抗人类食管癌侵袭转移的序列

摘要

本发明涉及抗人类食管癌侵袭转移的序列，所述序列为SEQ ID NO：1或SEQID NO：2。本发明涉及含有上述序列的质粒，pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1－1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1－2，及所述序列和质粒在制备抗人类食管癌侵袭转移的药物中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及抗人类食管癌侵袭转移的序列，所述序列为SEQ ID NO：1和SEQID NO：2。本发明涉及含有上述序列的质粒，pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2，及所述序列和质粒在制备抗人类食管癌侵袭转移的药物中的用途。

背景技术

现有技术中，细胞周期调控蛋白Cyclin B1(Cyclin B1；CCNB1)有称之为G2/mitotic specific cyclin B1 CCNB。本领域技术人员公知，在裂殖酵母有三种B型周期蛋白。其中之一是Cdc13，这是细胞进入有丝分裂所必需的。Booher，Beach初次报道本发明所述的基因序列[Booher，Beach(1988)EMBO J 7：2321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91：587]。其他两个名为Cig1[Bueno et al.(1991)Cell 65：149]和Cig2[Bueno，Russell(1993)Mol Cell Biol 13：2286；Connolly，Beach(1994)Mol CellBiol 14：768]，)它们并非有丝分裂周期所必需的。Gautier等证明，与Cdc2结合成复合物的周期蛋白B是非洲爪蟾MPF的主要成分[Gautier et al.(1990)Cell 60：487]。

Pines和Hunter克隆到编码周期蛋白B的人类基因[Pines，Hunter(1989)Cell 58：833]，他们与Giordano等一道[Giordano et al.(1989)Cell 58：981]也证明人周期蛋白B和Cdc2之间所形成的复合物在有丝分裂期间作为激酶其活性最高。

本领域技术人员知道在细胞周期的调控中，有三类分子起着重要作用，分别为：细胞周期素(Cyclins)、细胞周期素依赖性激酶(CDKs)和细胞周期素依赖性激酶抑制子(CKIs)。其中Cyclins和CDKs对细胞周期起正性调控作用，CKIs起负性调控作用。当受到生长信号的刺激时，Cyclins表达上调，激活相应CDKs，形成Cyclins/CDKs复合物，使多种底物蛋白磷酸化，从而推动细胞沿细胞周期不断分裂增殖。CKIs可以与Cyclins、CDKs或两者的复合物结合，抑制其活性，从而起到负性调控的作用。

目前已经确定的Cyclins共有11种，其中Cyclins D和Cyclins E主要调控G1/S转换，CyclinsA主要调控S期的进展，而Cyclins B主要与G2/M期转换有关。

细胞周期调控蛋白Cyclin B1是Cyclin B家族的成员之一[Brandeis M，Rosewell I，Carrington M，Crompton T，Jacobs MA，Kirk J，Gannon J，Hunt T.CyclinB2-null mice develop normally and are fertile whereas cyclin B1-null mice die in utero.Proc.Nat.Acad.Sci.95：4344-4349，1998]。其基因由九个外显子和八个内含子组成。基因的表达从S期后期开始，G2期达到最高峰，进入M期后其蛋白产物降解失活。在Cyclin B1的诱导下，CDC2(又称CDK1、P34)的激活酶CAK(主要由CDK7和Cyclin H组成)将其磷酸化，紧接着在有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的Weel/Mik1作用下，它又被再次磷酸化而失活。在G2/M期过渡时，磷酸化酶CDC25C解除这一使CDK1失活的磷酸化，使之具有蛋白激酶活性，因此，Cyclin B1/CDC2被认为是有活性的成熟促进因子(MPF，也称M期促进因子)。反过来，激活的CyclinB1/CDC2又能磷酸化CDC25C来促进Cyclin B1/CDK1的磷酸化，如此形成了一个正反馈环路[Poon RY，Chau MS，Yamashita K，Hunter T.The role of Cdc2feedback loop control in the DNA damage checkpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)：5168-78.]。CDC25C的活化需要PLK激酶的参与，有证据表明，CDC2本身就能激活PLK的活性，这又构成了另一条正反馈途径。在这些正反馈途径的综合作用下，MPF在激酶活性上完成瞬间的爆发式增加[Roshak AK，Capper EA，Imburgia C，Fornwald J，Scott G，Marshall LA.The human polo-like kinase，PLK，regulates cdc2/cyclin B through phosphorylation and activation of the cdc25Cphosphatase.Cell Signal.2000 Jun；12(6)：405-11.；Yoshima-Morimoto F，Taniguchi E，Shinya N，Iwamatsu A，Nishida E.Polo-like kinase 1 phosphorylates cyclin B1 andtargets it to the nucleus during prophase.Nature.2001 Mar 8；410(6825)：215-20.Erratum in：Naure 2001 Apr 12；410(6830)：847.；Yuan J，Eckerdt F，Bereiter-Hahn J，Kurunci-Csacsko E，Kaufmann M，Strebhardt K.Cooperative phosphorylationincluding the activity of polo-like kinase 1 regulates the subcellular localization ofcyclin B1.Oncogene.2002 Nov 28；21(54)：8282-92.]。Cyclin B1/CDC2复合物从细胞质进入细胞核，使相应的底物磷酸化，推动G2/M期转换。

