用于预防和治疗移植中的免疫应答的肝脏基质细胞

摘要

本发明包括用于在受体中减少针对移植物的免疫应答的方法和组合物，其通过用有效地减少或抑制宿主对所述移植物的排斥的量的肝脏基质细胞治疗所述受体。本发明还公开了通过用肝脏基质细胞治疗而诱导减少的外源组织抗宿主免疫应答，即，移植物抗宿主疾病的方法。

说明书

发明背景

肝脏是一种在多种生理过程中起重要作用的动力学器官。肝脏的复杂功能包括新陈代谢、储存、排泄、胞质蛋白诸如白蛋白的分泌以及通过细胞色素P-450系统的酶进行的有害物质的解毒作用。另外，在某些环境下，通常静止的肝脏也能有显著的有丝分裂活性。肝脏的主要细胞群是实质细胞(PC)，也叫作肝细胞。肝脏还包含一些其它的细胞类型，诸如内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞和Kupffer细胞。当肝脏受到损伤或者部分移除时，肝细胞进行快速再生的能力使得肝脏成为干细胞的潜在来源。

目前，据信肝脏具有干细胞和谱系(lineage)系统，其具有几种内脏、皮肤和造血系统的相似物(Sigal等.，1993 Amer.J.Physiol.，263：139-148)。同样地，在所有年龄的动物肝脏中存在祖先细胞群。当从肝脏分离时，这些细胞可以作为细胞治疗的潜在的候选。

哺乳动物免疫系统在保护个体免受传染剂和防止肿瘤生长中起着关键作用。然而，相同的免疫系统可以产生不理想的作用，诸如对来自不相关供体的细胞、组织和器官的排斥。免疫系统不能区分有利的入侵物诸如移植的组织和有害的那些入侵物，并且因此免疫系统排斥移植的组织或器官。移植器官的排斥通常由宿主中存在的同种异体反应性T细胞介导，其识别供体同种异体抗原或异种抗原。

作为抗原-诱导的功能性失活或对所述抗原特异的淋巴细胞的死亡的结果，免疫耐受性是针对特异抗原的活性诱导的不反应性。诱导这样的耐受性的抗原叫作“耐受原”，以便与免疫原区分开来，所述免疫原是产生免疫应答的抗原。B细胞耐受性和不能产生抗体的一种机制包括在不存在辅助T细胞或其它抗原呈递细胞的刺激时(B细胞活化的第二步)抗原与特异性B细胞的相互作用(B细胞活化的第一步)。已经提出了B细胞耐受性的其它机制。例如，在不存在T细胞时，由于表面免疫球蛋白-介导的信号传导的封闭(“抗原-竞争”)，B细胞可以变得没有反应力。另外，在不存在抗原呈递细胞的共同刺激时，B细胞表面免疫球蛋白通过抗原的强交联可以诱导正常的、成熟的B细胞的程序性细胞死亡，但是不在产生自体免疫抗体的B细胞中诱导程序性细胞死亡(Tsubata等.，1994，Curr.Biol.4：8-17)。

T细胞耐受性这样获得：1)在胸腺中，其中与自体肽起反应的胸腺细胞通过克隆缺失而被消除(中心耐受性)，和2)在周隙中，通过在耐受原条件下暴露于自体抗原(外周耐受性)。克隆缺失还可以由细胞死亡分子在抗原呈递细胞上的表达而引起。细胞死亡分子的经典实例是Fas配体(FasL)和肿瘤坏死因子-相关的程序性细胞死亡-诱导的配体(TRAIL配体)，其在激活的T细胞上分别连接它们的受体，Fas和DR4，这诱导T细胞的程序性细胞死亡。TNFR超家族的一员CD27和CD27-配体(CD70)的相互作用也诱导T细胞的程序性细胞死亡。

遗传全异的个体之间的细胞、组织和器官移植总是与移植排斥的风险相关。几乎所有细胞都表达主要组织相容性复合体的产物，I类MHC分子。此外，当暴露于炎性细胞因子时，许多细胞类型可以被诱导表达II类MHC分子。其它的免疫原性分子包括那些衍生于次要组织相容性抗原的分子，诸如由雌性受体识别的Y染色体抗原。同种异体移植物的排斥主要由CD4和Cd8亚类的T细胞介导(Rosenberg等.，1992 Annu.Rev.Immunol.10：333)。同种异体反应性的CD4 T细胞产生加剧针对同种异体抗原的溶细胞性CD8反应的细胞因子。在这些亚类中，抗原刺激后，发展细胞的竞争亚群，其特征在于它们产生的细胞因子。产生IL-2和IFN-γ的Th1细胞主要参与同种异体移植排斥(Mossmann等.，1989 Annu.Rev.Immunol.7：145)。产生IL-4和IL-10的Th2细胞可以通过IL-10下调Th1应答(Fiorentino等.1989 J.Exp.Med.170：2081)。实际上，已经花费了很多努力来将不需要的Th1应答转换成Th2途径。患者中不需要的同种异体反应性T细胞应答(同种异体移植排斥、移植物抗宿主疾病)典型地用免疫抑制性药物诸如泼尼松、硫唑嘌呤和环孢素A进行治疗。不幸地，这些药物通常需要患者终生施用，并且它们具有多种危险的副作用，包括普遍的免疫抑制作用。

器官移植的主要目的是供体器官的永久性移植，不诱导由受体产生的移植排斥免疫应答，同时保持受体针对其它外来抗原的免疫活性。典型地，为了预防宿主排斥反应，使用非特异性的免疫抑制剂，诸如环孢素、甲氨喋呤、类固醇和FK506。这些药剂必须以每日基础进行施用，并且如果停止施用，通常产生移植排斥。然而，使用非特异性免疫抑制剂的主要问题是，它们通过抑制免疫应答的所有方面而起作用，从而极大地增加了受体对传染病和其它疾病包括癌症的敏感性。

此外，尽管使用了免疫抑制剂，移植排斥仍然保持为人器官移植中的发病率和死亡率的主要来源。大部分人移植在10年内失败，而没有永久的移植接受性。只有50％的心脏移植存活5年，和20％的肾移植存活10年。(Opelz等.，1981，Lancet 1：1223)。

目前，据信成功的移植取决于预防和/或减少宿主针对移植物的不需要的免疫应答，所述免疫应答由免疫效应细胞介导，从而改变宿主对供体组织的排斥。消除或者减少供体组织针对受体组织的不需要的免疫应答(叫作移植物抗宿主疾病)的方法对于成功的移植也是有利的。因此，对于用来抑制或者另外防止与遗传全异个体之间的细胞、组织和器官的移植相关的不需要的免疫应答的方法存在长久的需要。本发明满足这一需要。

发明简述

本发明包括减少受体中针对移植物的免疫应答的方法，其通过用有效地减少或抑制宿主对移植物的排斥的量的肝脏基质细胞(LSCs)治疗受体。本发明还包括通过用LSCs处理而诱导减少的外源组织抗宿主免疫应答，即，移植物抗宿主疾病的方法。所述LSCs可以在移植之前、同时或之后进行施用。

本发明还包括治疗移植受体以在受体中减少效应细胞针对所述效应细胞的同种异体抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给移植受体施用有效量的LSCs，以减少效应细胞针对所述效应细胞的同种异体抗原的免疫应答，由此在移植受体中，效应细胞具有针对同种异体抗原的减少的免疫应答。

在一个实施方案中，所述效应细胞是T细胞。

在另一个实施方案中，所述T细胞来自供体，并且所述同种异体抗原来自受体。

在另一个实施方案中，所述T细胞来自受体，并且所述同种异体抗原来自供体。

在另一个实施方案中，所述T细胞存在于移植物中。

在另一个实施方案中，所述移植物是骨髓。

在另一个实施方案中，所述移植物是造血干细胞。

在一个实施方案中，所述移植物是神经干细胞。

在另一个实施方案中，所述LSCs在施用给移植受体之前在培养物中被扩展(expanded)。

在另一个实施方案中，所述效应细胞是先前激活的来自供体的T细胞，为了激活所述T细胞，其通过在移植前将T细胞与来自受体的细胞或组织接触而激活，并且其中所述免疫应答是T细胞的再激活。

在另一个实施方案中，将所述LSCs施用给移植受体，以治疗受体对移植物的排斥。

在另一个实施方案中，所述LSCs是人LSCs。

在一个实施方案中，所述方法还包括给受体施用免疫抑制剂。

在一个实施方案中，所述移植物是实体器官。优选地，所述实体器官选自由心脏、胰腺、肾脏、肺和肝脏组成的组。

在另一个实施方案中，将所述LSCs静脉内施用给受体。

在另一个实施方案中，所述效应细胞是供体移植物的受体的细胞。

在另一个实施方案中，所述LSCs被遗传修饰。

本发明还包括用于治疗移植受体以在受体中减少效应细胞针对所述效应细胞的同种异体抗原的免疫应答的方法，所述方法包括给移植受体移植移植物，所述移植物用有效地减少效应细胞针对所述效应细胞的同种异体抗原的免疫应答的量的LSCs处理，由此在移植受体中，所述效应细胞具有针对同种异体抗原的减少的免疫应答。

本发明还包括减少效应细胞针对同种异基因细胞的免疫应答的方法，所方包括用LSCs处理所述效应细胞。

附图简述

当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的前述概述以及下述详述。为了举例说明本发明的目的，在附图中显示的是目前优选的实施方案。然而，应该理解，本发明不限于所示的精确安排和手段。

