分离的谱系阴性造血干细胞及用其治疗的方法

摘要

分离的、哺乳动物的、成体骨髓源的、谱系阴性的造血干细胞群(Lin－HSC)包含能够拯救眼中的视网膜血管与神经元网络的内皮祖细胞(EPC)。优选地，分离的Lin－HSC中至少约20％的细胞表达细胞表面抗原CD31。分离的Lin－HSC群用于治疗眼血管疾病和改善视网膜中的视锥细胞变性。在一个优选实施方案中，Lin－HSC群如下分离：抽取成体哺乳动物骨髓；从骨髓中分离多种单核细胞；用针对一种或多种谱系表面抗原的生物素缀合的谱系群体抗体标记单核细胞；从多种单核细胞中除去谱系表面抗原阳性的单核细胞，并回收含EPC的Lin－HSC群。还可用治疗上有用的基因转染分离的Lin－HSC。通过用激光刺激视网膜中活化星型胶质细胞的增殖可增强治疗。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请为2004年4月28日提交的美国专利申请序号10/833,743的部分继续申请，美国专利申请序号10/833,743是2003年7月25日提交的美国专利申请序号10/628,783的部分继续申请，美国专利申请序号10/628,783要求2002年7月25日提交的临时专利申请序号60/398,522以及2003年5月2日提交的临时专利申请序号60/467,051的权益，上述申请的全部公开内容均通过引用结合到本文中。

政府利益声明

本文所述工作的一部分由美国国家癌症研究所资助号CA92577及美国国立卫生研究院资助号EY11254、EY12598与EY125998资助。美国政府在本发明中具有某些权利。

发明领域

本发明涉及分离的哺乳动物干细胞。更具体地说，本发明涉及骨髓源的谱系阴性造血干细胞(Lin^-HSC)群，以及通过用分离的Lin^-HSC群治疗哺乳动物眼睛来保持患有眼退化性疾病的哺乳动物视网膜中的视锥细胞的方法。

发明背景

年龄相关性黄斑变性(ARMD)与糖尿病性视网膜病变(DR)在工业化国家中是视力丧失的主因，由异常的视网膜血管新生所致。因为视网膜由界限清楚的神经元层、神经胶质层和血管元件层组成，所以诸如在血管增生或水肿中可见的相对小的紊乱即可导致视觉功能显著丧失。遗传性视网膜变性，例如色素性视网膜炎(RP)，也与诸如微动脉狭窄及血管性萎缩之类的血管异常相关。大部分遗传性人视网膜变性明确地侵袭视杆光感受器，但也存在伴随的视锥丧失，视锥是黄斑的主要细胞元件，黄斑是人视网膜中负责集中、精细的视敏度的区域。视锥特异性存活因子近来已有描述(Mohand-Said等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：8357-8362)，可利于视网膜变性小鼠模型中的视锥存活。

遗传性视网膜变性影响多1/3500的个体，其特征是进行性夜盲、视野缺损、视神经萎缩、小动脉变细、血管透性改变及通常会发展为全盲的视野中心缺损(Heckenlively，J.R.编，1988；RetinitisPigmentosa，Philadelphia：JB Lippincott Co.)。这些疾病的分子遗传学分析已在110多种不同基因中识别出突变，这些突变解释了仅相对较小百分率的受侵袭个体(Humphries等，1992，Science 256：804-808；Farrar等，2002，EMBO J.21：857-864)。这些突变中有很多都与包括视紫红质、cGMP磷酸二酯酶、rds外周蛋白及RPE65在内的光转导器中的酶和结构组分相关。尽管有这些观察结果，但仍没有减缓或逆转这些视网膜变性疾病进展的有效疗法。在将野生型转基因传递到有特定突变的动物的光感受器或视网膜色素上皮(RPE)时，基因疗法的新进展已实现了小鼠中rds(Ali等，2000，Nat.Genet.25：306-310)及rd(Takahashi等，1999，J.Virol.73：7812-7816)表型与狗中RPE65表型(Acland等，2001，Nat.Genet.28：92-95)的成功逆转。

多年来已知在正常成人循环系统与骨髓中存在一个干细胞群。这些细胞的不同亚群可依照造血谱系阳性(Lin⁺)或谱系阴性(Lin^-)谱系分化。此外，近来已表明谱系阴性造血干细胞(HSC)群含有能够在体外和体内形成血管的内皮祖细胞(EPC)(参见Asahara等，1997，Science275：964-7)。这些细胞可参与正常的和病理性的出生后血管发生(参见Lyden等，2001 Nat.Med.7，1194-201；Kalka等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A.97：3422-7；及Kocher等，2001，Nat.Med.7：430-6)，以及分化成多种非内皮细胞类型，包括肝细胞(参见Lagasse等，2000，Nat.Med.6：1229-34)、小胶质细胞(参见Priller等，2002 Nat.Med.7：1356-61)、心肌细胞(参见Orlic等，2001，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.98：10344-9)及上皮细胞(参见Lyden等，2001，Nat.Med. 7：1194-1201)。尽管这些细胞已用于若干血管发生的实验模型，但EPC靶向新生血管的机制仍是未知的，而且尚没有确定将有效增加对特定血管系统有益的细胞数量的策略。

得自骨髓的造血干细胞是目前唯一普遍用于治疗用途的干细胞类型。骨髓HSC应用于移植已超过40年。目前，正在研究收获纯化的干细胞的先进方法，以开发出治疗白血病、淋巴瘤及遗传性血液病的疗法。已在少数人类患者中对干细胞在人中治疗糖尿病及晚期肾癌的临床应用进行了研究。

发明概述

本发明提供一种改善患有眼疾的哺乳动物视网膜中的视锥细胞变性的方法。该方法包括给予哺乳动物视网膜哺乳动物骨髓源的、分离的、谱系阴性的造血干细胞群的步骤，所述造血干细胞群包含造血干细胞和内皮祖细胞。所述细胞以足以延迟视网膜中的视锥细胞变性的量给予。

一种优选方法包括由患有眼疾的哺乳动物骨髓分离含内皮祖细胞的谱系阴性造血干细胞群，随后将分离的干细胞以足以改善视网膜中的视锥细胞变性的量玻璃体内注射入哺乳动物眼内。

本发明方法使用来源于哺乳动物骨髓的、分离的、哺乳动物的、谱系阴性的造血干细胞(Lin^-HSC)群(即在其细胞表面上不表达谱系表面抗原(Lin)的造血干细胞(HSC))。优选地，所述细胞为自体干细胞(即来源于待治疗个体哺乳动物的骨髓)。分离的哺乳动物Lin^-HSC群包含内皮祖细胞(EPC)，也称为内皮前体细胞，其在玻璃体内注射入眼中时选择性地靶向活化的视网膜星形胶质细胞。优选所述哺乳动物为人。

在一个优选实施方案中，本发明的Lin^-HSC群如下分离：由患有眼疾的哺乳动物抽取骨髓；从骨髓中分离多种单核细胞；用针对一种或多种谱系表面抗原的生物素缀合的谱系群体抗体标记单核细胞，除去谱系表面抗原阳性的单核细胞，然后回收含EPC的Lin^-HSC群。优选地，单核细胞用针对一种或多种谱系表面抗原的生物素缀合的谱系群体抗体来标记，所述谱系表面抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a(血型糖蛋白A)。优选地，本发明分离的Lin^-HSC群中至少约20％的细胞表达表面抗原CD31。然后将分离的细胞给予哺乳动物患病的眼，优选通过眼内注射给予。在一个优选实施方案中，至少约50％的分离的Lin^-HSC表达表面抗原CD31，至少约50％的分离的Lin^-HSC表达表面抗原CD117(c-kit)。

本发明Lin^-HSC群中的EPC广泛地渗入发育中的视网膜血管中和渗入视网膜的神经元网络中，并且仍稳定地渗入眼部新生血管和神经元网络中。正常小鼠视网膜主要为视杆，但是，在本发明方法治疗的小鼠中，Lin^-HSC治疗后被拯救的细胞令人惊讶地几乎全部是视锥。

在一个优选实施方案中，用一种治疗上有用的基因转染分离的Lin^-HSC群的细胞。例如，所述细胞可用有效编码神经营养物质或抗血管发生物质的多核苷酸转染，所述细胞选择性靶向新生血管系统，并在不影响既有血管的情况下通过一种基于细胞的基因治疗形式抑制新血管形成。在一个实施方案中，用于本发明方法的分离的Lin^-HSC群含有一种编码血管发生抑制肽的基因。血管发生抑制性Lin^-HSC可用于在诸如ARMD、DR及与异常血管系统相关的某些视网膜变性的疾病中调节异常血管生长。在另一个优选实施方案中，本发明的分离的Lin^-HSC含有编码神经营养肽的基因。神经营养性Lin^-HSC可用于促进眼疾中的神经元拯救，所述眼疾包括视网膜神经变性，例如青光眼、视网膜色素变性等。

用本发明的分离的Lin^-HSC群治疗眼的一个特别优势是，在用Lin^-HSC玻璃体内处理的眼中观察到血管营养性和神经营养性拯救作用。在用本发明分离的Lin^-HSC治疗的眼中，视网膜神经元及光感受器(尤其是视锥)得以保持，视觉功能的一些量度可以维持。

优选地，本发明方法要治疗的患病视网膜包含活化的星形胶质细胞。这可通过在有相关的神经胶质增生时早期治疗眼实现，或通过使用激光刺激活化的星形胶质细胞的局部增殖实现。

附图简述

在附图中：

图1图示了发育中的小鼠视网膜的示意图。(a)初级丛的发育。(b)视网膜血管形成的第二阶段。GCL，神经节细胞层；IPL，内丛层；INL：内核层；OPL，外丛层；ONL，外核层；RPE，视网膜色素上皮；ON，视神经；P，外周。图(c)图示了骨髓源Lin⁺HSC和Lin^-HSC分离细胞的流式细胞术特征。顶行：非抗体标记细胞的点阵图分布，其中R1确定阳性PE-染色的定量门控区，R2表示GFP-阳性；中间行：Lin^-HSC(C57B/6)；底行：Lin⁺HSC(C57B/6)细胞，每个细胞系都用Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-缀合抗体标记。Tie-2数据得自Tie-2-GFP小鼠。百分数表示总Lin^-HSC或Lin⁺HSC群中阳性标记细胞的百分比。