Hunter等人认为，在恶性细胞进入S期和G2期时，Cyclin B1过表达并积累，与CDC2形成过多的成熟促进因子，在活性和功能异常的Weel/Mik1、CAK的作用下形成不成熟激活的Cyclin B1/CDC2/CDC25C正反馈环，激活肿瘤细胞中过表达的成熟促进因子，其高水平表达触发并通过恶性细胞有缺陷的G2/M期监测点而引发核内重要蛋白结构的改变，推动细胞进入M期[Poon RY，Chau MS，Yamashita K，Hunter T.The role of Cdc2 feedback loop control in the DNA damagecheckpoint in mammalian cells.Cancer Res.1997 Nov 15；57(22)：5168-78.；WatanabeN，Broome M，Hunter T.Regulation of the human WEE1Hu CDK tyrosine 15-kinaseduring the cell cycle.EMBO J.1995 May 1；14(9)：1878-91.]。

Cyclin B1蛋白也是一种公知的蛋白序列[参见：Booher，Beach(1988)EMBO J7：2321；Hagan et al.(1988)J Cell Sci 91：587]，在脑胶质瘤、喉鳞癌、舌鳞癌、血管瘤、小细胞肺癌、滋养细胞疾病、乳腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、非何杰金淋巴瘤、直肠癌以及肝癌等肿瘤中均有过表达。[Holtkamp N，Afanasieva A，Elstner A，Brain slice invasion model reveals genes differentially regulated in glioma invasion.Biochem Biophys Res Commun.2005 Nov 4；336(4)：1227-33.；Bondi J，Husdal A，Bukholm G，Expression and gene amplification of primary(A，B1，D1，D3，and E)andsecondary(C and H)cyclins in colon adenocarcinomas and correlation with patientoutcome.J Clin Pathol.2005 May；58(5)：509-14.；Mao Y，Wu J，Skog S，Expressionof cell proliferating genes in patients with non-small cell lung cancer byimmunohistochemistry and cDNA profiling.Oncol Rep.2005 May；13(5)：837-46.；Bjorck E，Ek S，Landgren O，High expression of cyclin B1 predicts a favorable outcomein patients with follicular lymphoma.Blood.2005 Apr 1；105(7)：2908-15.Epub 2004Dec 2.]。现有技术中未见报道哺乳动物包括人细胞周期调控蛋白Cyclin B1在促进人类食管癌侵袭转移中的作用。

本发明申请人在专利申请200610095761.5中公开了细胞周期调控蛋白CyclinB1在制备抗人类食管癌侵袭转移药物中的用途。在该发明的基础上，本发明人构建了两个短序列，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。同时将这两个序列构建到质粒载体pGCsi/U6/neo/GFP中，形成pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2(保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市海淀区中关村北一条13号；保藏日期：2006年12月12日；保藏编号：CGMCCNo.1885和CGMCCNo.1886；分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli)，所述质粒载体在脊椎动物细胞内表达针对CCNB1构建了两个靶点的RNAi载体，经测序证实了克隆的RNAi打靶序列100％正确。该载体可同时表达GFP，用于判断转染效率。

申请人研究发现，转染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2可以干扰人类食管癌细胞内源性Cyclin B1在RNA水平、蛋白水平的表达，可以特异性的阻遏人类食管癌的肺转移。

发明内容

本发明涉及抗人类食管癌侵袭转移的序列，所述序列为SEQ ID NO：1(基因名称：CCNB1-1)和SEQ ID NO：2(基因名称：CCNB1-3)。

另一方面，本发明涉及含有SEQ ID NO：1的pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1质粒和含有SEQ ID NO：2的pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2质粒。