图1是描述肝脏基质细胞(LSCs)免疫原性的图表。

图2是描述来源于各种来源的成纤维细胞和基质细胞对混合淋巴细胞反应(MLR)应答的抑制作用的图表。

图3是显示神经干细胞(NSCs)刺激同种异基因T细胞增殖的图表。

详述

本发明涉及这样的发现，即，肝脏基质细胞(LSCs)具有新的免疫学特征，并且因此可以通过减少和/或消除受体自身免疫系统针对移植物的免疫应答，而用于移植物的移植，例如生物适合的格栅(lattice)或供体组织、器官或细胞的移植。如在下文中更充分地描述的那样，LSCs在抑制和/或预防移植物的同种异体移植排斥中起作用。

另外，本文公开的数据还表明，LSCs有效抑制和/或预防供体移植物如生物适合的格栅或供体组织、器官或细胞抗受体组织的不需要的免疫应答，所述免疫应答叫作移植物抗宿主疾病。

因此，本发明包括用于减少和/或消除受体针对移植物的免疫应答的方法和组合物，其通过用有效减轻或者抑制宿主对所述移植物的排斥的量的LSCs处理所述受体。本发明还包括用于减轻和/或消除宿主中外源移植物抗所述宿主的免疫应答，即，移植物抗宿主疾病的方法和组合物，其通过肝脏基质细胞处理供体移植物和/或所述移植物的受体，以抑制或者减少所述供体移植物抗所述受体的不利反应。

定义

当用于本文时，每一种下述术语具有在这一部分与其相关的意思。

当用于本文时，冠词″a(一种)″和″an(一种)″是指一个或多于一个(即，至少一个)的所述冠词的语法宾语。通过实例的方式，“一种元件″意指一个元件或者多于一个元件。

术语“大约”，本领域的普通技术人员应该理解，并且在某种程度上在它所应用的上下文中不同。

当用于本文时，术语“自体同源的”意指来源于同一个体的任何物质，所述物质后来又被重新引入到所述个体中。

当用于本文时，术语“生物适合的格栅”，意指可以促进形成有益于组织发育的三维空间结构的物质。因此，例如，细胞可以在这样的生物适合的格栅中培养或者接种，诸如包括胞外基质物质、合成的聚合物、细胞因子、生长因子等的一种格栅。所述格栅可以塑造成需要的形状，用于促进组织类型的发育。此外，至少在细胞培养过程中的早期阶段，培养基和/或物质补充促进适当的组织类型和结构发育的因子(例如，生长因子、细胞因子、胞外基质物质等)。

当用于本文时，术语“骨髓基质细胞”、“基质细胞”、“间充质干细胞”或“MSCs”互换地使用，并且是指骨髓中的少部分细胞，其可以作为骨细胞、软骨细胞、单核细胞和脂肪细胞的干细胞样前体。已经广泛地研究了骨髓基质细胞(Castro-Malaspina等.，1980，Blood 56：289-30125；Piersma等.，1985，Exp.Hematol 13：237-243；Simmons等.，1991，Blood 78：55-62；Beresf ord等.，1992，J.Cell.Sci.102：341-351；Liesveld等.，1989，Blood 73：1794-1800；Liesveld等.，Exp.Hematol 19：63-70；Bennett等.，1991，J.Cell.Sci.99：131-139)。骨髓基质细胞可以来源于任何动物。在一些实施方案中，基质细胞来源于灵长类，优选地来源于人。

当用于本文时，“肝脏基质细胞”或“LSC”是指来源于肝脏的少部分成纤维类型的细胞。当与来自不是获得所述LSCs的同一个体的个体的T细胞接触时，LSCs不能激发T细胞应答。另外，LSCs能够在免疫应答过程中抑制同种异体反应性T细胞增殖。例如，LSCs可以抑制同种异基因T细胞和外周血单核细胞(PBMCs)之间的混合淋巴细胞反应(MLR)。

当用于本文时，“神经干细胞”或“NSC”是指未分化的、多能的、自我更新的神经细胞。神经干细胞是能够分裂的产克隆的多能干细胞，并且在适当条件下，具有自我更新能力，并且可以最终分化成为神经元、星形胶质细胞和少突细胞。因此，由于干细胞后代具有多种分化途径，所以神经干细胞是“多能的”。神经干细胞能够自我维持，意指随着每次细胞分裂，平均起来，每个子代细胞还应该是干细胞。

“移植物(Graft)”是指用于移植的细胞、组织、器官或其它任何生物适合的格栅。

“同种异基因的”是指来源于相同物种的不同动物的移植物。

“异种的”是指来源于不同物种的动物的移植物。

“移植体(Transplant)”是指要被移植的生物适合性格栅或供体组织、器官或细胞。移植体的实例可以包括但不限于皮肤、骨髓和实体器官诸如心脏、胰腺、肾脏、肺和肝脏。

当用于本文时，“同种异基因肝脏基质细胞(LSC)”从与受体相同的物种的不同个体获得。

“供体抗原”是指通过要被移植到受体中的供体组织而表达的抗原。

“同种异体抗原”是不同于由受体表达的抗原的一种抗原。

当用于本文时，“效应细胞”是指调控针对抗原的免疫应答的细胞。在将移植物引入受体的情形中，效应细胞可以是受体自身的细胞，其激发针对存在于供体移植物中的抗原的免疫应答。在另一种情形中，效应细胞可以是移植物的部分，由此将所述移植物引入受体导致在所述移植物上存在的效应细胞激发针对所述移植物受体的免疫应答。

当短语用于本文时，术语“处理移植受体以在所述受体中减少效应细胞针对所述效应细胞的同种异体抗原的免疫应答”，意指当与没有用LSCs处理的其它相同动物的内源免疫应答相比较时，在受体中通过任何方法如给受体施用LSCs而减少针对同种异体抗原的内源性免疫应答。内源免疫应答的减少可以使用本文公开的方法或用于评估动物中的内源免疫应答的任何其它方法而进行评估。

当用于本文时，术语“生长培养基”意指促进细胞生长的培养基。生长培养基可以含有动物血清，但是由于生长培养基也可以是没有血清的，所以这不总是必需成分。

当用于本文时，术语“生长因子产物”是指对细胞具有生长、增殖、分化或营养作用的蛋白、肽、促分裂原或其它分子。例如，用于治疗CNS疾病的生长因子产物包括，但不限于，神经生长因子(NGF)、脑源神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白(NT-3，NT-4/NT-5)、睫状神经营养因子(CNTF)、双调蛋白、FGF-1、FGF-2、EGF、TGFα、TGFβs、PDGF，IGFs以及白介素；IL-2、IL-12、IL-13。

细胞的“免疫表型”用于本文时是指在细胞表面蛋白模式的细胞表型。

“分离的细胞”是指分离自其它成分和/或细胞的细胞，所述其它成分和/或细胞与在组织或哺乳动物中分离的细胞天然伴随。

当用于本文时，术语“调控”意指生物状态的任何改变，即，增加、减少等。

当用于本文时，术语“非免疫原性的”意指这样的发现，即，LSCs不诱导MLR中的T细胞的增殖。然而，术语非免疫原性的不应该限于在MLR中不存在T细胞增殖的诱导，而是还应该解释适用于在将LSCs施用给动物后体内T细胞增殖的不存在。

“增殖”用于本文时是指细胞的繁殖或增殖。即，增殖包括更多的细胞的产生，并且其中可以通过简单的计数细胞数目、测定结合到细胞的³H-胸苷等而测定。

当用于本文时，术语“基质细胞培养基”是指用于培养LSCs的培养基。基质细胞培养基的一个非限制性实例是包括DMEM/F 12 Ham′s、10％胎牛血清、100U青霉素/100μg链霉素/0.25μg两性霉素的培养基。典型地，所述基质细胞培养基包括碱性培养基、血清和抗生素/抗真菌剂。然而，LSCs可以在没有抗生素/抗真菌剂并且补充至少一种生长因子的基质细胞培养基中培养。优选的碱性培养基是DMEM/F12(1∶1)。优选的血清是胎牛血清(FBS)，但是可以使用其它的血清，包括马血清或人血清。优选地，将多达20％的FBS添加到上述培养基中，以支持基质细胞的生长。然而，如果FBS中对于基质细胞生长必需的生长因子、细胞因子和激素得到确定，并且在生长培养基中以适当的浓度提供，可以使用确定的培养基。还应该认识到，其它成分可以添加到培养基中。这样的成分包括但不限于抗生素、抗真菌剂、白蛋白、生长因子、氨基酸、和本领域已知用于细胞培养的其它成分。可以添加到培养基中的抗生素包括但不限于，青霉素和链霉素。青霉素在培养基中的浓度为每ml大约10-大约200单位。链霉素在培养基中的浓度为大约10-大约200μg/ml。然而，本发明决不应该解释为限制用于培养基质细胞的任何一种培养基。更确切地说，可以使用能够支持组织培养物中的基质细胞的任何培养基。

当用于本文时，“治疗有效量”是足以为施用LSCs的受试者有效提供有利作用的LSCs的量

当用于本文时，“内源的”是指来自或者产生于生物体、细胞或系统内部的任何物质。

“外源的”是指来自或者产生于生物体、细胞或系统外部而引入的任何物质。

“编码”是指在多聚核苷酸诸如基因、cDNA或mRNA中作为在生物过程中合成其它聚合物和大分子的模板的具体的核苷酸序列的内在特性，其具有确定的核苷酸序列(即，rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列，以及由其导致的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白，那么一种基因编码一种蛋白。编码链，其为与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供的核苷酸序列，和非编码链，其用作基因转录或cDNA的模板，都可以视为编码所述基因或cDNA的蛋白或其它产物。