图2图示了Lin^-HSC植入发育中的小鼠视网膜中。(a)在注射后4天(P6)时，玻璃体内注射的eGFP⁺Lin^-HSC细胞在视网膜上附着并分化。(b)Lin^-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，用β-gal抗体染色)在用胶原蛋白IV抗体染色的血管系统(星号表示血管系统顶端)前建立其自身。(c)在注射后4天(P6)时，大多数Lin⁺HSC细胞(eGFP⁺)不能分化。(d)注射后4天(P6)时的肠系膜eGFP⁺鼠EC。(e)注射入成体小鼠眼中的Lin^-HSC(eGFP⁺)。(f)在GFAP-GFP转基因小鼠中依照已存在的星型胶质细胞模板归巢并分化的eGFP⁺Lin^-HSC(箭头处)的低倍放大。(g)Lin^-细胞(eGFP)与其下面的星型胶质细胞(箭头处)之间的缔合的高倍放大。(h)未注射的GFAP-GFP转基因对照。(i)注射后4天(P6)时，eGFP⁺Lin^-HSC向未来的深丛区迁移并经历分化。左图获取了整装视网膜中的Lin^-HSC活性；右图指示Lin^-细胞(箭头处)在视网膜(顶部是玻璃体面，底部是巩膜面)中的位置。(J)用α-CD31-PE及α-GFP-alexa 488抗体进行双重标记。注射后7天，注入的Lin^-HSC(eGFP，红色)渗入血管系统(CD31)中。箭头指示渗入区。(k)注射后14天(P17)eGFP⁺Lin^-HSC细胞形成血管。(l与m)心内注射罗丹明-葡聚糖表明在初级丛(l)与深丛(m)中的血管都是完整和有功能的。

图3表明，eGFP⁺Lin^-HSC细胞靶向神经胶质增生部位(由表达GFAP的星型胶质细胞指示，最左图)，其由激光(a)与机械(b)二者在成熟视网膜中诱发的损伤(星号表明损伤部位)诱导。最右图是一幅高倍放大图，表明Lin^-HSC与星型胶质细胞紧密缔合。校正条＝20μM。

图4表明，Lin^-HSC细胞拯救视网膜变性小鼠的血管。(a-d)，胶原蛋白IV染色的注射后27天(P33)的视网膜；(a)与(b)，用Lin⁺HSC细胞(Balb/c)注射的视网膜与正常FVB小鼠在血管系统方面未表现出差异；(c)与(d)，用Lin^-HSC(Balb/c)注射的视网膜显示出与野生型小鼠类似的丰富血管网络；(a)与(c)，用DAPI染色的整个视网膜的冰冻切片(顶部是玻璃体面，底部是巩膜面)；(b)与(d)，视网膜总量的深丛；(e)，条形图，表明在注射Lin^-HSC细胞的视网膜中形成的深血管丛的血管状态增加(n＝6)。深视网膜血管化的程度通过计算每幅图像中血管的总长来定量。比较了Lin^-HSC、Lin⁺HSC或对照视网膜中血管平均总长度/高倍视野(以微米为单位)。(f)用得自rd/rd小鼠的Lin^-HSC细胞(R，右眼)或Lin⁺HSC细胞(L，左眼)注射后进行深血管丛长度的比较。显示了6只独立小鼠的结果(一种颜色代表一只小鼠)。(g)与(h)Lin^-HSC细胞(Balb/c)在注入P15眼中时也拯救了rd/rd血管系统。显示了注入Lin^-HSC细胞(G)或Lin⁺HSC细胞(H)的视网膜(注射后一个月)的中间血管丛及深血管丛。

图5图示了小鼠视网膜组织的显微照片：(a)，视网膜整装片(rd/rd小鼠)的深层，eGFP⁺Lin^-HSC注射后五天(P11)可见(灰色)。(b)与(c)，于P6接受Balb/c Lin^-细胞(b)或Lin⁺HSC细胞(c)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠的P60视网膜血管系统。在(b)和(c)的左图中只可见内源内皮细胞(GFP-染色)。(b)和(c)的中图用CD31抗体染色；箭头指示用CD31而不用GFP染色的血管，(b)和(c)的右图显示了用GFP与CD31同时染色。(d)注射过Lin^-HSC的视网膜(左图)与对照视网膜(右图)的α-SMA染色。

图6表明，T2-TrpRS-转染的Lin^-HSC抑制小鼠视网膜血管系统的发育。(a)人TrpRS、T2-TrpRS和在氨基末端带有Igk信号序列的T2-TrpRS的示意图。(b)注射T2-TrpRS转染的Lin^-HSC的视网膜在体内表达T2-TrpRS蛋白。(1)在大肠杆菌中产生的重组T2-TrpRS；(2)在大肠杆菌中产生的重组T2-TrpRS；(3)在大肠杆菌中产生的重组T2-TrpRS；(4)对照视网膜；(5)注射过Lin^-HSC+pSecTag2A(只是载体)的视网膜；(6)注射过Lin^-HSC+pKLe135(pSecTag中的Igk-T2-TrpRS)的视网膜。(a)，内源TrpRS。(b)，重组T2-TrpRS。(c)，注射过Lin^-HSC的T2-TrpRS的视网膜。(c-f)，注射后7天，接受注射的视网膜的代表性初级(表层)丛与次级(深)丛；(c)与(d)，注射过空质粒转染的Lin^-HSC的眼发育正常；(e)与(f)，T2-TrpRS-转染的Lin^-HSC注射过的眼多数表现出深丛抑制作用；(c)与(e)，初级(表面)丛；(d)与(f)，次级(深)丛。在(f)中观察到的微弱血管轮廓是(e)中显示的初级网络血管的“渗漏”图像。

图7显示了编码His₆-标记的T2-TrpRS的DNA序列SEQ ID NO：1。

图8显示了His₆-标记的T2-TrpRS的氨基酸序列SEQ ID NO：2。

图9图示了小鼠视网膜的显微照片和视网膜电图(ERG)，所述小鼠的眼睛注射了本发明的Lin^-HSC和Lin⁺HSC(对照)。

图10图示了统计图，该图表明了用Lin^-HSC处理的rd/rd小鼠眼睛的中间血管层(Int.)和深血管层的神经元拯救(y-轴)和血管拯救(x-轴)之间的相关性。

图11图示了统计图，该图表明用Lin⁺HSC处理的rd/rd小鼠眼睛的神经元拯救(y-轴)和血管拯救(x-轴)之间没有相关性。

图12是用Lin^-HSC处理的rd/rd小鼠眼睛(暗条)和未处理的rd/rd小鼠眼睛(亮条)在注射后1个月(1M)、2个月(2M)和6个月(6M)的时间点以任意相对单位表示的血管长度(Y-轴)的条形图。

图13包含3张条形图，它们是注射后1个月(1M)、2个月(2M)及6个月(6M)时rd/rd小鼠外部神经层(ONR)的核数量，表明用Lin^-HSC处理的眼(暗条)的核数目相对于用Lin⁺HSC处理的对照眼(亮条)有显著增加。

图14描绘了个体rd/rd小鼠外部神经层核数量的图，该图比较了在(注射后)1个月(1M)、2个月(2M)及6个月(6M)的时间点时右眼(R，用Lin^-HSC处理)与左眼(L，用Lin⁺HSC处理的对照眼)；所给出图中的每条线都比较个体小鼠的左右眼。

图15描绘了rd1/rd1小鼠(C3H/HeJ，左图)或野生型小鼠(C57BL/6，右图)中视网膜血管和神经细胞的变化。显示了整装视网膜(红色：胶原蛋白IV，绿色：CD31)及同一视网膜切片(红色：DAPI，绿色：CD31，下图)中的中间血管丛(上图)或深层(中图)血管丛的视网膜血管系统。(P：出生后天数)。(GCL：节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层)。

图16表明，Lin^-HSC注射拯救rd1/rd1小鼠中的神经细胞变性。(A、B与C)，注射过Lin^-HSC的眼(右图)与对侧的注射过对照细胞(CD31^-)的眼(左图)在P30(A)、P60(B)和P180(C)时的中间丛(int.)或深丛的视网膜血管系统和切片，(D)，在P30(左图，n＝10)、P60(中图，n＝10)及P180(右图，n＝6)时注射过Lin^-HSC或对照细胞(CD31^-)的视网膜的血管系统平均总长度(平均值+或-标准偏差)。分别显示了中间血管丛(Int.)与深血管丛的数据(Y轴：血管系统的相对长度)。(E)，在P30(左图，n＝10)、P60(中图，n＝10)或P180(右图，n＝6)时注射过对照细胞(CD31^-)或Lin^-HSC的视网膜的ONL中的细胞核平均数(Y轴：ONL中细胞核的相对数目)。(F)，在P30(左图)、P60(中图)及P180(右图)时注射过Lin^-HSC或对照细胞(CD31^-)的视网膜的血管系统长度(X轴)与ONL中细胞核数(Y轴)之间的线性相关性。

图17表明通过注射Lin^-HSC拯救视网膜功能。使用视网膜电图(ERG)记录测量注射过Lin^-HSC或对照细胞(CD31^-)的视网膜的功能。(A与B)，注射后2个月被拯救与未被拯救的视网膜的典型例子。显示了同一动物的注射过Lin^-HSC的右眼(A)与注射过CD31^-对照细胞的左眼(B)的视网膜切片(绿色：CD31染色的血管系统，红色：DAPI染色的核)。(C)，(A与B)中所示的同一动物的ERG结果。

图18表明，人骨髓细胞群能在rd1小鼠中拯救变性视网膜(A-C)。在另一视网膜变性模型rd10中也观察到这种拯救(D-K)。A，用绿色染料标记的人Lin^-HSC(hLin^-HSC)可在玻璃体内注射入C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠后分化为视网膜血管细胞。(B与C)，注射后1.5个月时，在注射过Lin^-HSC的眼(B)或对侧的对照眼(C)中的视网膜血管系统(左图；上：中间丛，下：深丛)与神经细胞(右图)。(D-K)，用Lin^-HSC拯救rd10小鼠(在P6时注射)。显示了在P21(D：Lin^-HSC，H：对照细胞)、P30(E：Lin^-HSC，I：对照细胞)、P60(F：Lin^-HSC，J：对照细胞)及P105(G：Lin^-HSC，K：对照细胞)时的代表性视网膜(每一时间点的处理眼和对照眼来自同一动物)。视网膜血管系统(每幅图的上图为中间丛；每幅图的中图为深丛)用CD31(绿色)与胶原蛋白IV(红色)染色。每幅图的下图显示了由同一视网膜制备的横切面(红色：DAPI，绿色：CD31)。

