高纯度、高分子量甲氧基－聚乙二醇(MPEG)

摘要

本发明涉及新型的高分子量和高纯度mPEG醇组合物以及在聚合完成之后通过从mPEG醇脱除PEG二醇获得该组合物的方法。

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及新型的高分子量和高纯度mPEG醇组合物以及通过从mPEG醇脱除PEG二醇获得该组合物的方法。

2.现有技术的描述

可以通过将它们与聚(乙二醇)(PEG)共轭以改进生物活性分子的治疗效率。PEG通常是一个末端羟基由甲基封端和活化其它羟基用于共轭的线性聚(乙二醇)。活化的mPEG从mPEG醇中制得，它依次典型地通过引发环氧乙烷与甲醇或其同等物的阴离子聚合而制得。如果在聚合中存在水，那么它形成羟基在两个末端的线性PEG。由于PEG二醇经历与mPEG醇相同的活化和共轭化学作用，所以它在mPEG醇中的存在不是所需的。

PEG二醇的数量可以通过降低聚合反应器中的水量而降低。U.S.专利No.6,455,639公开了在非常干燥的条件下由EO的聚合而生产分子量至多为20,861的mPEG醇。获得这些非常低的水含量需要极大的努力。

或者，PEG二醇可以转化成它的非反应性二甲基醚。这由如下方式进行：引发EO与苄醇的聚合，全甲基化所有的羟基(在苄基PEG和PEG二醇两者上)，和然后脱除苄基以得到mPEG醇和二甲基PEG(U.S.6,448,369)。PEG二醇的全甲基化要求两个另外的化学步骤，和所需mPEG醇的浓度由二甲基PEG的存在降低。

除上述方法以外，用于过量二醇脱除的各种纯化技术已经在文献中有描述。Snow(Snow US专利5,298,410，1994)将所有的羟基转化成二甲氧基三苯甲基醚，由反相色谱分离双三苯甲基PEG与甲基三苯甲基PEG，和然后从甲基三苯甲基PEG脱除三苯甲基以得到mPEG。Lapienis(Lapienis和Penczek，J.Bioactive CompatiblePolymer，16，206(2001))使用超滤以纯化2K mPEG，尽管分析指示如果有的话较少的PEG被脱除。Kazanskii(Kazanskii等人，Polymer Science Ser.A，42，585(2000))也使用超滤以脱除杂质。Kokufuta(Kokufuta等人，Polymer，24，1031(1983))描述了通过将它与聚丙烯酸(PAA)配合而使PEG的分子量分布变窄。

以上引用的所有现有技术使用分子量为5kDaltons或更小的mPEG醇。连接到PEG的生物活性分子的寿命随PEG的分子量增加。因此，需要使用分子量为至少10kDaltons的mPEG醇。

发明概述

本发明涉及新型的高分子量和高纯度mPEG醇组合物以及通过使用分离技术以从mPEG脱除PEG二醇而获得该组合物的方法。

优选实施方案的详细描述

本发明包括具有至少95重量％化学纯度，小于1.1的多分散性数值和10,000道尔顿至约60,000道尔顿的确定分子量的单甲氧基聚(乙二醇)。优选，本发明的单甲氧基聚(乙二醇)的多分散性数值小于1.05。本发明进一步包括获得具有至少95重量％化学纯度，小于1.1的多分散性数值和至少10,000道尔顿直到约60,000道尔顿的确定分子量的单甲氧基聚(乙二醇)的方法。方法包括提供不纯的单甲氧基聚(乙二醇)的第一步骤，其特征为含有一种或多种杂质的单甲氧基聚(乙二醇)，该杂质包括聚(乙二醇)[以下″PEG二醇″]和低分子量有机和无机分子。不纯的单甲氧基聚(乙二醇)可以根据″Poly(Ethylene Oxide)″(F.E.Bailey，Jr.和J.V.Koleske，Academic Press，纽约，1976)中描述的公知聚合技术获得。

通过一种或多种分离技术如，但不限于聚合物吸附/解吸、超滤、色谱、沉淀或一种或多种以上方法的组合直接纯化不纯的单甲氧基聚(乙二醇)。然后将分离的PEG二醇和低分子量有机或无机分子从纯化的单甲氧基聚(乙二醇)中脱除。PEG二醇的分子高可以高于或低于由此获得的纯化的单甲氧基聚(乙二醇)。

在本发明的一个实施方案中，分离技术包括聚合物吸附/解吸。聚合物吸附/解吸优选包括在质子溶剂存在下采用包含重复侧官能团的聚合物处理不纯mPEG醇，该官能团能够与mPEG醇和/或PEG二醇的醚氧原子氢键合。优选地，侧官能团选自CO₂H、SO₃H、PO₃H₂、NH、NH₂、OH或SH。优选地，聚合物是聚酸。更优选地，聚合物是聚(羧酸)。最优选地，聚合物是交联聚(羧酸)树脂。优选地，质子溶剂选自水、C_1-3醇或其混合物。更优选地，质子溶剂是水。

在本发明的第二实施方案中，分离技术包括超滤。超滤包括使不纯的mPEG醇溶液与适当孔度的膜接触以使更低分子量的材料通过膜和被脱除。

色谱的分离技术包括在由活性载体填充的柱子的一端上放置聚合物，使合适的溶剂通过柱子，并且在柱子的另一端收集级分。将不纯醇的各种组分在柱子上分离和在单独的级分中收集。

mPEG聚合物的PEG二醇含量的分析由临界条件HPLC分析进行(Gorshkov；J.Chrom.523，91(1990)；Kazanskii等人，Polymer ScienceSer.A，42，585(2000)；Lapienis和Penczek，J.Bioactive BiocompatPolymer，16，206(2001)。由于聚合物的保持时间与分子量无关，仅是聚合物端基的函数，因此临界条件色谱用于此应用以从PEG二醇中进行mPEG的分析性分离。具体地在此情况下，将mPEG和PEG二醇聚合物采用3，5-二硝基苯甲酰氯衍生和在临界点下在具有UV检测的反向分析柱上进行分离。