本发明进一步涉及本发明序列和含有所述序列的质粒在制备抗人类食管癌侵袭转移的药物中的用途。

本发明的序列可以通过本领域已知的方法得到，包括化学合成、固相合成等。

附图说明

图1是质粒(载体)特征图，其中shRNA代表本发明序列SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2。

图2，3显示了质粒的测序结果，其中划线部分为所需要的片段序列和其反义核苷酸序列，其与设计得到的序列完全一致。

图4是Western blot检测12株食管癌细胞Cyclin B1蛋白的表达图，其中现有技术的方法提取KYSE2，KYSE30，KYSE140，KYSE150，KYSE180，KYSE410，KYSE450，KYSE510，COLO-680，EC9706，T12，KYSE70等12株食管癌细胞的总蛋白，采用Western blot方法检测Cyclin B1蛋白的表达水平，图中条带深浅代表蛋白表达水平的高低。EC9706作为Cyclin B1高表达的研究对象。

图5是单克隆的筛选与鉴定(Western Blot)图，其中提取不同单克隆细胞的总蛋白，采用Western blot方法检测Cyclin B1蛋白的表达水平，图中条带深浅代表蛋白表达水平的高低。挑选编号为17、42的单克隆细胞作为低表达Cyclin B1的细胞。

图6是单克隆的筛选与鉴定(RT-PCR)图，其中提取不同单克隆细胞的总RNA，采用RT-PCR方法检测Cyclin B1 RNA水平的表达情况，图中条带亮度的深浅代表RNA表达水平的高低。挑选编号为17、42的单克隆细胞作为低表达Cyclin B1的细胞。

图7：是RT-PCR、Western Blot检测克隆Cyclin B1表达情况说明图，检测转染pGCsi/U6/neo/GFP/cyelin B1质粒低表达Cyclin B1蛋白的食管癌细胞与转染空载体细胞之间Cyclin B1表达的差异。

图8是高表达Cyclin B1的稳定细胞株细胞生长曲线图，其中消化细胞后，进行计数，然后接种在六孔板中，每孔30000个细胞。每隔24小时取出一板，消化细胞后，再分别计数。最后计算均值，绘制曲线。

图9是克隆形成试验结果图，其中消化细胞，计数，接种在100mm的培养皿中，每皿1000个细胞，培养2周，固定、染色，分别计数。

图10是穿透试验结果图，其中带有8μm小孔的聚碳酸脂膜置于两层小室之间，在上层小室的50μl培养基中包含1×104个细胞，下层小室的30μl基质中含有5μg/mlfibronectin，37℃5％CO2的孵箱孵育6小时。小心刮下没有迁移的上层细胞后，聚碳酸脂膜在甲醇中固定10分钟，Giemsa染色1小时。显微镜下观察，照相计数。随机取10个视野计数，统计数值，绘制柱形图。

图11是裸鼠肿瘤体积曲线，其中于BALB/C裸鼠右侧背部(近尾侧)接种人类食管癌细胞，200万细胞/只，每7天观察一次，测量肿瘤大小，依据公式v＝4/3πr1²r2(r1为短径，r2为长径)，计算肿瘤大小，绘制曲线。

图12是取接种人类食管癌细胞的裸鼠连续观察3个月，之后处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，作病理H&E染色，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。转染pGCsi/U6/neo/GFP-cyclin B1质粒低表达Cyclin B1蛋白的食管癌细胞显著抑制裸鼠肿瘤肺转移。其中，a图为正常肺组织，即接种低表达cyclin B1的单克隆食管癌细胞的裸鼠的肺组织；b图为有转移的肺组织，即接种EC9706食管癌细胞的裸鼠的肺组织；c，d为b的高倍图象。