图19表明，在用Lin^-HSC处理后，晶体蛋白αA在拯救的外核层细胞中被上调，而在用对照细胞处理的对侧眼中无此现象。左图：被拯救的视网膜中的IgG对照，中图：被拯救的视网膜中的晶体蛋白αA，右图：在未被拯救的视网膜中的晶体蛋白αA。

图20包括在已用本发明的Lin^-HSC处理的鼠类视网膜中被上调基因的表。(A)其表达在用鼠Lin^-HSC处理的小鼠视网膜中增加3倍的基因。(B)在用鼠Lin^-HSC处理的小鼠视网膜中被上调的晶体蛋白基因。(C)其表达在用人Lin^-HSC处理的小鼠视网膜中增加2倍的基因。(D)其表达在用人Lin^-HSC处理的小鼠视网膜中被上调的神经营养因子或者生长因子的基因。

图21图示了CD31与整联蛋白α6表面抗原在本发明的CD133阳性(DC133⁺)和CD133阴性(CD133^-)人Lin^-HSC群上的分布。左图显示了流式细胞术点阵图。中央图和右图是直方图，显示了细胞群上特异性抗体的表达水平。Y轴代表事件数，X轴显示信号强度。移至空心(对照)直方图右侧的实心直方图代表增加的荧光信号和背景水平以上的抗体表达。

图22图解了出生后的P0日至P30日于正常氧水平(含氧量正常)饲养的野生型C57/B16小鼠的出生后视网膜发育。

图23图解了P7至P12期间以高氧水平(含氧量高；75％氧)饲养、随后由P12至P17于正常含氧量饲养的C57/B16小鼠中的氧诱导型视网膜病变模型。

图24显示了在氧诱导型视网膜病变模型中通过用本发明的Lin^-HSC群处理进行的血管拯救。

图25表明，玻璃体内注射Lin^-HSC后rd1小鼠外核层(ONL)中的被拯救光感受器主要为视锥细胞。在野生型小鼠视网膜中小比例的光感受器(上图)是视锥细胞，证据是表达红/绿视锥视蛋白(A)，同时ONL的大部分细胞对视杆特异性视紫红质(B)呈阳性。视网膜血管系统用预免疫血清自身发荧光(C)，但核层对用视杆或视锥特异性视蛋白染色完全阴性。Rd/rd小鼠视网膜(下图)具有减少的内核层和接近完全萎缩的ONL，这二者对视锥(D)或视杆(图G)视蛋白均为阴性。对照CD31^-HSC处理的眼与未注射的rd/rd视网膜相同，对视锥(E)或视杆(H)视蛋白无任何染色。Lin^-HSC处理的对侧眼表现出明显降低但明确存在的ONL，其主要由视锥细胞组成，证据是对视锥红/绿视蛋白的阳性免疫反应性(F)。还观察到少量视杆(I)。

优选实施方案的详述

干细胞通常可由抗原在细胞表面上的分布来识别(详细的讨论参见Stem Cells：Scientific Progress and Future Directions，国立卫生研究院科学政策办公室于2001年六月制定的报告，附录E：干细胞标记，该报告按照相关程度引入本文作为参考)。

本发明提供一种改善患有眼疾的哺乳动物视网膜中的视锥细胞变性的方法。优选通过玻璃体内注射将含造血干细胞和内皮祖细胞的哺乳动物骨髓源的、分离的、谱系阴性的造血干细胞群给予哺乳动物视网膜。所述细胞以足以改善视网膜中的视锥细胞变性的量给予。

一种优选方法包括由待治疗的哺乳动物骨髓分离谱系阴性造血干细胞群，然后将所述细胞以足以改善视网膜中的视锥细胞变性的量给予哺乳动物。

所述细胞可得自患病哺乳动物，优选在眼疾早期获得。或者，所述细胞可在已知对眼疾(例如视网膜色素变性)具有遗传倾向性的患者中于发病前获得。所述细胞可储存至需要时，然后可在首次观察到病发征兆时预防性地注射。优选患病的视网膜包含干细胞靶向其的活化星形胶质细胞。因此，当存在相关的神经胶质增生时对眼进行早期治疗是有益的。或者，可用激光治疗视网膜，以刺激视网膜中活化星形胶质细胞的局部增殖，然后给予自体干细胞。

造血干细胞是能够发育成多种血细胞类型(例如B细胞、T细胞、粒细胞、血小板及红细胞)的干细胞。谱系表面抗原是一组为成熟血细胞谱系标记物的细胞表面蛋白，包括CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac-1(CD11b:CD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER-119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)。不表达显著水平的这些抗原的造血干细胞一般称为谱系阴性(Lin^-)。人造血干细胞一般表达诸如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133的其它表面抗原。鼠造血干细胞一般表达诸如CD34、CD117(c-kit)、Thy-1和/或Sca-1的其它表面抗原。

本发明提供在其细胞表面上不表达显著水平的“谱系表面抗原”(Lin)的分离的造血干细胞。这种细胞在本文中称为“谱系阴性”或“Lin^-”造血干细胞。具体地说，本发明提供含内皮祖细胞(EPC)的Lin^-造血干细胞群(Lin^-HSC)，它能够渗入到发育中的血管中，然后分化形成血管内皮细胞。优选地，分离的Lin^-HSC群存在于培养基如磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。

本文以及后附权利要求中使用的表述“成体的”用于指骨髓，包括出生后分离的骨髓，即与胚胎相反地从幼年及成体个体中分离的骨髓。术语“成体哺乳动物”指幼年和完全成年的哺乳动物这二者。

本发明的分离的、哺乳动物的、谱系阴性的造血干细胞(Lin^-HSC)群包含内皮祖细胞(EPC)。优选地，分离的Lin^-HSC群包含其中至少约20％的细胞表达表面抗原CD31的哺乳动物细胞，表面抗原CD31通常存在于内皮细胞上。在另一个实施方案中，至少约50％、更优选至少约65％、最优选至少约75％的细胞表达CD31。优选地，至少约50％的本发明Lin^-HSC群的细胞优选表达整联蛋白α6抗原。

在一个优选的鼠Lin^-HSC群实施方案中，至少约50％的细胞表达CD31抗原，至少约50％的细胞表达CD117(c-kit)抗原。优选地，至少约75％、更优选约81％的Lin^-HSC细胞表达表面抗原CD31。在另一个优选的鼠实施方案中，至少约65％、更优选约70％的细胞表达表面抗原CD117。本发明的一个特别优选的实施方案是以下鼠Lin^-HSC群，其中约50％至约85％的细胞表达表面抗原CD31，约70％至约75％的细胞表达表面抗原CD117。

另一个优选实施方案是其中细胞为CD133阴性的人Lin^-HSC群，其中至少约50％的细胞表达CD31表面抗原，至少约50％的细胞表达整联蛋白α6抗原。再另一个优选实施方案是其中细胞为CD133阳性的人Lin^-HSC群，其中少于约30％的细胞表达CD31表面抗原，少于约30％的细胞表达整联蛋白α6抗原。

本发明的分离的Lin^-HSC群在玻璃体内注入哺乳动物物种眼中时，选择性靶向星型胶质细胞并掺入新生血管系统中，所述哺乳动物物种例如为小鼠或人，所述细胞由所述哺乳动物物种中分离。

本发明的分离的Lin^-HSC群含有内皮祖细胞，其分化为内皮细胞并在视网膜内产生血管结构。具体地说，本发明的Lin^-HSC群用于治疗视网膜新生血管与视网膜血管变性疾病，并用于修复视网膜血管损伤。本发明的Lin^-HSC细胞还促进视网膜中的神经元拯救，并促使抗凋亡基因上调。已令人惊奇地发现，本发明的成体Lin^-HSC细胞甚至能在患有视网膜变性的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠中抑制视网膜变性。正常小鼠视网膜主要为视杆，但用Lin^-HSC治疗后的被拯救细胞几乎全部是视锥。此外，Lin^-HSC群可用于治疗初生哺乳动物眼中的视网膜缺陷，所述初生哺乳动物例如为患有氧诱导型视网膜病变或早产儿视网膜病变的哺乳动物。

本发明还提供一种治疗哺乳动物眼疾的方法，其包括由哺乳动物骨髓中分离含内皮祖细胞的谱系阴性造血干细胞群，并将分离的干细胞以足以抑制疾病的量玻璃体内注射入哺乳动物眼中。本发明方法可用于在初生的、幼年的或者完全成年的哺乳动物中治疗眼疾，例如视网膜变性疾病、视网膜血管变性疾病、局部缺血性视网膜病变、血管出血、血管渗漏和脉络膜病变。这些疾病的实例包括年龄相关性黄斑变性(ARMD)、糖尿病性视网膜病变(DR)、拟眼组织胞浆菌病(POHS)、早产儿视网膜病变(ROP)、镰状细胞贫血与色素性视网膜炎以及视网膜损伤。

注射到眼中的干细胞数足以抑制眼睛的疾病状态。例如，细胞数可有效修复眼视网膜损伤、稳定视网膜新生血管系统、成熟视网膜新生血管系统并防止或修复血管渗漏与血管出血。

可用治疗上有用的基因，例如编码抗血管发生蛋白(用于眼部的基于细胞的基因疗法)的基因和编码神经营养物质(用于增强神经元拯救作用)的基因，转染本发明的Lin^-HSC群细胞。

转染的细胞可包含任何在治疗上对视网膜障碍治疗有用的基因。在一个优选实施方案中，本发明的转染的Lin^-HSC包含有效编码抗血管发生肽的基因，该抗血管发生肽包括蛋白或其片段，例如TrpRS或其抗血管发生的片段，例如在共同所有的、共同待审的美国专利申请序号10/080,839中所详述的TrpRS的T1与T2片段，该专利申请的公开内容通过引用结合到本文中。本发明的编码抗血管发生肽的转染Lin^-HSC用于治疗与异常血管发育相关的视网膜病，例如糖尿病性视网膜病变及类似疾病。Lin^-HSC优选为人细胞。