除非另外指定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括降解彼此的译本并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白和RNA的核苷酸序列可以包括内含子。

“分离的核酸”是指从以天然存在的状态与其侧连的序列分离的核酸部分或片段，例如，已经从通常与所述片段邻近的序列，如在其天然存在的基因组中与所述片段临近的序列而移除的DNA片段。所述术语还适用于这样的核酸，即，其基本上从天然伴随所述核酸的其它成分如RNA或DNA或蛋白纯化而来，所述RNA或DNA或蛋白通常在细胞中天然伴随所述核酸。因此，所述术语包括，例如，结合到载体、自主复制的质粒或病毒、或者原核或真核的基因组中的重组DNA，或者作为不依赖于其它序列的独立分子(例如，作为cDNA或者通过PCR或限制性酶消化产生的基因组或cDNA片段)而存在的重组DNA。它还包括为编码其它多肽序列的杂种基因的片段的重组DNA。

在本发明的上下文中，使用用于常见核酸碱基的下述缩写。″A″是指腺苷，″C″是指胞嘧啶，″G″是指鸟苷，″T″是指胸腺嘧啶核苷，和″U″是指尿嘧啶核苷。

“载体”实质上是一种组合物，其包括分离的核酸，并且其可以用来将所述分离的核酸递送到细胞内部。本领域已知的许多载体包括但不限于，线性多聚核苷酸、与离子或两性化合物相关的多聚核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。所述术语还应该解释为包括促进将核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于，腺病毒载体、腺伴随病毒载体、反转录病毒载体等。

“表达载体”是指包括重组多聚核苷酸的载体，所述重组多聚核苷酸包括可操作性地连接到要被表达的核苷酸序列上的表达控制序列。表达载体包括有效用于表达的顺式-作用元件；其它表达元件可以由宿主细胞或者在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些，诸如黏端质粒、质粒(例如，裸露的或者包含在脂质体中)以及结合所述重组多聚核苷酸的病毒。

当用于本文时，术语“遗传修饰”是指通过故意引入外源DNA而引起的LSC基因型的稳定的或瞬时的改变。优选地，所述外源DNA是分离的核酸。所述DNA可以是合成的、或天然来源的，并且可以包含基因、基因片段或其它有用的DNA序列。当用于本文时，术语“遗传修饰”不意欲包括天然存在的改变，诸如通过天然病毒活性、天然遗传重组等发生的改变。

描述

本发明涉及这样的发现，即，当肝脏基质细胞(LSCs)与从不同个体获得的T细胞(同种异基因T细胞)接触时，所述同种异基因T细胞不增殖。现有技术法则表明，当T细胞与任何其它细胞混合时，随之发生T细胞增殖。这一现象已知为混合淋巴细胞反应(MLR)。本文公开的数据表明，来源于一个个体的T细胞不应答从不同个体获得的LSCs。因此，基于本文的公开内容，关于出现T细胞应答，LSCs对于免疫系统是非免疫原性的。

除了LSCs关于不同个体的T淋巴细胞的非免疫原性表型，本发明还涉及新的发现，即，LSCs可以抑制同种异基因细胞之间的MLR，例如，来自一个个体的T细胞和来自另一个体的外周血单核细胞(PBMCs)之间的MLR。这些出人意料的结果表明，LSCs可以活跃地减少T细胞和来自不同个体的PBMCs之间的MLRs中的同种异基因T细胞应答。此外，如在本文其它地方更详细地讨论的那样，观察到这一减少以剂量依赖方式发生。这表明，LSCs可以用作抑制移植的宿主排斥的治疗，并且另外，预防或者另外抑制移植后的移植物抗宿主疾病。

基于本文提供的公开内容，本领域的技术人员应该理解，LSCs抑制同种异基因T细胞反应的能力不限于T细胞和来自完全不同的个体的PBMCs之间的MLR，而是可以应用LSCs来涵盖T细胞和来自不同个体的任何类型的细胞如神经干细胞(NSC)、肝细胞、心脏细胞、软骨细胞、肾细胞、脂肪细胞等之间的MLR的抑制。

因此，本发明包括减少和/或消除受体中针对移植物的免疫应答的方法，所述方法通过给移植物受体施用有效地减少或抑制宿主对移植物的排斥的量的LSCs进行。不希望受到任何具体理论的束缚，施用给移植物受体的LSCs抑制所述受体T细胞的活化和增殖。

I.LSCs的分离和培养

用于本发明方法的LSCs可以使用本领域技术人员已知的各种方法分离。在一种优选的方法中，LSC是从哺乳动物受试者分离，优选地从人受试者分离。

基于本文提供的公开内容，LSCs可以从任何来源获得，例如，从组织供体、移植受体或其它不相关的来源(完全不同的个体或物种)。LSCs可以是与T细胞是自体同源的(从相同宿主获得)或者与T细胞是同种异基因型的。在LSCs是同种异基因型的情形中，所述LSCs可以与T细胞应答的移植物是自体同源的，或者所述LSCs可以从与T细胞来源和所述T细胞应答的移植物来源都是同种异基因型的个体获得。另外，LSCs可以与T细胞是异源的(从不同物种的动物获得)，例如，大鼠LSCs可以用来抑制MLRs中人T细胞的活化和增殖。

在另一个实施方案中，用于本发明的LSCs可以是从任何物种的哺乳动物的肝脏分离的，所述哺乳动物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猿、长臂猿、牛等。优选地，LSCs从小鼠或大鼠分离。更优选地，LSCs从人分离。

基于本公开内容，LSCs可以是分离的和在培养物中扩展的，即，在体外，以获得足够数目的细胞用于本文所述的方法。例如，LSCs可以从人肝脏分离，并且在完全培养基(DMEM低葡萄糖，含有4 mM L-谷氨酰胺，10％FBS和1％青霉素/链霉素)中培养。然而，本发明决不应该解释为限于任何一种分离和培养LSCs的方法。而是，分离和培养LSCs的任何方法都应该解释为包含在本发明中。

任何能够支持细胞培养物中的成纤维细胞的培养基都可以用来培养LSCs。支持成纤维细胞生长的培养基制剂包括但不限于，极限必需培养基Eagle、ADC-1、LPM(没有牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(有和无Fitton-Jackson改良)、基础培养基Eagle(BME-外加Earle′s碱性盐)、Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy′s 5 A培养基、Medium M 199(M199E-有Earle′s碱性盐)、Medium M 199(M199H-有Hank′s碱性盐)、极限必需培养基Eagle(MEM-E-有Earle′s碱性盐)、极限必需培养基Eagle(MEM-H-有Hank′s碱性盐)和极限必需培养基Eagle(MEM-NAA有非必需氨基酸)、等等。培养LSCs的优选培养基是DMEM。

任何能够在体外支持LSCs的培养基都可以用来培养LSCs。支持LSCs生长的培养基制剂包括但不限于，Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)、α改良的极限必需培养基(αMEM)和Roswell Park Memorial Institute培养基1640(RPMI培养基1640)等。典型地，将0-20％胎牛血清(FBS)或1-20％马血清添加到上述培养基中，以支持LSCs的生长。然而，如果在生长培养基中以适当的浓度提供培养LSCs必需的生长因子、细胞因子和激素，那么可以使用确定的培养基。用于本发明方法的培养基可以含有一种或多种目的化合物，包括但不限于抗生素、用于培养LSCs的促有丝分裂的或分化的化合物。细胞可以在27℃-40℃之间的温度生长，优选地在31℃-37℃，并且更优选地在湿润的培养箱中生长。二氧化碳含量可以维持在2％-10％，并且氧含量维持在1％-22％。然而，本发明决不应该解释为限于任何一种分离和培养LSCs的方法。而是，分离和培养LSCs的任何方法都应该解释为包含在本发明中。

用于本发明方法的培养基的其它非限制性实例含有牛或其它物种的胎儿血清，浓度至少1％-约30％，优选地至少约5％-15％，更优选地约10％。鸡或其它物种的胚胎提取物可以以约1％-30％，优选地至少约5％-15％，最优选地约10％的浓度存在。

可以添加到培养基中的抗生素包括但不限于，青霉素和链霉素。青霉素在培养基中的浓度为每ml约10-约200单位。链霉素在培养基中的浓度为约10-约200μg/ml。

分离后，在将细胞传代到另一培养设备中之前，将LSCs在培养基中在培养装置中培养一段时间，或者直到细胞达到汇合。初始接种后，细胞可以保持在培养物中大约6天的时间以产生0代(P0)群体。所述细胞可以传代无限次，每次传代包括将细胞培养约6-7天，在这一过程中细胞加倍的时间可能在3-5天范围内。所述培养设备可以是体外培养细胞通常所用的任何培养设备。优选的培养设备是培养瓶，并且更优选的培养设备是T-225培养瓶。

LSCs可以在基质细胞培养基中培养一段时间或者直到细胞达到确定的汇合程度。优选地，汇合程度大于70％。更优选地，汇合程度大于90％。时间段可以是适于细胞体外培养的任何时间。基质细胞培养基可以在LSCs培养过程中在任何时间更换。优选地，所述基质细胞培养基每3-4天更换。然后，从培养装置收集LSCs，因而LSCs可以立即应用，或者它们可以被冷藏并且保存以备以后应用。LSCs可以通过胰蛋白酶化作用、EDTA处理或者用于收集细胞的任何其它方法而从培养装置收集。

