6729E-1 3.2008E-3 3.0636E-2 7.3673E-2 9.0171E-3 6.1803E-2 4.7555E-3 2.6356E-2 1.5386E-1 6.6211E-3 1.9753E-2

1条基因显示麦冬皂苷D可对抗H₂O₂的下调，有显著的上调作用：

基因文库 符号    描述  模型标准值  麦冬标准值NM_016323 HERC5 Hect domain and RLD 5  7.1199E-4  6.5479E-3

3.讨论

细胞周期基因芯片用于研究与细胞周期调控相关的120条基因。细胞周期过程受到CDKs及CDK调节蛋白的准确调控，这些CDKs及CDKs修饰蛋白(包括周期蛋白、CDK抑制剂、CDK磷酸酯酶及CDK激酶)相应基因都包含在这一芯片上。此外，这一芯片还包含了DNA损伤调控基因、细胞有丝分裂纺锤体调控点基因，以及SCF和APC泛素结合复合物基因。

本研究显示H₂O₂可以上调的细胞周期基因有：G1期与G1/S过渡期基因：CCNE1、CUL2、CUL3、CUL5、E2F1、SKP2；S期与DNA复制基因：MCM4 MCM7、RPA3、UBE1；G2期与G2/M过渡期：BIRC5、CCNB1、CCNT2、CDC25C、CDC37、CDK5RAP1、CDK2、CDKN3、CKS1B、DDX11、GTF2H1、GTSE1、MNAT1、PKMYT1、RGC32、SERTAD1；M期基因：CDC20、细胞周期检测和细胞周期停滞基因：ATR、BRCA1、CCNA2、CCNE2、CCNG2、CDC34、CDKN2C、CDKN2D、CHEK1、CHEK2、MAD2L1、MAD2L2、RAD1、RAD17、RAD9A、RBBP8、TP53；细胞周期调节基因：E2F2、MKI67、TFDP1；细胞周期负调节基因：RBL2。

而麦冬皂苷D能下调上述的39条基因：G1期与G1/S过渡期基因：CCNE1、CUL2、CUL5、E2F1；S期与DNA复制基因：MCM4 MCM7、RPA3、UBE1；G2期与G2/M过渡期：BIRC5、CCNB1、CCNT2、CDC37、CDK5RAP1、CDK2、CKS1B、GTF2H1、MNAT1、PKMYT1、RGC32、SERTAD1；M期基因：CDC20、细胞周期检测和细胞周期停滞基因：ATR、BRCA1、CCNA2、CCNE2、CCNG2、CDKN2C、CDKN2D、CHEK1、MAD2L1、MAD2L2、RAD1、RAD17、RAD9A、RBBP8、TP53；细胞周期调节基因：MKI67、TFDP1；细胞周期负调节基因：RBL2。以及其它的15条基因：G1期与G1/S过渡期基因：CDC34、CDKN1B、CUL4A；S期与DNA复制基因：ABL1、PCNA；G2期与G2/M过渡期：ANAPC4、ANAPC5、BCCIP、CCNG1、CDK7；细胞周期检测和细胞周期停滞基因：ATM、CDKN3、GADD45A；细胞周期调节基因：CCNC、CDK8。

H₂O₂可以下调的细胞周期基因只有一条G2期与G2/M过渡期基因HERC5，而麦冬皂苷D恰恰可以上调该条基因的表达。

以上结果表明麦冬皂苷D保护H₂O₂所造成的损伤与其对细胞周期基因的调节密切相关。