在另一个优选实施方案中，本发明的转染Lin^-HSC含有效编码神经营养物质的基因，所述神经营养物质例如为神经生长因子、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、神经营养蛋白-5、睫状神经营养因子、视网膜色素上皮衍生的神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子、脑衍生的神经营养因子等。这类神经营养性Lin^-HSC可用于在视网膜神经变性疾病(例如青光眼与色素性视网膜炎)中促进神经元拯救、治疗视网膜神经损伤等。业已报道了睫状神经营养因子植入体用于治疗色素性视网膜炎(参见Kirby等，2001，Mol Ther.3(2)：241-8；Farrar等，2002，EMBO Journal 21：857-864)。据报道，脑衍生的神经营养因子在受损的视网膜神经节中调节生长相关基因(参见Fournier等，1997，J.Neurosci.Res.47：561-572)。据报道，神经胶质细胞系衍生的神经营养因子在色素性视网膜炎中延缓光感受器变性(参见McGee等，2001，Mol Ther.4(6)：622-9)。

本发明还提供一种从哺乳动物骨髓中分离含内皮祖细胞的谱系阴性造血干细胞的方法。该方法需要以下步骤：(a)从成体哺乳动物抽取骨髓；(b)从骨髓中分离多种单核细胞；(c)使用针对一种或多种谱系表面抗原的生物素缀合的谱系群体抗体来标记单核细胞，优选谱系表面抗原选自：CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠)、TER-119(鼠)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白细胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)；(d)从多种单核细胞中除去对所述一种或多种谱系表面抗原为阳性的单核细胞，并回收含有内皮祖细胞的谱系阴性造血干细胞群，优选其中至少约20％的细胞表达CD31。

当从成人骨髓中分离Lin^-HSC时，优选地，用针对谱系表面抗原CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a的生物素缀合的谱系群体抗体标记单核细胞。当从成体小鼠骨髓中分离Lin^-HSC时，优选地，用针对谱系表面抗原CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素缀合的谱系群体抗体标记单核细胞。

在一种优选方法中，所述细胞分离自成人骨髓，并通过CD133谱系进一步分离。分离人Lin^-HSC的一种优选方法包括以下额外步骤：用生物素缀合的CD133抗体标记单核细胞，并回收CD133阳性的Lin^-HSC群。通常，不到约30％的此类细胞表达CD31，不到约30％的此类细胞表达整联蛋白α6。本发明的CD133阳性的人Lin^-HSC群在注射入未经历血管发生的眼中时可靶向外周局部缺血诱生的血管新生部位。

分离人Lin^-HSC的另一种优选方法包括以下额外步骤：用生物素缀合的CD133抗体标记单核细胞、除去CD133阳性细胞并回收CD133阴性的Lin^-HSC群。通常，至少约50％的此类细胞表达CD31，至少约50％的此类细胞表达整联蛋白α6。本发明的CD133阴性的人Lin^-HSC群在注射入未经历血管发生的眼中时可渗入发育中的血管系统中。

本发明还提供治疗眼部血管发生疾病的方法，该方法通过将所述细胞玻璃体内注射入眼中给予本发明的转染的Lin^-HSC细胞。这种转染的Lin^-HSC细胞包括用治疗上有用的基因(例如编码抗血管发生或神经营养性基因产物的基因)转染的Lin^-HSC。优选地，转染的Lin^-HSC细胞是人细胞。

优选地，至少约1×10⁵个Lin^-HSC细胞或转染的Lin^-HSC细胞通过玻璃体内注射给予患有视网膜变性疾病的哺乳动物眼。要注射的细胞数可取决于视网膜变性的严重性、哺乳动物年龄以及视网膜疾病治疗领域的普通技术人员容易知晓的其它因素。Lin^-HSC可在一段时间内以单剂量或多剂量给予，这由负责治疗的临床医生决定。

本发明的Lin^-HSC用于治疗涉及视网膜血管系统中断或变性或视网膜神经变性的视网膜损伤和视网膜缺陷。人Lin^-HSC还可用于产生遗传上相同的细胞系，即无性繁殖系，用于再生性或修复性治疗视网膜血管系统，以及用于治疗或改善视网膜神经元变性。

实施例

实施例1.细胞分离与富集；鼠Lin^-HSC群A和B的制备

一般方法。所有体内评价均依照NIH实验动物看护与使用指南执行，并且所有评价程序均得到Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)动物看护与使用委员会的批准。从B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或Balb/cBYJ成体小鼠(The JacksonLaboratory，ME)中提取骨髓细胞。

然后，通过使用HISTOPAQUE聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度分离来分离单核细胞，并用在小鼠中用于Lin^-选择的生物素缀合的谱系群体抗体(CD45、CD3、Ly-6G、CD11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)标记。使用磁分离设备(AUTOMACS^TM分选仪，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)从Lin^-HSC中分离谱系阳性(Lin⁺)细胞并除去。所获得的含内皮祖细胞的Lin^-HSC群使用以下抗体用FACS^TM Calidur流式细胞仪(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)进一步表征：PE-缀合的Sca-1、c-kit、KDR和CD31(Pharmingen，SanDiego，CA)。Tie-2-GFP骨髓细胞用于表征Tie-2。

为收获成体小鼠内皮细胞，通过外科手术从ACTbEGFP小鼠中取出肠系膜组织，并置于胶原酶(Worthington，Lakewood，NJ)中以消化组织，然后使用45μm滤器过滤。收集流通滤液并用内皮生长培养基(Clonetics，San Diego，CA)温育。通过观察形态上的鹅卵石状外观、用CD31 mAb(Pharmingen)染色以及检查培养物在MATRIGEL^TM基质(Beckton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中形成管样结构来确认内皮性状。

鼠Lin^-HSC群A。通过上述一般方法从ACTbEGFP小鼠中提取骨髓细胞。通过FACS流式细胞仪表征Lin^-HSC细胞的CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1与Tie-2细胞表面抗原标记。结果如图1(c)所示。约81％的Lin^-HSC显示出CD31标记，约70.5％的Lin^-HSC显示出c-kit标记，约4％的Lin^-HSC显示出Sca-1标记，约2.2％的Lin^-HSC显示出Flk-1标记，约0.91％的Lin^-HSC显示出Tie-2标记。相反，从这些骨髓细胞中分离的Lin⁺HSC具有显著不同的细胞标记谱(即，CD31：37.4％；c-kit：20％；Sca-1：2.8％；Flk-：0.05％)。

鼠Lin^-HSC群B。通过上述一般方法从Balb/C、ACTbEGFP及C3H小鼠中提取骨髓细胞。分析Lin^-HSC细胞中细胞表面标记(Sca-1、KDR、c-kit、CD34、CD31和多种整联蛋白：α1、α2、α3、α4、α5、α6、α_M、α_V、α_X、α_IIb、β₁、β₄、β₃、β₄、β₅和β₇)的存在情况。结果如表1所示。

     表1.Lin^-HSC群B的特征

    细胞标记    Lin^-HSC    α1    α2    α3    α4    α5    α6    αL    αM    αX    αV    αIIb    β1    β2    β3    β4    β5    β7    CD31    CD34    Flk-1/KDR    c-kit(CD117)    Sca-1    0.10    17.57    0.22    89.39    82.47    77.70    62.69    35.84    3.98    33.64    0.25    86.26    49.07    45.70    0.68    9.44    11.25    51.76    55.83    2.95    74.42    7.54

实施例2.在鼠模型中玻璃体内给予细胞

用锋利的刀片在小鼠眼睑中做一条眼睑裂缝，暴露P2至P6眼球。使用一个33号(Hamilton，Reno，NV)针头的注射器，玻璃体内注射本发明的谱系阴性HSC群A(在约0.5μl至约1μl细胞培养基中有约10⁵个细胞)。

实施例3.EPC转染

根据厂商的实验手册利用FuGENE^TM6转染试剂(Roche，Indianapolis，IN)用编码TrpRS的T2片段、又封入His₆标记的DNA(SEQ ID NO：1，图7)转染鼠Lin^-HSC(群A)。将Lin^-HSC细胞(每ml约10⁶细胞)悬浮在含有干细胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的opti-MEM培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。然后加入DNA(约1μg)和FuGENE试剂(约3μl)，将混合物在约37℃温育约18小时。温育后，清洗并收集细胞。经FACS分析证实该系统的转染率约为17％。通过蛋白质印迹证实T2产生。His₆标记的T2-TrpRS的氨基酸序列如图8的SEQ ID NO：2所示。

实施例4.免疫组织化学和共聚焦分析

在不同时间点收集小鼠视网膜，为整装片或者冰冻切片制片做准备。对于整装片，使用4％多聚甲醛固定视网膜，在50％胎牛血清(FBS)及20％正常山羊血清中于室温封闭一小时。视网膜经一抗处理并用二抗检测。使用的一抗为：抗胶原蛋白IV(Chemicon，Temecula，CA)、抗β-gal(Promega，Madison，WI)、抗GFAP(Dako Cytomation，Carpenteria，CA)、抗-α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA，Dako Cytomation)。使用的二抗缀合Alexa 488或594荧光标记(Molecular Probes，Eugene，OR)。利用MRC 1024共聚焦显微镜(Bio-Rad，Hercules，CA)获取图像。利用LASERSHARP软件(Bio-Rad)创建三维图像，以检查整装视网膜中三个不同血管层的发育。利用由共聚焦显微镜辨别出的GFP(eGFP)增强小鼠与GFAP/wtGFP小鼠间的GFP像素强度差异创建3D图像。

实施例5.小鼠中体内视网膜血管发生定量测定

对于T2-TrpRS分析，从小鼠视网膜三维图像重建初级丛与深丛。初级丛分为两类：正常发育或中断的血管发育。深部血管发育抑制的分类基于血管抑制的百分比进行分析，包括以下标准：深丛形成的完全抑制标记为“完全”，正常血管发育(含少于25％的抑制)标记为“正常”，其余的标记为“部分”。对于rd/rd小鼠的拯救数据，使用10x透镜获取每个整装视网膜中深丛的四个单独区域。计算每幅图像的血管系统总长、总结并进行组间比较。为了获得精确的信息，将Lin^-HSC注射入小鼠的一只眼中，而将Lin⁺HSC注射到同一小鼠的另一只眼中。未注射的对照视网膜取自同一窝动物。

实施例6.成体视网膜损伤小鼠模型

使用二极管激光器(150mW，1秒，50mm)或用一个27号针头机械刺破小鼠视网膜，建立激光和瘢痕模型。在伤后5天，利用玻璃体内方法注射细胞。5天后采集小鼠眼睛。