本文所述的LSCs可以按照常规流程进行冷藏。优选地，大约一百万到一千万个细胞在含有10％DMSO的基质细胞培养基中冷藏在液体N2的气相。冷冻的细胞可以通过在37℃水浴中旋转而解冻，重悬在新鲜生长培养基中，并且照常生长。

II.治疗

当包含在本发明中时，LSCs典型地从人分离。如果本发明的细胞要移植到人受试者，那么优选地，所述LSC应该从同一受试者分离，以便提供自体同源的移植物。然而，本发明也考虑了同种异基因型的移植物。

因此，在本发明的另一方面，施用的LSCs可以与受试者是同种异基因型的。同种异基因型的LSC细胞可以从与受体相同物种的不同个体的供体分离。分离后，使用本文公开的方法培养细胞，以产生同种异基因型产物。本发明还包括与受体异种的LSC。

本发明的另一个实施方案包括将LSCs施用给移植物受体的途径。LSCs可以通过适用于替换要被移植的移植物，即，生物适合的格栅或供体组织、器官或细胞的途径而施用。LSCs可以全身施用，即，肠胃外的、通过静脉注射，或者可以靶向具体的组织或器官，诸如骨髓。LSCs可以通过细胞的皮下移植或者通过将细胞注射到结缔组织如肌肉中而进行施用。

LSCs可以以约0.01-约5×10⁶个细胞/ml的浓度悬浮在适当的稀释剂中。适用于注射液的赋形剂是与LSCs并且与受体生物学和生理学相容的那些，诸如缓冲盐溶液或其它的赋形剂。遵循正确的无菌性和稳定性，按照标准方法，可以配制、生产并且保存用于施用的组合物。

LSCs的剂量在宽界限内变化，并且可以在每个具体病例中适应个体的需要。使用的细胞数目取决于受体的重量和状况、施用的次数和/或频率、以及本领域的技术人员已知的其它变量。

可以给个体施用每100kg体重约10⁵-约10¹³个LSCs。在一些实施方案中，每100kg体重施用约1.5×10⁶-约1.5×10¹²个细胞。在一些实施方案中，每100kg体重施用约1×10⁹-约5×10¹¹个细胞。在一些实施方案中，每100kg体重施用约4×110⁹-约2×10¹¹个细胞。在一些实施方案中，每100kg体重施用约5×10⁸-约1×10¹个细胞。

III.宿主排斥

在本发明的另一个实施方案中，LSCs在移植物之前或与移植物同时施用给受体，以减少和/或消除宿主对移植物的排斥。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，但是，通过将LSCs以有效的用量在移植物移植之前或同时施用给受体，以有效地减少、抑制或者消除受体T细胞针对所述移植物的免疫应答，LSCs可以用来调整受体的免疫系统适应所述移植物。LSCs影响受体的T细胞，以致当与所述移植物存在时，减少、抑制或者消除了T细胞应答。因此，通过在移植之前或者同时将LSCs施用给受体，可以避免宿主对移植物的排斥，或者减小其严重度。

在另一个实施方案中，LSCs可以在移植物施用之后施用给移植物的受体。此外，本发明包括治疗遭受针对移植物的不利免疫应答的患者的方法，所述方法给所述患者施用有效量的LSCs，以有效地减少、抑制或者消除针对所述移植物的免疫应答，其也叫作移植的宿主排斥。

本发明基于LSCs不会刺激同种异基因T细胞增殖的发现。同样地，本发明包括使用LSCs来抑制应答外源器官、组织或细胞的移植物的T细胞增殖。本发明还包括给患者施用有效量的LSC以减少关于T细胞增殖的免疫应答的方法。

基于本文提供的公开内容，本领域的技术人员应该理解，可以使用LSCs来包括对应答移植到哺乳动物并且从不同个体获得的任何类型的器官、组织或细胞的T细胞增殖的抑制。例如，可以使用LSCs抑制应答下列细胞的T细胞增殖：所述细胞包括但不限于神经干细胞(NSC)、肝细胞、心脏细胞、软骨细胞、肾细胞、脂肪细胞等。

本发明包括减少和/或消除受体中针对移植物的免疫应答的方法，所述方法给移植物受体施用有效量的LSCs，以减轻或者抑制宿主对移植物的排斥。不希望受到任何具体理论的束缚，施用给移植物受体的LSCs抑制受体T细胞的活化和增殖。

所述移植物包括要被移植的生物适合的格栅或供体组织、器官或细胞。移植物的实例包括但不限于，干细胞、皮肤细胞或组织、骨髓、神经干细胞和实体器官诸如心脏、胰腺、肾脏、肺和肝脏。

IV.移植物抗宿主疾病

除了减少和/或消除宿主对移植物的排斥的方法外，本发明还提供减少和/或消除供体移植物针对其受体的免疫应答(即，移植物抗宿主反应)的方法。因此，本发明包括在将移植物移植到受体之前，将供体移植物如生物适合的格栅或供体组织、器官或细胞与LSCs接触的方法。所述LSCs作用以改善、抑制或减少供体移植物针对受体的不利反应。

本发明是基于这样的发现，即，LSCs不会刺激同种异基因的T细胞增殖。基于本文描述的内容，LSCs可以抑制MLR反应中的T细胞。本发明还包括给哺乳动物施用有效量的LSC以减少关于T细胞增殖的免疫应答的方法。

如在本文其它地方所讨论的那样，LSCs可以从任何来源获得，例如，从组织供体、移植物受体或其它不相关的来源(完全不同的个体或物种)，以用于消除或减少移植物针对移植物受体的不需要的免疫应答。因此，LSCs与组织供体、移植物受体或其它不相关来源可以是自体同源的、同种异基因型的或者不同种的。

在本发明的一个实施方案中，在移植物移植到受体之前，将所述移植物暴露于LSCs。在这种情形中，有任何同种异体反应性受体细胞引起的针对移植物的免疫应答将受到在移植物中存在的LSCs的抑制。所述LSCs与受体是同种异基因的，并且可以来源于供体或者来源于除供体或受体之外的来源。在一些情形中，与受体自体同源的LSCs可以用来抑制针对移植物的免疫应答。在另一情形中，LSCs可以与受体是异种的，例如，小鼠或大鼠LSCs可以用来抑制人的免疫应答。然而，在本发明中优选使用人LSCs。

在本发明的另一个实施方案中，供体移植物可以是“预先处理的(preconditioned)”或“预处理的(pretreated)”，通过在移植到受体之前处理所述移植物，以减少移植物针对受体的免疫原性，由此减少和/或预防移植物抗宿主疾病。在移植之前，可以将移植物与受体的细胞或组织接触，以活化可能与所述移植物相关的T细胞。在用来自受体的细胞或组织处理所述移植物后，可以将所述细胞或组织从移植物移除。然后，将处理的移植物进一步与LSCs接触，以减少、抑制或消除通过用来自受体的细胞或组织处理而激活的T细胞的活性。在这种用LSCs处理所述移植物后，在移植到受体之前，可以将LSCs从移植物移除。然而，一些LSCs可能黏附到移植物上，并且因此可以与移植物一起引入受体。在这种情形中，被引入受体的LSCs可以抑制由与移植物相关的任何细胞引起的针对受体的免疫应答。不希望受到任何具体的理论的束缚，在移植物移植到受体之前用LSCs处理所述移植物，作用为减少、抑制或者消除活化的T细胞的活性，因而防止再刺激，或者诱导T细胞对于来自受体组织和/或细胞的后续抗原性刺激的反应低下。基于本公开内容，本领域的技术人员应该理解，在移植之前预先处理或者预处理移植物可以减少或者消除移植物抗宿主反应。

例如，在骨髓或外周血干细胞(造血干细胞)移植的情况中，通过使用本文公开的预处理方法预先处理供体骨髓，以减少移植物针对受体的免疫原性，可以减少、抑制或者消除移植物对宿主的攻击。如在本文其它地方所描述的那样，在将供体骨髓移植到受体之前，可以在体外将供体骨髓用来自任何来源的LSCs预处理，优选地用受体LSCs预处理。在一个优选地实施方案中，首先将骨髓暴露于受体组织或细胞，然后用LSCs处理。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，但是，据信，供体骨髓与受体组织或细胞的最初接触作用是激活供体骨髓中的T细胞。用LSCs处理供体骨髓诱导反应低下，或者防止T细胞针对后续抗原性刺激的再刺激，因而减少、抑制或消除供体骨髓在受体上诱导的不利影响。

在本发明的一个实施方案中，遭受移植物抗宿主疾病折磨的移植受体可以通过给所述受体施用LSCs而进行治疗，以减轻、抑制或者消除移植物抗宿主疾病的严重性，其中LSCs以有效量施用，以有效减轻或者消除移植物抗宿主疾病。

在本发明的这一实施方案中，优选地，受体的LSCs可以在移植前从受体获得，并且可以保存和/或在培养物中扩展，以提供足够量的LSCs储备，以便足以用于治疗正在进行的移植物抗宿主反应。然而，如在本文其它地方所讨论的那样，LSCs可以从任何来源获得，例如，从组织供体、移植受体或其它不相关的来源(完全不同的个体或物种)获得。