沉淀的分离技术包括通过加入混溶非溶剂，通过受控冷却，或由溶剂的受控蒸发，从溶液中连续沉淀聚合物。具有更高分子量的聚合物首先沉淀。

在本发明的优选实施方案中，方法进一步包括由分离技术从水溶液分离纯的单甲氧基聚(乙二醇)组合物的步骤，该分离技术选自喷雾干燥、非溶剂的加入、萃取入良好溶剂随后加入非溶剂或在真空下溶剂的蒸发。更优选的分离技术包括喷雾干燥。喷雾干燥的步骤包括将聚合物溶液喷入腔室以形成小滴，在热空气流中蒸发该小滴的溶剂以得到干燥粉末。

实施例

实施例1-超滤

从30K mPEG中脱除低分子量聚合物

将3.8kg粗制mPEG样品(Mp31,491，5.0mol％二醇)溶于约75kg DI水并加载到超滤进料罐。安装Osmonics 2.5m² 10K MWCO膜(型号#PW2540F1080)。在28％输出下开启循环泵。调节渗余物和渗透物背压阀以达到15lpm的渗余物流量和30psi经膜压力。将罐容积初始浓缩到约40升，在此时间连续加入DI水以保持恒定的罐体积。在约0.4lpm的平均速率下收集总计303kg的渗透物。复合样品的GPC分析指示渗透物包含0.7kg mPEG。渗透物的GPC图明显显示为更低分子量材料。将进料罐中的渗余物进一步浓缩到约33升和然后通过0.2微米聚丙烯抛光过滤器排出。通过GPC，最终32.9kg渗余物样品包含7.6％mPEG(2.5kg mPEG)。将DI水加载到进料罐和循环约15分钟以清洗膜和管线。GPC分析指示36.3kg清洗样品包含另外0.6kg mPEG。使用喷雾干燥器分离最终渗余物样品中的mPEG。最终分离产物中的二醇浓度是2.7mol％。

实施例2-聚丙烯酸(PAA)

在环境温度下从20K mPEG中脱除高分子量组分

将粗制20kDa mPEG溶于DI水以制备mPEG的1.49重量％溶液。将317.3g此溶液加入装配机械搅拌器的1-L锥形瓶中。在搅拌的同时，加入总计21g Dowex MAC-3 PAA离子交换树脂(包含48重量％水)。将反应在25℃下搅拌42小时。过滤树脂。相应滤液的GPC分析指示高分子量组分从8.6降低到0.3面积％。

在更高温度下从20K mPEG中脱除高分子量组分

将粗制20 kDa mPEG溶于DI水以制备mPEG的1.19重量％溶液。将571.2g此溶液加入装配水循环浴，机械搅拌器，冷凝器，和N₂吹扫的1-L圆底烧瓶中。在搅拌的同时，加入22.4g Dowex MAC-3 PAA离子交换树脂(包含～50重量％水)和0.083g对苯二酚。将反应在63℃下搅拌4.3小时。过滤树脂。相应滤液的GPC分析指示高分子量组分从9.2降低到0.6面积％。

从20K mPEG中脱除高和低分子量组分

将8017.1g的0.725％含水mPeg加入装配机械搅拌器，冷凝器，温度控制器，和N₂吹扫的12升圆底烧瓶。在搅拌的同时，加入93g DowexMAC-3 PAA(包含～50％水)和1.4g对苯二酚。将反应在56℃下搅拌39小时。将包含高分子量PEG组分的树脂通过过滤分离和抛弃。收集包含31g mPEG的7900g滤液和GPC分析显示高分子量组分从4.6降低到0.2面积％。

将滤液与91g新PAA(足以配合大于75％的mPEG)一起加回反应器。将反应混合物在61℃下搅拌32小时。将包含mPEG的PAA树脂通过过滤收集和抛弃滤液(7872g)。将115g PAA树脂湿饼(包含mPEG)采用去离子水洗涤并与237g 30％含水四氢呋喃(THF)一起加回反应器。将混合物在25℃下搅拌20小时。将现在从其脱除mPEG的PAA树脂从mPEG溶液中通过过滤分离和抛弃。滤液的GPC分析显示低分子量组分从4.0降低到0.7％。将THF从滤液脱除和通过采用氯仿萃取滤液分离14.8g mPEG。

实施例3-喷雾干燥

Buchi B-191 Mini喷雾干燥器采用如下操作参数设置：氮气流量是700L/h，入口温度是95℃，真空吸气器是最大速度的50％，和将DI水以最大速率的15％加入。在平衡系统30分钟之后，出口温度是36℃。将包含3.0重量％mPEG(28.5g)的951-g水溶液以最大速率的15％加载。在3小时和10分钟加料过程中，将入口温度调节到97，然后99℃。出口温度为36～38℃。从旋流分离顺收集总计作为绒毛状白色粉末的9.5g mPEG。由卡尔费休滴定，MPEG包含0.31重量％水。

实施例4-PAA，超滤，和喷雾干燥

将mPEG样品(Mp 28164，3.6mol％PEG二醇)如上所述用PAA处理以提供包含92.7g聚合物的15.2-kg水溶液。将溶液使用Osmonics10K MWCO聚醚砜膜如上所述进行超滤以提供包含67.7g聚合物的3.2-kg水溶液。将一部分水溶液如上所述喷雾干燥以提供包含1.3mol％PEG二醇的9.1g mPEG聚合物(Mp 29178)。