实施例7.视网膜变性的神经营养性拯救

成体鼠骨髓源谱系阴性造血干细胞(Lin^-HSC)在视网膜变性小鼠模型中具有血管营养性和神经营养性拯救作用。在10天龄小鼠的右眼玻璃体内注射约0.5毫升含约10⁵个本发明Lin^-HSC，2个月后评价视网膜血管系统的存在情况与神经元层核的数目。同一小鼠的左眼注射约相同数目的Lin⁺HSC作为对照，并进行类似评价。如图9所示，在Lin^-HSC治疗的眼中，视网膜血管表现得接近正常，内核层近似正常，外核层(ONL)有约3至4个核层。相反，对侧Lin⁺HSC处理的眼有一个明显萎缩的中间视网膜血管层，一个完全萎缩的外视网膜血管层；内核层明显萎缩，外核层完全消失。这在小鼠3与小鼠5中表现得尤为明显。在小鼠1中未见拯救作用，这种情况存在于约15％的被注射小鼠中。

当使用视网膜电流图(ERG)评定视觉功能时，在观测到血管与神经拯救(小鼠3与5)的同时观察到阳性ERG恢复。没有血管与神经元拯救时(小鼠1)观察不到阳性ERG。图10所示的回归分析曲线说明了本发明的Lin^-HSC产生的rd/rd小鼠眼中血管和神经营养拯救之间的相关性。对于中间血管系统类型(r＝0.45)和深血管系统(r＝0.67)，观测到神经元(y-轴)与血管(x-轴)修复之间的相关性。

图11显示在Lin⁺HSC产生的血管与神经元拯救之间没有任何统计学上的显著相关性。对血管拯救定量，数据列于图12。图12显示的注射后1个月(1M)、2个月(2M)及6个月(6M)时的小鼠数据表明，与同一小鼠的未处理眼中的血管长度(白柱)相比，用本发明的Lin^-HSC处理的眼中的血管长度(黑柱)有显著增加，特别是在注射后1个月与2个月时。在注射Lin^-HSC或Lin⁺HSC后约两个月，通过计数内核层和外核层中的核定量神经营养性拯救作用。结果列于图13与14。

实施例8.人Lin^-HSC群

通过上述一般方法从健康成人志愿者中抽取骨髓细胞。然后通过使用HISTOPAQUE聚蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度分离来分离单核细胞。为了从人骨髓单核细胞中分离Lin^-HSC群，将下述生物素缀合的谱系群体抗体用于磁分离系统(AUTOMACS^TM分选仪，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)：CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。

基于CD133表达将人Lin^-HSC群再分为两个亚群。细胞用生物素缀合的CD133抗体标记，并分成CD133阳性和CD133阴性亚群。

实施例9.在视网膜变性鼠模型中玻璃体内给予人和鼠细胞

C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID与rd10小鼠品系用作视网膜变性模型。C3H/HeJ与C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠(TheJackson Laboratory，Maine)是视网膜变性1(rd1)突变的纯合子，所述突变是引起早期发作的严重视网膜变性的突变。该突变位于编码视杆光感受器cGMP磷酸二酯酶β亚基的Pde6b基因的外显子7中。该基因中的此突变已在有常染色体隐性色素性视网膜炎(RP)的人患者中发现。C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠还是严重联合免疫缺陷自发突变(Prkdc SCID)纯合子，用于人细胞转移实验。rd10小鼠中的视网膜变性由Pde6b基因的外显子13中的突变引起。这也是一种发作比rd1/rd1更后、视网膜变性比rd1/rd1更轻微的临床相关性RP模型。所有评价均依照NIH实验动物看护与使用指南实施，所有方法都获得Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)动物看护与使用委员会的批准。

用锋利的刀片在小鼠眼睑中做一条眼睑裂缝，暴露P2至P6眼球。使用一个33号(Hamilton，Reno，NV)针头的注射器，将鼠群A或人群C的谱系阴性HSC细胞(约0.5μl至约1μl细胞培养基的约10⁵个细胞)玻璃体内注射入小鼠眼中。为使注射的人细胞可见，在注射前用染料(Cell tracker green CMFDA，Molecular Probes)标记细胞。

在不同时间点收集视网膜，并用4％多聚甲醛(PFA)和甲醇固定，接着在50％FBS/20％NGS中于室温封闭一小时。为染色视网膜血管系统，将视网膜与抗CD31抗体(Pharmingen)及抗胶原蛋白IV抗体(Chemicon)温育，接着与Alexa 488或594缀合的二抗(Molecular Probes，Eugene，Oregon)温育。以四个放射性松弛切口平铺视网膜，以获得整装片制品。视网膜血管中间丛或深丛(参见Dorrell等，2002 InvestOphthalmol.Vis.Sci.43：3500-3510)中的血管系统图像利用RadianceMP2100共焦显微镜及LASERSHARP软件(Biorad，Hercules，California)获得。为定量血管系统，从中间血管层或深血管层的中间部分随机选择四个独立区域(900μm×900μm)，使用LASERPIX分析软件(Biorad)测量血管总长。同一丛中的这四个区域的总长用于进一步分析。

为制作冰冻切片，重新包埋视网膜平片。视网膜置于4％PFA中过夜，然后与20％蔗糖温育。视网膜包埋在最佳切割温度复合物(OCT：Tissue-Tek；Sakura FineTech，Torrance，CA)中。冰冻切片(10μm)在含核染料DAPI(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)的PBS中再水合。通过共焦显微镜获取含视神经头及完整周边视网膜的单个切片中的三个不同视野(280μm宽，无偏采样)的DAPI标记核图像。对位于一个切片中三个独立视野的ONL中的核数目进行计数并求和，以进行分析。执行简单的线性回归分析，以检测深丛中的血管系统长度与ONL中的细胞核数之间的关系。

在整夜暗适应后，通过腹膜内注射15μg/gm氯胺酮与7μg/gm甲苯噻嗪麻醉小鼠。使用金环角膜电极连同口参考电极和尾接地电极，在瞳孔扩大后(1％硫酸阿托品)从每只眼的角膜表面记录视网膜电图(ERG)。用固定在高反射性Ganzfeld圆顶外侧的Grass光刺激器(PS33 Plus，Grass Instruments，Quincy，MA)产生刺激。在直至光刺激器最大允许值(0.668 cd-s/m²)的亮度范围内，对短波长(Wratten 47A；λ_max＝470nm)闪光记录视杆反应。对反应信号进行放大(CP511 AC放大器，Grass Instruments)、数字化(PCI-1200，National Instruments，Austin，TX)和计算机分析。每只小鼠以由治疗的眼和未治疗的眼记录的ERG作为其自身的内标。将多达100次的扫描平均，用作最弱信号。由治疗眼的反应数字减去未治疗眼的平均反应，此信号差值用于指示功能性拯救。

使用微阵列分析评价Lin^-HSC靶向的视网膜基因表达。用Lin^-HSC或CD31^-HSC注射P6 rd/rd小鼠。注射后40天将这些小鼠的视网膜剥离到没有RNA酶的培养基中(在注射后的此时间点明显可见视网膜血管及光感受器层的拯救)。通过整装片分析每个视网膜的1/4，以确保正常的HSC靶向以及已获得血管系统与神经保护作用。使用TRIzol(Life Technologies，Rockville，MD)、苯酚/氛仿RNA分离方案由成功注射的视网膜纯化RNA。RNA杂交至Affymetrix Mu74Av2芯片，使用GENESPRING软件(SiliconGenetics，Redwood City，CA)分析基因表达。纯化的人或小鼠HSC玻璃体内注射入P6小鼠中。在P45时剥离视网膜并合并成以下部分：1)注射了人HSC的被拯救的小鼠视网膜，2)注射了人HSC的未被拯救的小鼠视网膜，及3)注射了小鼠HSC的被拯救的小鼠视网膜，用于纯化RNA，并杂交至人特异性U133A Affymetrix芯片上。使用GENESPRING软件鉴别在背景值以上表达并在人HSC拯救的视网膜中具有较高表达的基因。然后单独分析这些基因中每一个的探针对表达谱，并与使用dChip的正常人U133A微芯片实验模型对比，以确认人类物种的特异性杂交，并消除由于种间杂交产生的假阳性。

图21表显示了流式细胞仪数据，该数据比较了CD31及整联蛋白α6表面抗原在本发明CD133阳性(DC133⁺)与CD133阴性(CD133^-)的人Lin^-HSC群上的表达。左图显示了流式细胞术点阵图。中央图和右图是直方图，显示了细胞群上特异性抗体的表达水平。Y轴代表事件数，X轴显示信号强度。空心直方图是表明非特异性背景染色水平的同种型IgG对照抗体。实心直方图显示了所述细胞群上特异性抗体的表达水平。移至空心(对照)直方图右侧的实心直方图代表增加的荧光信号和背景水平以上的抗体表达。两个细胞群之间实心直方图峰位置的对比代表了细胞上的蛋白表达差异。例如，CD31在本发明的CD133+和CD133^-细胞上均在背景以上表达；但是，和CD133^-群相比，在CD133+细胞群中表达较低水平的CD31的细胞更多。由此数据显见，CD31表达在两个群之间有变化，α6整联蛋白表达大部分限于Lin^-群中的细胞，因此可用作具有血管营养性和神经营养性拯救功能的细胞的标记物。

当CD133阳性与CD133阴性的Lin^-HSC亚群玻璃体内注射入初生SCID小鼠的眼中时，对于既表达CD31又表达整联蛋白α6表面抗原的CD133阴性亚群，观察到对发育中血管系统的最大程度渗入(参见图21，下图)。不表达CD31或整联蛋白α6的CD133阳性亚群(图21，上图)似乎靶向外周局部缺血诱生的血管新生部位，但在注射入正经历血管新生的眼中时无此现象。

用对视杆视蛋白或视锥视蛋白有特异性的抗体以免疫组化方法分析被拯救的和未被拯救的视网膜。对用于图17列出的ERG记录的相同眼睛进行视杆视蛋白或视锥视蛋白分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的光感受器不足5％为视锥(Soucy等，1998，Neuron21：481-493)，用红/绿视锥视蛋白或用视杆视紫红质所观测到的免疫组化染色图谱如图25(A)或图25(B)所示，符合视锥细胞的该百分率。对视杆视紫红质特异性的抗体(rho4D2)由大不列颠哥伦比亚大学的Robert Molday博士提供，如先前所述使用(Hicks等，1986，Exp.Eye Res.42：55-71)。对视锥红/绿视蛋白特异性的兔抗体购自Chemicon(AB5405)，按照生产商的说明使用。 