V.使用LSCs的优点

基于本文的公开内容，能够想象本发明的LSCs可以与现有方法如免疫抑制药物治疗的应用而组合应用，用来治疗宿主对供体组织的排斥或者移植物抗宿主疾病。在移植中，与免疫抑制药物组合使用LSCs的优点在于，通过应用本发明的方法来改善移植受体中免疫应答的严重性，可以减少使用的免疫抑制药物治疗的用量和/或免疫抑制药物治疗的施用频率。减少使用免疫抑制药物治疗的益处在于缓和了与免疫抑制药物治疗相关的一般性的免疫抑制和不需要的副作用。

还考虑到本发明的细胞可以作为“一次性”治疗施用给受体，用于治疗宿主对供体组织的排斥或移植物抗宿主疾病。LSCs一次性施用给移植物受体消除了对慢性免疫抑制药物治疗的需要。然而，如果需要，也可以应用LSCs的多次施用。

本文公开的发明还包括预防或治疗抑制排斥和/或移植物抗宿主疾病的方法，其通过施用预防或治疗有效量的LSCs，用来预防、治疗或者改善宿主对移植物的排斥和/或移植物抗宿主疾病。基于本公开内容，治疗有效量的LSCs是这样的量，即，当与不存在LSCs的施用时活化的T细胞数目进行比较时，抑制或者减少活化的T细胞数目的用量。在宿主排斥移植物的情形中，LSCs的有效量是这样的用量，即，当与LSCs施用之前受体中活化的T细胞数目相比较时，抑制或者减少移植物受体中活化的T细胞数目的用量。在移植物抗宿主疾病情形中，LSCs的有效量是这样的用量，即，抑制或减少在所述移植物中存在的活化的T细胞数目的用量。

LSCs的有效用量可以通过将在LSCs施用于其之前受体中或移植物中活化的T细胞数目与在LSCs施用于其之后在受体或移植物中存在的活化的T细胞数目进行比较而确定。与施用于其的LSCs相关的在移植物受体中或者在移植物本身中的活化T细胞数目的减少、或不存在增加，表明施用的LSCs数目是LSCs的治疗有效用量。

遗传修饰

在本发明的另一个实施方案中，LSCs可以用作在哺乳动物表达外源基因的基因治疗手段。使用LSCs作为基因治疗手段相对于目前所用的细胞的益处是基于这样的新发现，即，当与基因治疗应用领域中目前所用的细胞相比较时，LSCs可以存活更长的时间阶段。

除非另外阐述，遗传操作按照Sambrook等(2001，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)所述进行。本发明包括遗传修饰的LSCs，其已经被加工成表达外源基因。例如，所述外源基因可以是内源基因的外源译本(例如，相同基因的野生型译本可以用来代替包括突变的缺陷等位基因)。外源基因通常但是不必要共价地与一种或多种其它基因连接(即，“与之融合”)。示例性的“其它”基因包括用于“正”选择的基因，以选择已经结合了所述外源基因的细胞，和包括用于“负”选择的基因，以选择已经将所述外源基因结合在同内源基因相同的染色体基因座的细胞，或者包括两者。

本发明的细胞还可以用来表达用于治疗目的的外源蛋白或分子，或者用于在受体内示踪它们的同化和/或分化的方法中。因此，本发明包括用于将分离的核酸引入到LSCs中使得分离核酸在LSCs中伴随表达的表达载体和方法。在细胞中引入和表达DNA的方法对熟练的技术人员是公知的，并且包括，例如，在Sambrook等.(2001，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)，和在Ausubel等.(1997，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York)中所述的那些方法。

一旦它们被引入到受体中，所述分离的核酸可以编码用来示踪LSCs的迁移、同化和存活的分子。用于示踪细胞的蛋白包括但不限于，绿色荧光蛋白(GFP)、任何其它的荧光蛋白(例如，增强的绿色、青蓝色、黄色、蓝色和红色荧光蛋白；Clontech，Palo Alto，CA)、或其它标记蛋白(例如，LacZ，FLAG-标记，Myc，His₆等)。

本发明对LSC迁移和同化的示踪不局限于使用由载体或病毒表达的可检测分子。细胞的迁移和同化还可以使用一系列探针进行评估，所述探针有助于移植的LSCs在哺乳动物内的定位。示踪LSC移植物还可以使用用作与LSCs相关的细胞-特异性标记的抗体或核酸探针而实现。

分离的核酸可以使用病毒载体(反转录病毒、改良的疱疹病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒等)或通过直接的DNA转染(脂质转染法、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔等)而引入LSC中。

当细胞遗传修饰的目的是产生生物活性物质时，所述物质通常是一种用于治疗给定的疾病的物质。例如，遗传修饰细胞是理想的，，以致它们分泌某种生长因子产物。

本发明的细胞可以通过将分离的核酸引入所述细胞而进行遗传修饰，以生产诸如营养因子、生长因子、细胞因子等的分子，其对于培养细胞是有益的。另外，当移植到需要其的患者中时，遗传修饰的细胞可以为所述患者提供其它的治疗作用。

还可以修饰细胞以表达特定的生长因子受体(r)，其包括但不限于，p75低亲和力NGFr、CNTFr、神经营养蛋白受体的trk家族(trk，trkB，trkC)、EGFr、FGFr和双调蛋白受体。可以加工细胞以产生各种神经递质或它们的受体，诸如5-羟色胺、L-多巴、多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、速激肽、P物质、内啡肽、脑啡肽、组胺、N-甲基D-天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、GABA、ACh等。有用的神经递质-合成基因包括TH、多巴-脱羧酶(DDC)、DBH、PNMT、GAD、色氨酸羟化酶、ChAT、和组氨酸脱羧酶。编码可以证明用于CNS疾病治疗中的各种神经肽的基因包括P物质、神经肽Y、脑啡肽、血管升压素、VIP、胰高血糖素、铃蟾肽、缩胆囊素(CCK)、促生长素抑制素、降钙素基因-相关的肽等。

本发明的细胞还可以被修饰表达细胞因子。所述细胞因子优选地，但不是专有地选自由下列各项组成的组：IL-12、TNFα、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-7、IL-2、IL-6、IL-1 5、IL-21和IL-23。

按照本发明，将包括编码异源蛋白的核苷酸序列的基因构建体引入到LSCs中。即，所述细胞被遗传改变，引入了一种基因，其在个体中的表达具有治疗作用。按照本发明的一些方面，来自要治疗的个体或来自另一个体、或者来自非人动物的LSCs可以被遗传改变，取代缺陷基因和/或引入这样的基因，即，其在要治疗的个体中的表达具有治疗作用。

在将基因构建体转染到细胞中的所有情形中，异源基因被可操作性地连接到在细胞中获得所述基因的表达而需要的调控序列上。这样的调控序列典型地包括启动子和多聚腺苷化信号。

所述基因构建体优选地作为表达载体提供，其包括可操作地连接到基本调控序列上的异源蛋白的编码序列，以致当将所述载体转染到细胞中时，所述编码序列将被细胞表达。所述编码序列可操作性地连接到对于所述序列在细胞中表达所需要的调控元件上。编码蛋白的核苷酸序列可以是cDNA、基因组DNA、合成的DNA、或其杂合体、或RNA分子诸如mRNA。

所述基因构建体包括编码可操作性地连接到调控元件上的有益蛋白的核苷酸序列，并且可以作为功能性胞质分子、功能性游离型分子而保持存在于细胞中，或者它可以整合到细胞的染色体DNA中。分离的核酸可以被引入到细胞中，在那里它保持为质粒形式的分离的遗传物质。备选地，可以将能够整合到染色体中的线性DNA引入到细胞中。当向细胞中引入DNA时，可以添加促进DNA结合到染色体中的试剂。还可以在DNA分子中包含用于促进结合的DNA序列。备选地，可以将RNA引入细胞中。

基因表达的调控元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和多聚腺苷化信号、优选地，在本发明的细胞中，这些元件应该是可操作的。并且，优选地，这些元件可操作性地连接到编码蛋白的核苷酸序列上，以便所述核苷酸序列可以在细胞中表达，并且因此可以产生所述蛋白。起始密码子和终止密码子一般被视为编码所述蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，优选地，这些元件在细胞中是功能性的。类似地，应用的启动子和多聚腺苷化信号在本发明的细胞内必须是功能性的。用于实施本发明的启动子的实例包括但不限于，在许多细胞中有活性的启动子诸如巨细胞病毒启动子、SV40启动子和反转录病毒启动子。用于实施本发明的其它启动子实例包括但不限于组织特异性启动子，即，在一些组织中起作用而不在另一些组织中起作用的启动子；以及，通常在有或无特异性的或通用的增强子序列的细胞中表达的基因的启动子。在一些实施方案中，使用在有或无增强子序列的细胞中组成型地表达基因的启动子。当适当或需要时，在这样的实施方案中提供增强子序列。

本发明的细胞可以使用本领域的普通技术人员容易获得的公知技术进行转染。可以使用标准方法将分离的核酸引入细胞中，在那里所述细胞表达由所述基因编码的蛋白。在一些实施方案中，细胞通过磷酸钙沉淀转染、DEAE葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、脂质体-介导的转移、化学-介导的转移、配体介导的转移或重组病毒载体转移而被转染。

在一些实施方案中，使用重组腺病毒载体将具有需要序列的DNA引入到细胞中。在一些实施方案中，使用重组反转录病毒载体将具有需要序列的DNA引入到细胞中。在一些实施方案中，应用标准的CaPO₄、DEAE葡聚糖或脂质载体介导的转染技术将需要的DNA结合到分裂的细胞中。可以应用标准抗生素抗性选择技术来鉴定并且选择转染的细胞。在其它实施方案中，通过显微注射将DNA直接引入到细胞中。类似地，可以应用公知的电穿孔或粒子轰击技术将外源DNA引入到细胞中。第二基因通常与治疗基因共同转染或者连接到治疗基因上。第二基因通常是一种可选择的抗生素-抗性基因。转染的细胞可以通过将细胞生长在将要杀死不具有所述可选择的基因的细胞的抗生素中而进行选择。在两种基因不连接并且共同转染的大多数情形中，抗生素处理而存活的细胞在它们中具有这两种基因并且表达这两种基因。