实施例

发明人是通过以下的实验得到并进一步证实我们的实验结果的：

1.质粒的构建

pGCsilencer^TM U6/Neo/GFP/RNAi载体构建报告

描述：该载体在脊椎动物细胞内表达针对CCNB1共构建了三个靶点的

      RNAi载体，经测序证实了克隆的RNAi打靶序列100％正确。该载

      体可同时表达GFP，用于判断转染效率。

包装：产品形式：双链闭环DNA。

运输贮存：常温运输(不会影响DNA质量)。可贮存于-20℃。避免反复冻融。

供货量：20ug冻干粉

质粒纯度：超纯抽提，可直接用于转染。

基因信息：CCNB1

Target信息：

  Target信息：  ACATGAGAGCCATCCTAAT  GAAATGTACCCTCCAGAAA

构建框架序列：

  基因名称  正义链  LOOP  反义链  CCNB1-1  5′-ACATGAGAGCCATCCTAAT  TTCAAGAGA  ATTAGGATGGCTCTCATGT-3′  CCNB1-3  5′-GAAATGTACCCTCCAGAAA  TTCAAGAGA  TTTCTGGAGGGTACATTTC-3′

测序结果与样品编号对应关系：

  样品管编号  测序结果文件名  CCNB1-1  G04.CS061027137_0480.D342-1.SDII-F  CCNB1-3  C01.CS061107128_0541.D343-2.SD11-F  测序及PCR引物名称  引物序列  起始  终止  5′引物(pgc-u6f)  5’-CAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3’  5887  5904

1.1.质粒(载体)特征见图1，其中shRNA代表本发明序列SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2。

1.2.质粒的测序结果见图2和3，其中划线部分为所需要的片段序列和其反义核苷酸序列，其与设计得到的序列完全一致。质粒pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1的序列为SEQ ID NO：3，质粒pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2的序列为SEQ IDNO：4。

2.药理实验

1.利用Western blot检测12种食管癌细胞系，筛选出Cyclin B1蛋白高表达的细胞系，分别将pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2质粒转染细胞(参照Lipofectamine^TM2000说明)，通过RT-PCR、Western blot检测手段挑选Cyclin B1蛋白低表达的单克隆，构建稳定细胞株。再采用生长曲线、Transwell等细胞生物学方法观察高表达Cyclin B1的细胞株与转染空载体的阴性对照在细胞生物学方面的差异。

RT-PCR所采用的引物：

Cyclin B1：上游：5-TCC AAG CCC AAT GGA AAC AT-3

           下游：5-ATG CTC TCC GAA GGA AGT GC-3

           产物大小：551kbp

GAPDH：    上游：5-GCT GAG AAC GGG AAG CTT GT-3

           下游：5-GCC AGG GGT GCT AAG CAG TT-3

           产物大小：299kbp

Western Blot采用的抗体：

  抗体  公司  产品号  纯化的小鼠抗-人  CyclinB1  PharMingen  554176  old：14541A  B-肌动蛋白(c-2)  Santa Cruz  Biotechnology  Sc-8432 抗小鼠IgG IgG HRP结合  Promega  W402B

生长曲线的绘制：

(1).消化细胞，计数，接种在六孔板中，每孔30000个。

(2).每隔24小时取出一板，消化细胞，分别计数。

(3).七天后统计数值，绘制生长曲线。

克隆形成：

消化细胞，计数，接种在100mm的培养皿中，每皿1000个细胞，培养2周，固定、染色，分别计数。

穿透试验(Trans-well)：

使用Chemotaxis Chamber(Neuro Probe，USA)检测细胞的侵袭能力。在上层小室的50μl培养基中包含1×10⁴个细胞，下层小室的30μl基质中含有5μg/mlfibronectin(Sigma，USA)。带有8μm小孔的聚碳酸脂膜置于两层小室之间，37℃5％CO₂的孵箱孵育6小时。小心刮下没有迁移的上层细胞后，聚碳酸脂膜在甲醇中固定10分钟，Giemsa染色1小时。显微镜下观察，照相计数。随机取10个视野计数，统计数值，绘制柱形图。

试验结果：

在上述12种食管癌细胞系中，EC9706细胞系Cyclin B1的蛋白表达量高(见图7)。通过转染EC9706细胞系，并利用细胞免疫荧光、Western blot检测方法获得稳定低表达Cyclin B1的细胞株(见图5、6、7)。低表达Cyclin B1的稳定细胞株与转染pGCsi/U6/neo/GFP-NON的阴性对照组细胞株相比，细胞生长速度明显减慢，生长曲线呈显著减慢上升趋势(见图8)。克隆形成试验表明分别转染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2质粒的细胞株的克隆形成能力明显低于转染pGCsi/U6/neo/GFP-NON的阴性对照组细胞株。穿透检测表明上述低表达Cyclin B1的细胞株穿透能力明显低于转染pGCsi/U6/neo/GFP-NON的阴性对照组细胞株(见图10)。说明Cyclin B1可导致肿瘤细胞的恶性度增加、肿瘤细胞的转移能力增强。