实施例10.在氧诱导型视网膜变性的鼠模型中玻璃体内给予鼠细胞

在氧诱导型视网膜变性(OIR)模型中的出生后P7至P12日之间，使新生野生型C57B16小鼠暴露于高氧环境(75％氧)。图22显示了由P0至P30期间C57B16小鼠中的正常初生后血管发育。在P0时只能在视神经盘周围观察到刚开始发育的表层血管。在接下来的几天内，初级表层网络扩展至外周，在P10日时到达外周边缘。在P7与P12之间，次级(深)丛发育。至P17时，出现广泛的表层与深层血管网络(图22，插图)。在随后的时间里，同血管的第三(中间)层的发育一起发生重塑，直至大约在P21时形成成熟结构。

相反，在OIR模型中，在于P7-P12暴露于75％氧之后，事件的正常次序被严重扰乱(图23)。本发明的成体鼠Lin^-HSC群于P3时玻璃体内注射入小鼠的一只眼中，该小鼠随后进行OIR，另一只眼注射PBS或者CD31阴性细胞作为对照。图24表明，本发明的Lin^-HSC群可在发育中的小鼠视网膜中逆转高氧水平的变性作用。在P17时于处理的眼中观察到完全发育的表层及深层视网膜血管系统，而在对照眼中显示出大量无血管区域，实际上是没有深层血管(图24)。观察了OIR模型中的约100只小鼠眼睛。在58％的本发明Lin^-HSC处理眼中观察到正常血管形成，相比之下，用CD31^-细胞处理的对照眼为12％，用PBS处理的对照眼为3％。

结果和讨论

鼠视网膜血管发育；眼血管发生模型。小鼠眼睛提供了一种公认的用于研究哺乳动物视网膜血管发育(例如人视网膜血管发育)的模型。在鼠视网膜血管系统发育期间，局部缺血诱生的视网膜血管以和星型胶质细胞紧密缔合的方式发育。这些神经胶质元件沿着神经节细胞层从视神经盘移至妊娠末三个月的人类胎儿或新生啮齿动物的视网膜上，并呈放射状展开。随着鼠视网膜血管发育，内皮细胞利用此已建立的星型胶质细胞模板确定视网膜血管样式(参见图1(a与b))。图1(a与b)图示了发育中的小鼠视网膜示意图。图(a)图示了叠加在星型胶质细胞模板(亮线)上的初级丛(图左上方的暗线)的发育，而(b)描述了视网膜血管形成的第二阶段。在图1中，GCL代表神经节细胞层；IPL代表内丛层；INL代表内核层；OPL代表外丛层；ONL代表外核层；RPE代表视网膜色素上皮；ON代表视神经；而P代表外周。

在出生时，视网膜血管系统实际上是不存在的。至出生后14天(P14)，视网膜已发育成复杂的初级(表)与次级(深)层视网膜血管，同视觉形成相符。开始时，辐射状视乳头周围血管在已存在的星型胶质细胞网络上向外周呈放射状生长，通过毛细血管丛形成变为进行性地互连。这些血管至P10(图1(a))时在神经纤维内作为单细胞层生长。在P7-P8之间，侧副枝从此初级丛开始生长，穿透视网膜至外部丛状层，在那里它们形成次级或深层视网膜丛。至P21时，整个网状结构经历了广泛重建，在内核层内表面形成第三级丛或中间丛(图1(b))。

由于若干理由，新生小鼠视网膜血管发生模型可用于研究眼血管发生期间的HSC作用。在此生理学相关模型中，在内源性血管出现之前存在大量的星型胶质细胞模板，这使得可在血管新生过程中评价细胞-细胞靶向作用。此外，已知此连贯且可重现的新生视网膜血管化过程是低氧驱动的，就此而言与许多其中已知局部缺血起作用的视网膜疾病具有相似性。

由骨髓富集内皮祖细胞(EPC)。虽然已在存在于HSC制备物中的EPC群上广泛评价了细胞表面标记表达，但专一识别EPC的标记仍很难确定。为了富集EPC，将造血谱系标记阳性细胞(Lin⁺)，即B淋巴细胞(CD45)、T淋巴细胞(CD3)、粒细胞(Ly-6G)、单核细胞(CD11)和红细胞(TER-119)从小鼠骨髓单核细胞中去除。用Sca-1抗原进一步富集EPC。对比玻璃体内注射等量的Lin^-Sca-1⁺细胞或者Lin^-细胞后获得的结果，两组之间未检测到差异。实际上，当仅注射Lin^-Sca-1^-细胞时，观察到远大得多的对发育中血管的渗入。

基于功能测定富集具有EPC的本发明Lin^-HSC群。此外，Lin⁺HSC群与Lin^-HSC群在功能上表现得相当不同。还评价了常用于鉴别各部分的EPC的表位(基于先前报道的体外特征研究)。尽管这些标记中没有一个与Lin^-部分专一关联，但同Lin⁺HSC部分相比，Lin^-HSC中的所有标记都增加约70％至约1800％(图1(c))。图1的图c说明了骨髓源Lin⁺HSC与Lin^-HSC分离细胞的流式细胞术特征。图1(c)的顶行显示了非抗体标记细胞的造血干细胞点阵图分布。R1确定了阳性PE-染色的定量门控区；R2指示GFP-阳性。中间行显示了Lin^-HSC的点阵图，底行显示了Lin⁺HSC的点阵图。C57B/6细胞用针对Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-缀合抗体标记。Tie-2数据得自Tie-2-GFP小鼠。点阵图角中的百分比表示总Lin^-HSC或Lin⁺HSC群中阳性标记细胞的百分数。有趣的是，公认的EPC标记如Flk-1/KDR、Tie-2及Sca-1的表达都很差，因此没有用于进一步的分级分离。

玻璃体内注射的HSC Lin^-细胞含有靶向星型胶质细胞并渗入发育中的视网膜血管的EPC。为了测定玻璃体内注射的Lin^-HSC是否能够靶向视网膜的特定细胞类型、利用星型胶质细胞模板并参与视网膜血管发生，将来自本发明的Lin^-HSC组合物的约10⁵个细胞或分离自成体(GFP或LacZ转基因)小鼠骨髓的Lin⁺HSC细胞(对照，约10⁵个细胞)注射入出生后2天(P2)的小鼠眼中。注射后四天(P6)，得自GFP或者LacZ转基因小鼠的本发明Lin^-HSC组合物的许多细胞附着在视网膜上，并具有内皮细胞的特征性伸长外观(图2(a))。图2说明了Lin^-细胞移入发育中的小鼠视网膜中。如图2(a)所示，注射后四天(P6)玻璃体内注射的eGFP+Lin^-HSC在视网膜上附着并分化。

在视网膜的很多区域中，GFP表达细胞以符合下面的星型胶质细胞的样式排列，并与血管类似。这些荧光细胞在内源性的、发育中的血管网络之前被观察到(图2(b))。相反，只有少数Lin⁺HSC(图2(c))或成体小鼠肠系膜内皮细胞(图2(d))附着在视网膜表面。为了确认来自注射的Lin^-HSC群的细胞是否也能够附着在已经建立血管的视网膜上，我们将Lin^-HSC组合物注射入成体眼中。有趣的是，没有观察到细胞附着在视网膜上或渗入既有的正常视网膜血管中(图2(e))。这表明本发明的Lin^-HSC组合物不破坏已正常发育完成的血管，不会在正常发育的视网膜中引发异常血管化。

为了确定本发明的注射的Lin^-HSC组合物与视网膜星型胶质细胞之间的关系，使用转基因小鼠，其表达胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP，星型胶质细胞的标记物)和启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)。对注射了来自eGFP转基因小鼠的Lin^-HSC的这些GFAP-GFP转基因小鼠的视网膜进行检查，表明所注射的eGFP EPC与现存的星型胶质细胞共定位(图2(f-h)，箭头处)。观察到eGFP+Lin^-HSC的进程与下面的星型胶质细胞网状结构一致(箭头处，图2(g))。对这些眼的检查表明，所注射的标记细胞仅附着于星型胶质细胞上；在视网膜外周仍没有内源血管的P6小鼠视网膜中，观察到所注射的细胞附着在这些尚未血管化区域中的星型胶质细胞上。令人惊讶的是，在视网膜深层中正常视网膜血管随后将发育的确切位置上，观察到所注射的标记细胞(图2(i)，箭头处)。

为了确定本发明的注射的Lin^-HSC是否稳定地渗入到发育中的视网膜血管系统中，在几个稍后的时间点检查视网膜血管。早在P9(注射后7天)时，Lin^-HSC已渗入到CD31⁺结构中(图2(j))。到P16(注射后14天)时，细胞已经广泛渗入视网膜的血管样结构中(图2(k))。在处死动物前血管内注射罗丹明-葡聚糖(以鉴别功能性视网膜血管)时，多数Lin^-HSC与伸展的血管排成一线(图2(l))。观察到两种模式的标记细胞分布：(1)在一个模式中，细胞沿着未标记的内皮细胞之间的血管散布；和(2)另一个模式显示血管完全由标记细胞组成。所注射的细胞也渗入到深血管丛的血管中(图2(m))。虽然以前曾报道过Lin^-HSC衍生的EPC零星渗入到新生血管系统中，但这是首次报道血管网络全部由这些细胞组成。这表明玻璃体内注射的本发明骨髓源Lin^-HSC群中的细胞能够有效渗入形成中的视网膜血管丛的任何层中。

当在玻璃体内注射后达5或10天检查时，非视网膜组织(例如脑、肝脏、心脏、肺、骨髓)的组织学检查表明不存在任何GFP阳性细胞。这表明Lin^-HSC部分中的细胞亚群选择性地靶向视网膜星型胶质细胞，并稳定渗入发育中的视网膜血管中。由于这些细胞具有内皮细胞的许多特征(同视网膜星型胶质细胞缔合、伸长形态、稳定渗入伸展的血管中并且不出现在血管外位置)，所以这些细胞表明EPC存在于Lin^-HSC群中。被靶向的星型胶质细胞与在许多低氧性视网膜病变中观察到的是同一类型。众所周知，神经胶质细胞是DR和其它类型的视网膜损伤中所观察到的新生血管叶的主要组分。在活性神经胶质增生及局部缺血引发的新生血管化的情况下，活性星型胶质细胞增生、产生细胞因子并上调GFAP，与在包括人的许多哺乳动物物种的新生视网膜血管模板形成过程中观察到的情况相仿。