应该理解，本文所述的方法可以以本领域公知的许多方式并且具有它的各种改进和改变而进行。还应该理解，关于细胞类型之间的作用或相互作用模式而提出的任何理论都不应该以任何方式解释为限制本发明，而是描述其，以致可以更充分的理解本发明的方法。

下述实例进一步举例说明本发明的方面。然而，它们决不是本文提出的本发明的教导或公开内容的限制。

实施例

实施例1：肝脏基质细胞的特征性描述

产生LSCs

使用命名为Hu027和Hu029的不同供体的成年人尸体肝脏。在34℃，将肝脏通过门静脉和肝动脉用含有EDTA的缓冲液灌注15分钟，并且用0.06％胶原酶(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)灌注30分钟。然后将细胞通过1000、500、250和150μm的滤器。使用2-步(9％和17％；Hu027和Hu029细胞)或12.5％(H0107细胞)OptiPrep梯度(Axis-Shield PoC AS，Oslo，Norway)，用COBE细胞处理器(Gambro BC T，Lakewood，CO)在500×g下分离活细胞。将细胞冷冻在含有80％Hypothermosol(Bio LifeSolutions Inc，Binghamton，NY)、10％人AB血清和10％二甲亚砜(Sigma)的培养基中，用于在液氮中保存。

对于培养，将冷藏的肝脏基质细胞解冻并且计数。将培养物以约1.62×10⁶个细胞/cm²接种在完全培养基(DMEM低葡萄糖，含有4 mM L-谷氨酰胺，10％FBS，和1％青霉素/链霉素)中。培养LSCs，并且用于下文更充分讨论的实验中。如下使用本领域已知的方法表征LSCs关于购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))的BMSCs和成纤维细胞系：

流式细胞术分析：

简要地，将细胞在含有5％FBS的PBS中洗涤，并且在用荧光染料标记的抗体染色之前用免疫球蛋白封闭。背景染色通过将细胞与同种型-匹配的荧光染料-标记的免疫球蛋白一起温育而确定。使用Cell Quest搜索软件，将大约五万个事件(细胞)用于在Becton Dickinson FACSCaliber流式细胞仪上分析LSCs。流式分析的结果总结在表1中。表1中″NEG″标号表示少于0.01％的阳性染色。观察到，表面标记，CD 14，区分LSCs和检测的BMSCs和成纤维细胞系。另外，观察到CD 133是一种相对于BMSCs在LSCs上以更低浓度存在的标记，并且因此可以用作区分LSCs和BMSCs的标记。

表1：

表1

表面抗原图表(％阳性细胞)簇簇成纤维细胞来源BVSCof分布胎儿肺皮肤脾结缔组织Ve 肝005(CE)  006  (CE)008(CE)005(CW)009(OW)分化传代e#P15P8P6P7TissueP10 HV-027 P3 HV-029 P3P3  P3P4P3P3CD3(TCell)1.91.20.78.728 Q1 0.9521  3.83.41.826CD11aLFA-1alphaNEGNEGNEGNEGNEG 0.55 NEG1.3  NEGNEGNEGNEGCD13APN91.693.39857.282.1 94.2 95.486.7  81.591.893.796.5CD14LPS-rNEGNEGNEGNEGNEG 13.8 67NEG  NEGNEGNEGNEGCD19PanBcellNEGNEGNEGNEGNEG NEG NEGNEG  NEGNEGNEGNEGCD29β-1Integrin83.174.69290.470.5 94.5 93.680.1  67.686.784.889.3CD31PECAM10.80.50.50.80.1 0.9 0.62  0.51.30.90.1CD34HerratStemcellNEG0.1NEG291 0.5 64NEG  NEG0.5NEG0.3CD40Co-stimuatonNEGNEGNEGNEGNEG NEG NEGNEG  NEG1.9NEGNEGCD44HCAMND91.294.989.367.9 96.3 95.491.5  90.386.193.196.1CD45PanLeukccyteNEGNEGNEGNEGNEG NEG 0.1NEG  NEGNEGNEGNEGCD54ICAM-176.219.34680.973.6 94 85.255.8  4717.935.749.8CD80B7-14.71.91.67.63.9 0.3 1.828  3.962125CD86B7-2NEGNEGNEGNEGNEG NEG NEGNEG  NEGNEGNEGNEGCD90Thy-192.486.797.793.370 95.7 95.587.5  7793.190.4924CD106Endogin26.831.567.180.7428 89.5 90625  55.558.564.743.5CD119INF-γ-r3.721.10.50.5 5.2 5.222.3  0.8NEG3.81.3CD120aTNPR1NEGNEGNEGNEGNEG NEG NEGNEG  NEGNEGNEGNEGCD123IL-3-rNEGNEG27NEG0.8 28 1.2NEG  0.20.33.3NEGCD132CommonγdrainNEGNEGNEGNEG4.2 NEG 5.8NEG  NEGNEGNEGNEGCD133AC13311.254.538.618.3 4 7.620.2  17.927.422.735.5CD212IL-12-rNEGNEGNEGNEG1.6 NEG 1.2NEG  NEGNEGNEGNEGMHC Cassl93.570.495.591.890.9 96.8 92988.5  76.193.589.4926MHC CassllNEGNEGNEGNEGNEG 0.1 0.2NEG  NEG0.1NEGNEG

肝脏来源基质细胞的分化检测：

分化检测在人BMSCs和人LSCs上进行。所述检测测试所述细胞的生脂和/或生骨分化潜力。

生脂检测：将细胞以2×10⁵个细胞/孔接种在生长培养基中。汇合时，在3次循环的诱导/保持培养基中进行生脂分化。保持培养基是补充了10％FBS、10μg/mL胰岛素和1×抗生素/杀真菌素的DMEM。诱导(分化)培养基是补充了10^-6M地塞米松、0.5mM甲基异丁基黄嘌呤和200μM吲哚美辛的保持培养基。每次循环包括用生脂诱导培养基培养3天而后用生脂保持培养基培养1天。这之后，将细胞用PBS洗涤，用10％福尔马林固定，用油红O染色，并且用苏木精染色计数以评估生脂分化。

生骨检测：将细胞以2×10⁵个细胞/孔接种在生长培养基或分化培养基(含有10％FBS、地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸-2-磷酸的DMEM)中。对照和分化孔的培养基每3-4天更换持续3周。这之后，将细胞用PBS洗涤并且用10％福尔马林固定。通过评估碱性磷酸酶的活性和使用用于矿物沉淀的von Kossa染色而测定生骨分化。

分化检测的结果在表2中描述。

表2：

基质细胞生脂结果碱性磷酸酶结果Von Kossa结果BMSCs(+对照)+用于脂质形成强阳性强阳性LSC#1(HV-027)没有脂质空泡形成的证据弱阳性阴性LSC#2(HV-029)没有脂质空泡形成的证据阴性阴性

观察到BMSCs分化成脂肪细胞(脂肪细胞)和骨生成细胞(生骨细胞)，而LSCs没有分化成任一谱系。

实施例2：肝脏基质细胞的免疫原性

此处所述的实验表明LSCs在体外表达新的免疫学特征。例如，当与同种异基因的T细胞混合时，发现LSCs是非免疫原性的，正如与当接触同种异基因的PBMCs时的T细胞增殖数目相比，观察到当与同种异基因的T细胞接触时LSCs不能诱导T细胞增殖。此外，发现LSCs对于同种异体反应性的T细胞应答是免疫抑制性的。对于间充质干细胞(MSCs)已经描述了相似的免疫学特征(Di Nicola等.，2002 Blood 99：3838；Tse等.2003 Transplantation 75：389；Le Blanc等.2003 Scand.J.Immunol.57：11)，但是对于大部分来源于不同组织来源的成纤维细胞群体没有描述相似的免疫性特征。

现在描述在本实施例中描述的实验中应用的材料和方法。

MLR检测

使用T细胞作为反应细胞和同种异基因PBMCs作为刺激细胞，通过混合淋巴细胞反应(MLR)评估LSCs的免疫原性。通过阴性选择，T细胞纯化自白细胞提取(leukopheresis)包装(AllCells，LLC，Berkeley，CA；Poietics，Rockville，MD)，其使用对单核细胞(CD 14)、B细胞(CD 19)、II类MHC和NK细胞(CD56)特异的小鼠单克隆抗体(Serotec，Raleigh，NC)标记非T细胞，以便使用用单克隆抗小鼠IgG抗体(Dynal Biotech，Inc，LakeSuccess，NY)包被的磁珠将非T细胞去除。通过流式细胞术分析，排除后剩余的细胞群体典型地大于85％CD3阳性。将T细胞悬浮在培养基中：Iscove′s改良Dulbecco′s培养基(IMDM)，补充了丙酮酸钠、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、抗生素/杀真菌素和5％人AB血清(除了从PelFreez，BrownDeer，WI获得的人AB血清之外，所有的补充物都从Gibco，Carlsbad，CA获得)。将T细胞与同种异基因的刺激细胞接种在96孔低蒸发平底平板(BD Falcon，Franklin Lakes，NJ)的微量滴定孔中(2×10⁵个细胞/孔)。在以实验需要的数目(通常从5×10⁴个细胞/孔的高剂量递减滴定)接种之前，使用铯源(Isomedix Gammator B，Parsippany，NY)，将刺激细胞用5000 radsγ射线辐射。每次处理，培养物在3个孔中提供。在培养的第6天，通过用³H-胸苷脉冲所述培养物而确定T细胞针对同种异体抗原的增殖。16小时后，使用96孔细胞收集器(Skatron，Molecular Devices Corp，Sunnyvale，CA)将细胞收集到filtermats上，并且使用Microbeta闪烁计数器(PerkinElmer，Turku，Finland)计数在filtermats上的细胞。