2.裸鼠致瘤实验

选用4周龄BALB/C裸鼠(购于中国医学科学院肿瘤医院动物中心)，雌雄各半，于裸鼠右侧背部(近尾侧)接种人类食管癌细胞，100万细胞/只，每7天观察一次，测量肿瘤大小，观察裸鼠一般情况，连续观察3个月，分别在28天、70天以及3个月之后处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，作病理H&E染色，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。本实验重复了三次。

裸鼠致瘤实验共分为四组接种，细胞分别为EC9706、转染pGCsi-U6/neo/GFP-NON质粒、分别转染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2质粒的细胞克隆(克隆1、克隆2)，每组10只裸鼠。重复3次。

依据公式v＝4/3πr₁²r₂(r₁为短径，r₂为长径)，计算肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。(见图11)

试验结果：

H&E染色结果显示，肿瘤为上皮来源，确为接种的人类食管癌细胞导致肿瘤发生。pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2质粒转染的细胞克隆(克隆1、2)接种裸鼠后，肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤体积显著小于EC9706、pGCsi-U6/neo/GFP-NON。EC9706、pGCsi-U6/neo/GFP-NON接种裸鼠后，肿瘤侵犯肌层、横纹肌、骨，远处可见肺转移，特别是肺转移比例为50-70％，而转染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1和pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2质粒的细胞克隆1、2细胞组未见有肺转移(见图12)。

表1显示本实施例的肿瘤侵袭、转移情况统计情况。

  EC9706  空载  低表达1  低表达2  侵袭  骨组织  横纹肌  10  15  9  14  0  0  0  0  转移  肺转移  肝转移  胃转移  脑转移  脾转移  肾转移  淋巴转移  21  0  0  0  0  0  0  20  0  0  0  0  0  0  1  0  0  0  0  0  0  2  0  0  0  0  0  0  总例数  30  30  30  30

注：裸鼠致瘤实验，共分为四组接种，分别为EC9706、空载、低表达1为转染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-1质粒的细胞克隆(克隆1)，低表达2为转染pGCsi/U6/neo/GFP/cyclin B1-2质粒的细胞克隆(克隆2)，每组10只裸鼠。重复3次。处死，取裸鼠的肿瘤、肺、脑、肝、肾等脏器，作病理H&E染色，观察肿瘤局部侵袭、脏器转移情况。此表为侵袭、转移情况统计结果。

                        序列表

<110>中国医学科学院肿瘤研究所

<120>抗人类食管癌侵袭转移的序列

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>1

acatgagagc catcctaat                                            19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>

<400>2

gaaatgtacc ctccagaaa                                            19

<210>3

<211>1161

<212>DNA

<213>人工构建

<220>

<223>

<400>3

gcatatacga tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa    60

gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt    120

aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt    180

cttgggttta tatatcttgt ggaaaggacg cgggatccca catgagagcc atcctaattt    240

caagagaatt ggatggctc  tcatgttttt tggatagctt aagtttaaac cgctgatcag    300

cctcgactgt ccttctaaa  tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    360

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    420

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc    480

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt    540

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt    600

atgcccagta atgacctta  tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca    660

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg    720

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc    780

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ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc    900

cgctagcgct accgggtcgc caccatggcc agcaagggcg aggagctgtt catcggcgtg    960

tgcccatcct gtggagctgg acggcgatgt gaatggccac aagttcagcg tgagcgcgag    1020

ggcgagggcg atgctaccta cggcagctga ccctgagttc atctgcacca ccgggcaagc    1080

tgctgtgccc tgatcacctg atgacacctg agctacgcgt gcagtgcttc tcaagccaac    1140

cccgaatcac atgaagcatc g                                              1161

<210>4

<211>1064

<212>DNA

<213>人工构建

<220>

<223>

<400>4

gcatatacga tacaaggctg ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa    60

gatattagta caaaatacgt gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt    120

aaaattatgt tttaaaatgg actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt    180

cttgggttta tatatcttgt ggaaaggacg cgggatcccg aaatgtaccc tccagaaatt    240

caagagattt ctggagggta catttctttt tggatagctt aagtttaaac cgctgatcag    300

cctcgactgt gccttctaaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata    360

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc    420

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