本发明的Lin^-HSC群会象在新生眼中那样靶向成体小鼠眼中的活性星型胶质细胞，将Lin^-HSC细胞注射入视网膜被光凝固(图3(a))或针尖(图3(b))损伤的成体眼中。在两个模型中，只是在损伤部位周围观察到具有明显GFAP染色的细胞群(图3(a与b))。来自所注射的Lin^-HSC组合物的细胞位于受损伤部位，并特异性地与GFAP阳性星型胶质细胞保持缔合(图3(a和b))。在这些部位，还观察到Lin^-HSC细胞移至视网膜的更深层，其所处层面与在深层视网膜血管系统新生形成期间观察到的层面类似。视网膜的未损伤部位不含Lin^-HSC细胞，这与Lin^-HSC注射入正常未受损成体视网膜中时所观察到的相一致(图2(e))。这些数据表明，在具有神经胶质增生的受损成体视网膜以及经历血管化的新生视网膜中，Lin^-HSC组合物可选择性地靶向活性神经胶质细胞。

玻璃体内注射的Lin^-HSC可拯救并稳定变性血管系统。因为玻璃体内注射的Lin^-HSC组合物靶向星型胶质细胞并渗入正常的视网膜血管系统中，所以在与神经胶质增生和血管变性相关的局部缺血或变性视网膜疾病中这些细胞还稳定变性血管。rd/rd小鼠是视网膜变性模型，其至出生后一个月时表现出光感受器及视网膜血管层的深度变性。这些小鼠中的视网膜血管系统正常发育至P16，此时较深的血管丛退化；到P30时大多数小鼠的深丛和中间丛几乎完全变性。

为了确定HSC是否能够拯救退化的血管，P6时将Lin⁺HSC或Lin^-HSC(来自Balb/c小鼠)玻璃体内注射入rd/rd小鼠中。至P33时，注射Lin⁺HSC后，最深视网膜层的血管几乎完全消失(图4(a和b))。相反，至P33时大多数注射了Lin^-HSC的视网膜具有几乎正常的视网膜血管系统，其具有3个平行的、良好成型的血管层(图4(a和d)。该作用的量化表明，注射了Lin^-的rd/rd眼的深血管丛中血管平均长度几乎是未处理或Lin⁺细胞处理的眼的3倍(图4(e))。令人惊讶的是，注射来源于rd/rd成体小鼠(FVB/N)骨髓的Lin^-HSC组合物也拯救了变性的rd/rd新生小鼠视网膜血管系统(图4(f))。早在出生后2-3周便观察到rd/rd小鼠眼中血管系统的变性。迟至P15时注射Lin^-HSC也能部分稳定rd/rd小鼠的变性血管系统达至少一个月(图4(g和h))。

注射至幼龄(例如P2)rd/rd小鼠中的Lin^-HSC组合物也渗入到发育中的表层血管中。至P11时，观察到这些细胞移至深血管丛层面，并形成与在野生型外部视网膜血管层中所观察到的相同样式(图5(a))。为了更清晰描述所注射的Lin^-HSC组合物中的细胞渗入并稳定rd/rd小鼠中的变性视网膜血管系统的方式，将来源于Balb/c小鼠的Lin^-HSC组合物注射入Tie-2-GFP FVB小鼠眼中。FVB小鼠具有rd/rd基因型，并且由于它们表达融合蛋白Tie-2-GFP，所以所有的内源血管都发荧光。

当将Lin^-HSC组合物中的未标记细胞注射入新生Tie-2-GFP FVB眼中并随后渗入发育中的血管系统中时，Tie-2-GFP标记的内源性血管中应有未被标记的裂缝，这些裂缝对应于注射的、渗入的、未被标记的LinHSC。随后用另一种血管标记物(例如CD-31)染色，那么就描绘出整个血管，允许确定非内源性内皮细胞是否是血管系统的一部分。注射后两个月，在注射Lin^-HSC组合物的眼视网膜中观察到CD-31阳性的、Tie-2-GFP阴性的血管(图5(b))。有趣的是，多数被拯救的血管含有Tie-2-GFP阳性细胞(图5(c))。如同平滑肌肌动蛋白染色所测定的那样，不管是否存在血管拯救，周细胞分布都不因注射Lin^-HSC而改变(图5(d))。这些数据清楚表明，玻璃体内注射的本发明的Lin^-HSC组合物在遗传缺陷小鼠中移至视网膜中、参与正常视网膜血管形成并稳定变性中的内源性血管。    

由来自Lin^-HSC的转染细胞抑制视网膜血管发生。多数视网膜血管疾病涉及异常的血管增生而不是变性。靶向星型胶质细胞的转基因细胞可用于传递抗血管发生蛋白并抑制血管发生。用T2-色氨酰-tRNA合成酶(T2-TrpRS)转染来自Lin^-HSC组合物的细胞。T2-TrpRS是有效抑制视网膜血管发生的TrpRS的43kD片段(图6(a))。P2时注射对照质粒转染的Lin^-HSC组合物(无T2-TrpRS基因)的眼视网膜在P12时具有正常的初级(图6(c))与次级(图6(d))视网膜血管丛。当将T2-TrpRS转染的本发明Lin^-HSC组合物注射入P2眼中并在10天后评价时，初级网络明显异常(图6(e))，深视网膜血管系统的形成几乎完全被抑制(图6(f))。这些眼中观察到的极少量血管变细，血管间具有大间隙。分泌T2-TrpRS的Lin^-HSC的抑制程度详述于表2。

T2-TrpRS由Lin^-HSC组合物中的细胞在体外产生和分泌，将这些转染细胞注射入玻璃体之后，在视网膜中观察到30kD的T2-TrpRS片段(图6(b))。此30kD片段仅在注射本发明的转染的Lin^-HSC的视网膜中才能明确地观察到，与重组或体外合成的蛋白相比，这种表观分子量的降低可能归因于T2-TrpRS在体内的加工或降解。这些数据表明，Lin^-HSC组合物可通过靶向活性星型胶质细胞而用于将有功能活性的基因(例如表达血管生成抑制分子的基因)传递至视网膜血管系统。虽然观察到的血管生成抑制作用可能是由于细胞介导的活性所致，但这是极不可能的，因为用相同的、但非T2转染的Lin^-HSC组合物治疗的眼具有正常的视网膜血管系统。

             表2.T2-TrpRS分泌型Lin^-HSC的血管抑制作用

    初级丛                深丛受抑制的正常的完全的部分的正常的T2TrpRS(15只眼)60％(9只眼)40％(6只眼)33.3％(5只眼)60％(9只眼)6.7％(1只眼)对照(13只眼)0％(0只眼)100％(13只眼)0％(0只眼)38.5％(5只眼)61.5％(8只眼)

玻璃体内注射的Lin^-HSC群定位至视网膜星型胶质细胞、渗入血管中并可用于治疗多种视网膜疾病。虽然注射的HSC组合物中的大多数细胞附着于星型胶质细胞模板，但少量细胞深入地移入视网膜中，归巢至深血管网络随后将在此发育的区域。即便在出生后42天之前在此区域没有观察到GFAP阳性星型胶质细胞，也不能排除GFAP阴性神经胶质细胞已存在而为Lin^-HSC定位提供信号的可能性。以前的研究已表明许多疾病同活性神经胶质增生相关。尤其是在DR中，神经胶质细胞及其胞外基质同病理性血管发生有关。

由于注射的Lin^-HSC组合物中的细胞特异性地附着于表达GFAP的神经胶质细胞，因此不管什么类型的损伤，均可使用本发明的Lin^-HSC组合物靶向视网膜中的血管发生前的损伤部位。例如，在诸如糖尿病的局部缺血性视网膜病变中，新生血管形成是对缺氧的反应。通过将Lin^-HSC组合物靶向病理性新生血管化部位，可以稳定发育中的新生血管系统，从而防止诸如出血或水肿的新生血管系统异常(同DR相关的视觉丧失的病因)，并能潜在地缓解原本刺激新生血管形成的缺氧。异常血管可被恢复成正常状态。此外，可使用转染的Lin^-HSC组合物和激光诱导的星型胶质细胞活化作用，将血管生成抑制蛋白如T2-TrpRS传递到病理性血管发生部位。由于激光光凝术普遍应用在临床眼科学上，所以该方法具有针对多种视网膜疾病的应用。尽管已在癌症治疗中研究了这些基于细胞的方法，但由于眼内注射使得有可能将大量细胞直接传递至患病部位，故这些方法对眼疾的用途更有优势。

Lin^-HSC的神经营养性和血管营养性拯救。如上所述用MACS由增强绿色荧光蛋白(eGFP)、CM(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠骨髓中分离Lin^-HSC。将来自这些小鼠的含EPC的Lin^-HSC玻璃体内注射入P6 C3H或FVB小鼠眼中。在注射后的不同时间点(1个月、2个月及6个月)收集视网膜。通过CD31抗体染色后的扫描激光共焦显微镜和DAPI核染色后的视网膜组织学分析血管系统。还使用不同时间点的视网膜mRNA的微阵列基因表达分析鉴别潜在地涉及该作用的基因。

至P21时rd/rd小鼠的眼睛具有视网膜神经感觉层和视网膜血管系统的严重变性。于P6时用Lin^-HSC处理的rd/rd小鼠眼睛维持正常的视网膜血管系统长达6个月；在所有时间点上(1M、2M和6M)与对照相比，深层与中间层都有显著改善(参见图12)。此外，我们观察到相对于作为对照的用Lin⁺HSC处理的眼，用Lin^-HSC处理的视网膜还更厚(1M；1.2倍，2M；1.3倍，6M；1.4倍)，在外核层具有更多数目的细胞(1M；2.2倍，2M；3.7倍，6M；5.7倍)。同对照(未处理或非Lin^-处理的)rd/rd视网膜相比，对“被拯救的”视网膜(例如，Lin^-HSC)的大规模基因组分析表明，编码sHSP(小热休克蛋白)以及与血管和神经拯救相关的特异性生长因子的基因(包括编码列于图20的图A与B中的蛋白的基因)明显上调。