免疫原性实验

单向(one-way)MLR检测用来评估T细胞针对同种异基因LSCs的增殖。简要地，在96孔微量滴定平板中，T细胞(2×10⁵个细胞/孔)与辐射过的(5000 radsγ射线)同种异基因LSCs、自体同源的PBMCs或同种异基因的PBMCs(30,000个细胞/孔)一起培养。所述LSCs从编号为027和029的2名不同供体获得。T细胞从编号为002、004、005和006的4名不同供体获得的PBMCs纯化而来。T细胞富集通过阴性选择而实现，其使用磁珠(Dynal，Inc)以去除非T细胞。对巨噬细胞/单核细胞/树突细胞(抗-CD14)、B细胞(抗-CD19)、NK细胞(抗-CD56)和II类MHC抗原(抗-DR)特异的小鼠单克隆抗体(mAbs)用来标记这些细胞。用山羊抗-小鼠IgG抗体包被的磁性微粒用来在磁场中挑选细胞。通过流式细胞术分析，其使用荧光素化的抗-CD3 mAb检测T细胞，获得的细胞群典型地大于90％的T细胞。使用的细胞培养基是补充了5％人AB血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、pen-strep/两性霉素B和2-巯基乙醇的Iscove′s改良Dulbecco′s培养基(IMDM)。将培养物在37℃ 5％CO₂的湿润氛围中培养6天，用³H-胸苷(1μCi/孔)脉冲16hrs，并且在第7天使用自动96孔细胞收集器收集细胞。通过闪烁计数确定结合的发射性，并且将结果报告为每分钟的计数(cpm)。

为了判断测试细胞是免疫原性的，必须满足3个要求：

1)测试细胞必须诱导高于自体反应至少750cpm的T细胞增殖反应；

2)刺激指数(T+测试细胞cpm/T+自体同源细胞cpm)必须大于或等于3.0；和

3)在T+自体同源PBMCs和T+测试细胞之间必须存在统计学显著差异(P＜0.05，Student′s t检验)。

为了排除关于无反应性起因的遗传因素(即，MHC相似性)，每种测试细胞与至少2个(优选地3个)不同的T细胞供体一起培养。如果任一供体产生了上述阳性反应，那么认为所测试的群体是免疫原性的。应用这些标准，推断出来源于皮肤、脾、肺、结缔组织和胎儿材料的成纤维细胞是免疫原性的。

使用4个不同T细胞供体作为效应物和LSCs作为刺激物的MLR实验的结果表明LSCs不是免疫原性的(图1)。观察到针对来源于2个不同供体的LSCs的T细胞应答与针对自体同源PBMCs的应答相似。还观察到针对LSCs的T细胞应答显著小于针对同种异基因PBMCs的应答。LSCs没有从4个T细胞供体的任一个激发显著的应答，如由上文讨论的3条标准所定义的那样。

抑制实验

将LSCs添加到单向MLR检测中，以确定它们是否抑制同种异体反应性T细胞的增殖。简要地，将来自2个不同供体(027和029)的LSCs辐射(5000R)，并且添加到包括纯化的T细胞(效应细胞)和辐射的同种异基因PBMCs(刺激细胞)的单向MLR培养物中。T细胞的纯化和MLR的培养条件在本文的其它地方描述。还将来源于结缔组织、胎儿组织、肺、皮肤和脾的成纤维细胞加入到MLR培养物中，以确定它们的相对抑制特性。所有这些原代细胞系都购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。也检测了BMSCs的抑制特性。将LSCs、成纤维细胞和BMSCs以30,000个细胞/孔的剂量分别加入到T细胞和PBMCs的不同组合之间的MLR培养物中。结果表示为没有加入成纤维细胞/基质细胞的基本MLR反应的抑制百分数。每一条状物代表每种细胞型对4种不同MLR培养物的平均抑制(除了肺部成纤维细胞之外，其平均值从3种不同的MLR培养物计数)。抑制通过按照下式比较含有测试细胞的反应与对照MLR而确定：

抑制百分数＝[1-(含有测试细胞的MLR培养物的cpm/对照MLR培养物的cpm)]×100。

结果表明，来自2个供体的LSCs比评估的任何其它细胞型在更大程度上抑制MLR反应(图2)。显示的结果是4次实验的平均值，每次实验为MLR使用不同的T细胞和PBMCs组合。还观察到结缔组织成纤维细胞、皮肤成纤维细胞和骨髓基质细胞抑制MLR反应，而胎儿成纤维细胞、肺成纤维细胞和脾成纤维细胞增强MLR反应(负‘抑制百分数’表示加入的测试细胞群相对于对照水平增强了MLR反应)。

实施例3：移植中的肝脏基质细胞

假设LSCs抑制同种异体反应性T细胞应答，如本文在其它地方所讨论的那样，LSCs可以与免疫原性细胞、组织、或器官共同移植，以防止移植物质的免疫排斥。这种方法相对于本领域目前所用的那些方法的优点在于，所述细胞可以用来在移植物区域建立免疫特权的限制性区域，而没有对宿主有害的免疫系统的普遍抑制。

LSCs的免疫抑制特性可以用来增强被移植的细胞、组织或器官的存活。不受任何具体理论的束缚，据信，递送到组织/器官的LSCs将产生局部区域的免疫抑制或免疫特权，其将有助于细胞、组织或器官的移植。尽管在这些条件下可能诱导免疫耐受性，但是对于LSCs的成功应用，不需要在移植受体中减少和/或消除效应细胞针对同种异体抗原的免疫应答。优选地，在需要的位点存在足够数目的LSCs的长期移植，其中所述LSCs保持它们的抑制表型。

现在描述本实施例所述的实验中所用的材料和方法。

分离LSCs：

如在本文的其它地方所讨论的那样，LSCs从编号为Hu027和Hu029的成年人尸体肝脏分离。简要地，将肝脏通过门静脉和肝动脉灌注，并且将细胞通过1000、500、250和150μm的滤器。使用2-步(9％和17％；Hu027和Hu029细胞)或12.5％(H0107细胞)OptiPrep梯度(Axis-Shield PoC AS，Oslo，Norway)，用COBE细胞处理器(Gambro BC T，Lakewood，CO)在500×g下分离活细胞。

分离并且培养人胎儿神经干细胞：

人胎儿脑组织可以购自Advanced Bioscience Resources(Alameda，CA)。将所述组织用PBS/抗生素洗涤，并且在使用需要的脑组织之前去除脑膜。将剩余的组织用镊子分开，并且进一步通过用巴斯德移液管捣碎而解离。然后，在室温下通过在1000rpm离心5分钟而沉淀细胞。将细胞沉淀重新悬浮在10ml NSC生长培养基(DMEM/F12，8mM葡萄糖，谷胺酰胺，20mM碳酸氢钠，15mM HEPES，8μg/ml肝素，N2补充剂，10ng/mlbFGF，20ng/ml EGF)中。将细胞接种在具有通气孔的包被的(15μg/ml鸟氨酸过夜，之后用10μg/ml人纤连蛋白大于4h)T-25cm²瓶中，并且在37℃在5％CO₂培养箱中生长。它们开始在只有bFGF和EGF存在下生长后(1-2代)，将用白血病抑制因子(LIF)生长的细胞接种在具有10ng/ml LIF的完全生长培养基中。通过用新鲜的完全生长培养基替换50％的培养基，而每隔一天喂养培养物。通过用在PBS中的0.05％胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化2-3分钟，之后加入大豆胰蛋白酶抑制剂灭活胰蛋白酶来传代细胞。将细胞在室温下在1200rpm沉淀5分钟，重悬在生长培养基中，并且以1.0-1.25×10⁵个细胞/cm²接种在有包被的瓶中。细胞在10％DMSO+90％完全生长培养基中冷藏。

人MLR检测：

使用T细胞作为效应细胞，和同种异基因的PBMCs、NSCs或LSCs作为刺激细胞，干细胞的免疫原性可以通过混合淋巴细胞反应(MLR)进行评估。如果刺激细胞对于所述T细胞是免疫原性的，那么所述刺激细胞将激活T细胞并且诱导T细胞增殖。这些实验中所用的T细胞从本文其它地方所述的白细胞提取包装纯化。

大鼠MLR检测：这些检测以与人MLRs相似的方式进行。简要地，效应细胞通过收集宫颈(cervical)加肠系膜淋巴结细胞(LNCs)而产生。在6-孔平板中，通过用针对细胞过滤器(BD Falcon)的注射器活塞碾磨它们，将效应细胞解离成单细胞混悬液。除了血清是10％FBS(HyClone，Logan，UT)外，效应细胞悬浮在与人MLR培养基相似的培养基中。LNCs与同种异基因刺激细胞一起以本实验需要的数目接种在微量滴定孔(4×10⁵/孔)中。在接种之前，将刺激细胞辐射(5000rads)。每次处理培养物使用3个孔进行。按照本文其它地方所述，评估T细胞针对同种异体抗原的增殖。

人Alu PCR检测：大鼠肝脏中人NSCs的数目可以使用Walker等所述的基于内部Alu元件的PCR检测(intra-Alu element-based PCR assay)(2003，Analytical Biochem.315：122-128)进行定量。在人DNA中存在的天然存在的重复Alu序列允许比单拷贝序列/基因更大的检测灵敏性。因此，人源的基因组DNA通过关于人特异性Alu重复序列的实时PCR进行定量。这一检测所用的引物扩增Yb8 Alu亚家族内～200 bp的内部Alu核心重复序列。这些引物的使用由Walker等(2003，Analytical Biochem.315：122-128)报道，允许在2ng混合物种样品DNA中对于至少10pg(～1细胞等价物)的人DNA特异性检测。使用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra Systems)，基因组DNA从骤冷的大鼠肝脏分离。人DNA通过与Alu-特异性DNA标准曲线比较而定量，所述Alu-特异性DNA标准曲线从用已知数目的人细胞刺激(spiked)(10倍增加)的大鼠细胞群产生。

LSCs与NSCs的共同移植：

由于NSCs代表一种具有显著临床应用的干细胞实例，所以选择NSCs用于下列实验。然而，应该考虑到，任何细胞、组织或器官可以用于下列实验。下列实验阐述了LSCs在抑制针对移植到受体中的NSCs的免疫应答中的作用。

NSCs表达I类MHC抗原：

使用本领域公知的方法，从人胎儿组织制备NSCs，并且培养大约13代。应用流式细胞术，评估所述细胞免疫学相关的细胞膜分子。观察到，NSCs群不表达造血标记(CD45，CD14，CD34)，共刺激分子(CD80，CD86)，或II类MHC分子。然而，NSCs不表达干细胞标记，CD133，以及I类MHC抗原。I类分子的表达通常表明，如果移植到同种异基因的受体中，所述细胞将被同种异体反应性T细胞识别，并且将被排斥。基于本文所述的公开内容，LSCs是这一法则的例外，原因在于证明LSCs对于MLRs中的T细胞是非免疫原性的。

NSCs刺激同种异基因T细胞的增殖

使用T细胞作为效应细胞，和辐射的NSCs作为刺激细胞，通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)评估NSCs的免疫原性。测定针对同种异体抗原的T细胞增殖反应的MLR，是体内同种异基因细胞存活的预示。NSCs从人胎儿组织制备，并且培养大约13代。以大约5×10⁴个细胞/孔的高剂量起始，以3倍减少的量滴定所述细胞作为刺激细胞。制备来自不相关供体的纯化的T细胞(2×10⁵个细胞/孔)作为效应细胞。自体同源的PBMCs用作对照刺激细胞。如在图3中所示，与自体同源的PBMCs相比，其即使在最高细胞剂量也没有刺激显著量的T细胞增殖，NSCs刺激显著程度的T细胞增殖(P＜0.05，Student′s t检验)。这些结果证明，同种异基因NSCs由T细胞识别并且诱导功能性免疫应答。

LSCs保护NSCs在体内免受排斥的能力可以使用异种模型或同种异基因模型进行检验。尽管临床模型可以包括细胞的异种移植以及同种异基因模型，但是本文描述异种模型作为原理证据。异种模型包括下列标准：

1)人NSCs作为供体细胞；

2)由于人LSCs已经表现出对同种异体反应性T细胞应答的抑制，所以大鼠LSCs；和

3)由于通过门静脉施用细胞的容易性，向免疫系统注射细胞的可行性，以及复苏所注射的细胞的能力，所以将肝脏选作移植位点。不希望受到任何具体理论的束缚，门静脉内(intraportally)注射的LSCs可以留在肝脏中。此外，由于NSCs大约同LSCs大小相同，所以，NSCs还可以在肝门递送后截留在肝脏中。人NSCs作为这一模型中唯一的人细胞的应用使得可以使用对人Alu DNA序列特异的PCR技术来评估移植。通过将这些细胞用于单向MLR检测，本文所述的模型还可以用来确定NSCs和LSCs是否在受体动物的淋巴结中诱导T细胞应答。

相对于人MLR，大鼠LSC对异种大鼠的抑制

可以在大鼠和人细胞之间建立异种MLR，以评估是否大鼠LSCs抑制该应答。这些实验中使用对于受体是同种异基因型的大鼠LSCs，但是来自任何来源的LSCs可以用来抑制MLR反应。例如，还可以使用与受体自体同源的大鼠LSCs。

收集Fisher大鼠淋巴结(LNs)，解离成单细胞混悬液，并且接种在微量滴定孔中(4×10⁵/孔)作为MLR中的效应细胞。将人NSCs和同种异基因的PBMCs辐射并且以每孔1×10⁵个细胞接种作为刺激细胞。将来自ACI株系大鼠的LSCs和成纤维细胞以5×10⁴个细胞/孔的高剂量和减少到3,125个细胞/孔的2倍递减剂量滴定到MLRs中。大鼠MLR的培养条件如在本文的其它地方描述。通过比较对照MLR(无LSCs)与含有成纤维细胞和LSCs的MLRs，而确定抑制。使用Student′s t检验进行统计学评估。

确定移植的NSCs的存活

在使用对照成纤维细胞和LSCs后，设计实验评估施用后NSCs在体内的存活。可以使用1∶1比例的LSCs对NSCs，考虑到1∶3比例的LSCs对刺激因子PBMCs足以在体外抑制MLR，对于体内抑制，1∶1的比例应该是足够的。此外，据信，PBMCs是比NSCs更强的T细胞刺激因子，并且因此保证1∶1比例的LSCs对NSCs。

将人NSCs(5×10⁶个细胞)与ACI株系大鼠皮肤成纤维细胞(5×10⁶个细胞)混合，并且以200μl的体积通过门静脉内注射到25只Fisher大鼠的每一只中。皮肤成纤维细胞从获自ACI大鼠的皮肤样品产生，并且使用同本文其它地方所述的扩展LSCs的相似方法而进行扩展。另一组25只Fisher大鼠通过门静脉内注射与等数量ACI株系大鼠LSCs(5×10⁶个细胞/大鼠)混合的人NSCs(5×10⁶个细胞/大鼠)。在注射后第1、7、14、21和28天从每组处死5只大鼠。将肝脏移除，骤冷，并且进行如本文其它地方所述的Alu PCR检测，以评估人NSCs的移植。

据信，LSCs可以在体内调控局部抑制，并且延长异种细胞在肝脏中的存活。因此，与来自接受NSCs和非抑制性成纤维细胞的大鼠的人NSCs数目相比，来自给予LSCs的大鼠的更多数目的人NSCs得到复苏。当免疫应答针对异种NSCs被激活时，这2组之间最大的不同预计在1-2周后发生。通过测定人-特异性Alu重复序列，可以应用PCR检测来检测已经移植存活的人NSCs。

确定受体大鼠中针对注射细胞致敏的T细胞

设计实验，确定与大鼠成纤维细胞或与大鼠LSCs共同移植的人NSCs是否在受体大鼠外周淋巴结中致敏活性T细胞。可以使用单向MLR检测来评估这样的致敏。

从每组5只的2组大鼠(人NSCs+大鼠成纤维细胞vs人NSCs+大鼠LSCs)移除宫颈和肠系膜淋巴结(LNs)，每组小鼠在最终时刻，注射后一个月处死。将来自大鼠的LNs解离成单细胞悬浮液，并且在MLR检测中，与辐射的供体人NSCs一起用作效应细胞；大鼠成纤维细胞和大鼠LSCs用作刺激细胞(5×10⁴个细胞/孔)。用于这些实验的对照组可以是辐射的同系Fisher株系脾细胞作为刺激因子(背景)，单独在培养基中培养的LNCs，和单独在培养基中培养的辐射的刺激细胞。针对每种刺激群体的平均反应与针对同系脾细胞的背景反应相比较。

不希望受到任何具体理论的束缚，在异种人NSCs致敏受体大鼠的事件中，在MLR检测中，来自受体大鼠的T细胞应该给出针对作为刺激细胞的人NSCs的次级应答。相反，如果在共同移植LSCs和人NSCs后，施用给移植物受体的LSCs防止针对人NSCs的免疫应答，那么受体T细胞应该给出初级MLR反应。如果在共同移植LSCs和NSCs后，移植的LSCs耐受针对NSCs的受体T细胞，那么它们应该在MLR中给出减少的反应。

实施例4：LSCs与胰岛细胞的共同移植：

LSCs可以用于与同种异基因的胰岛细胞共同移植，用于治疗糖尿病。通过将胰岛与LSCs一起注射到受体的门静脉，而将同种异基因的胰岛引入受体，所述门静脉将所述细胞运送到肝脏，在这里胰岛滞留并且起作用，产生与葡萄糖反应的胰岛素。尽管不希望受到任何具体理论的束缚，但是，LSCs与同种异基因胰岛细胞的共同移植可以起作用，保护胰岛免受宿主的排斥，而不用使用免疫抑制药物。由于肝脏是它们的来源组织，LSCs还可以在肝脏中存活延长的时间阶段。

本领域的技术人员应该明白，在不背离本发明的精神或范围时，可以在本发明的方法和组合物中作出各种改进和改变。因此，目的是本发明涵盖本发明的改进和改变，条件是它们在附上的权利要求及其等价物范围之内。