本发明的骨髓源Lin^-HSC群显著且可重复地诱导正常血管系统的维持，并极大增加了rd/rd小鼠中的光感受器及其它神经元细胞层。这种神经营养性拯救作用与小热休克蛋白和生长因子的显著上调相关，对目前尚无法治愈的视网膜变性疾病提供了治疗方法的思路。

rd1/rd1小鼠视网膜表现出深度血管和神经元变性。小鼠中正常的出生后视网膜血管与神经元发育已有详细描述，与在妊娠末三个月的人类胎儿中所观察到的变化类似(Dorrell等，2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.43：3500-3510)。rd1基因的小鼠纯合子共有人视网膜变性的多种特征(Frasson等，1999，Nat.Med.5：1183-1187)，表现出快速的光感受器(PR)丧失，并伴有由PR cGMP磷酸二酯酶编码基因中的突变导致的严重血管萎缩(Bowes等，1990，Nature347：677-680)。为检查视网膜发育中的血管系统及其随后的变性，使用抗胶原蛋白IV(CIV)的抗体和抗CD31(PECAM-1)的抗体(图15)，抗胶原蛋白IV为成熟血管系统的胞外基质(ECM)蛋白，CD31为内皮细胞标记物。rd1/rd1(C3H/HeJ)的视网膜正常发育，直至约出生后(P)8天，此时含光感受器的外核层(ONL)开始变性。ONL快速变性，细胞经凋亡死亡，使得至P20时仅余下单层核。用CIV和CD31这二者的抗体双重染色整装视网膜揭示，rd1/rd1小鼠中的血管变性细节同其他人所描述的相似(Blanks等，1986，J.Comp.Neurol.254：543-553)。视网膜血管初级层和深层看起来发育正常，直至P12，之后内皮细胞快速损失，依据是CD31染色消失。CD31阳性内皮细胞以正常分布存在，直至P12，但此后快速消失。有趣的是，CIV阳性染色在所检查的全部时间点都保持存在，提示血管及相连的ECM正常形成，但在P13之后仅保留基质，至P13时未观察到CD31阳性细胞。(图15，中图)。中间血管丛在P21之后也变性，但进度要慢于在深丛中所观察到的(图15，上图)。为与rd1/rd1小鼠对比，给出了正常小鼠的视网膜血管和神经细胞层(右图，图15)。

骨髓源Lin^-HSC在rd1/rd1小鼠中的神经保护作用。玻璃体内注射的Lin^-HSC渗入到全部三个血管丛中的内源性视网膜血管系统中，并防止血管变性。有趣的是，实际上从未在外核层观察到注射的细胞。这些细胞或渗入到形成中的视网膜血管中，或在这些血管附近被观察到。鼠Lin^-HSC(来自C3H/HeJ)于变性就要开始前的P6时玻璃体内注射入C3H/HeJ(rd1/rd1)小鼠眼中。至P30时，注射对照细胞(CD31^-)的眼表现出典型的rd1/rd1表型，即在每一个检查的视网膜中均观察到几乎完全变性的深层血管丛及ONL。注射Lin^-HSC的眼保持了正常表观的中间血管丛及深血管丛。令人惊讶的是，在注射Lin^-HSC的眼的内核层(INL)和ONL中观察到的细胞明显多于注射了对照细胞的眼(图16(A))。Lin^-HSC的这种拯救作用可以在注射后2个月观察到(图16(B))，并持续长达6个月(图16(C))。当比较被拯救的与未被拯救的眼时，注射了Lin^-HSC的眼的中间丛和深丛血管系统以及含神经元细胞的INL与ONL中的差异在所有测量时间点都很明显(图16(B和C))。通过测量血管系统总长度(图16(D))并计数ONL中所观察到的DAPI阳性细胞核数(图16(E))量化这种作用。对所有时间点的数据应用简单的线性回归分析。

在注射Lin^-HSC的眼中于P30(p＜0.024)及P60(p＜0.034)时观察到血管拯救与神经元(例如ONL厚度)拯救之间的统计学显著相关性(图16(F))。当P180时比较注射过Lin^-HSC的视网膜和注射过对照细胞的视网膜时，尽管无统计学显著性(p＜0.14)，但相关性仍很高(图16(F))。相反，注射过对照细胞的视网膜在任何时间点都未显示出血管系统保持与ONL之间的显著相关性(图16(F))。这些数据表明，玻璃体内注射Lin^-HSC在rd1/rd1小鼠视网膜中导致伴发的视网膜血管及神经元拯救。在ONL中或者视网膜血管内或临近视网膜血管以外的任何位置都未观察到注射的细胞。

注射过Lin^-HSC的rd/rd视网膜的功能性拯救。对注射对照细胞或鼠Lin^-HSC后两个月的小鼠做视网膜电图(ERG)(图17)。ERG记录后对每只眼进行免疫组化与显微分析，以确认已发生血管及神经元拯救。来自被拯救的治疗眼和未被拯救的对照眼的代表性ERG记录显示，在被拯救的眼中，数字上扣减的信号(治疗的眼减去未治疗的眼)产生约8-10微伏振幅的清晰可检测信号(图17)。显然，来自两只眼睛的信号严重异常。然而，由Lin^-HSC治疗的眼可记录到一致且可检测的ERG。在所有例子中，来自对照眼的ERG都是不可检测的。虽然被拯救的眼中的信号振幅远低于正常眼，但只要有组织学拯救就始终可以观察到信号，而且信号振幅与基于基因的其它拯救研究报道的信号近似。所有这些结果都表明在用本发明的Lin^-HSC处理的眼中存在某种程度的功能性拯救。

被拯救的rd/rd视网膜细胞类型主要为视锥。用对视杆视蛋白或视锥视蛋白特异性的抗体以免疫组化方法分析被拯救的和未被拯救的视网膜。对用于图17列出的ERG记录的相同眼睛进行视杆视蛋白或视锥视蛋白分析。在野生型小鼠视网膜中，存在的光感受器不足5％为视锥(Soucy等，1998，Neuron 21：481-493)，用红/绿视锥视蛋白或用视杆视紫红质所观测到的免疫组化染色图谱如图25(A)或图25(B)所示，该图谱符合视锥细胞的该百分率。当野生型视网膜用预免疫IgG染色时，在血管自身荧光以外的视网膜神经感觉层中的任意位置都未观察到染色(图25(C))。出生后2个月，未注射的rd/rd小鼠的视网膜具有基本萎缩的外核层，其用红绿视锥视蛋白抗体(图25(D))或视紫红质抗体(图25(G))未显示出任何染色。注射对照CD31^-HSC的眼也未对存在的视锥视蛋白(图25(E))或视杆视蛋白(图25(H))呈阳性染色。相反，注射Lin^-HSC的对侧眼在被保持的外核层中具有约3至约8排核；这些细胞的大部分对视锥视蛋白阳性(图25(F))，约1-3％对视杆视蛋白阳性(图25(I))。引人注目地是，这与最初由正常小鼠视网膜观察到的几乎相反，正常小鼠视网膜以视杆为主。这些数据表明，注射Lin^-HSC可在视锥一般应变性的延长时期内保持视锥。

人骨髓(hBM)源Lin^-HSC也拯救变性视网膜。分离自人骨髓的Lin^-HSC表现得类似于鼠Lin^-HSC。从人供体收集骨髓，除去Lin⁺HSC，产生人Lin^-HSC(hLin^-HSC)群。这些细胞用荧光染料活体外标记，并注射入C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠眼中。注射的Lin^-HSC迁移至和靶向视网膜血管发生部位，方式与注射鼠Lin^-HSC时观察到的方式相同(图18(A))。除了血管靶向以外，人Lin^-HSC还对rd1/rd1小鼠的血管和神经细胞层这二者提供了有力的拯救作用(图18(B和C))。此观察结果证实在人骨髓中存在靶向视网膜血管系统并可防止视网膜变性的细胞。

Lin^-HSC在rd10/rd10小鼠中具有血管营养性和神经营养性作用。尽管rd1/rd1小鼠是应用最广泛、表征最详尽的视网膜变性模型(Chang等，2002，Vision Res.42：517-525)，但变性非常迅速，在这点上与在人类疾病中观察到的通常更慢的时程不同。在这个品系中，光感受器细胞变性在P8左右开始，P8是视网膜血管系统仍在快速伸展的时刻(图15)。深层视网膜血管系统随后发生变性，即便中间丛仍在形成时，因此，rd1/rd1小鼠的视网膜从未完全发育，这与在大多数患有该病的人中所观察到的不同。rd10小鼠模型具有更慢的变性时程，更紧密类似于人视网膜变性状态，使用该模型研究Lin^-HSC介导的血管拯救。在rd10小鼠中，光感受器细胞变性于P21左右开始，其后不久便开始血管变性。

因为正常的视网膜神经感觉层发育至P21时大体完成，所以在视网膜已彻底分化后开始观察变性，因此，该变性比rd1/rd1小鼠模型更类似于人视网膜变性。将来自rd10小鼠的Lin^-HSC或对照细胞注射入P6眼中，以变化的时间点上评价视网膜。在P21时，注射了Lin^-HSC和对照细胞的眼的视网膜看起来都正常，所有的血管层都完全发育，INL与ONL正常发育(图18(D和H))。在约P21时视网膜变性开始发生并随时间加剧。至P30时，注射对照细胞的视网膜表现出严重的血管及神经元变性(图18(I))，而注射Lin^-HSC的视网膜保持几乎正常的血管层和光感受器细胞(图18(E))。被拯救的和未被拯救的眼之间的差异在后面的时间点上更加显著(对比图18(F和G)与图18(J和K))。在对照处理的眼中，通过对CD31和胶原蛋白IV的免疫组织化学染色非常清楚地观察到血管变性的发展(图18((I-K))。对照处理的眼对CD31几乎完全阴性，而胶原蛋白IV阳性血管“痕迹”仍然明显，表明发生的是血管退化，而不是未完成的血管形成。相反，Lin^-HSC治疗的眼同时具有CD31阳性和胶原蛋白IV阳性的血管，看起来非常类似于正常的野生型眼(对比图18(F和I))。

用Lin^-HSC治疗后rd/rd小鼠视网膜的基因表达分析。使用大规模基因组学(微阵列分析)分析被拯救的和未被拯救的视网膜，以鉴别神经营养性拯救中推定的介导物。将用Lin^-HSC治疗的rd1/rd1小鼠视网膜中的基因表达与未注射的视网膜以及注射对照细胞(CD31^-)的视网膜进行比较。这些比较各以一式三份实施。在所有的三份样品中，要求基因所具有的表达水平至少为背景水平的2倍高才可认定其存在。和注射了对照细胞及未注射的rd/rd小鼠视网膜相比，在Lin^-HSC保护的视网膜中被上调3倍的基因如图20中的图A和B所示。通过将标准偏差除以各个cRNA复制物的平均表达水平，计算表达基因的变异系数(COV)水平。另外，通过关联平均值和标准偏差(SD)计算表达水平和噪声离散之间的关联。获得各个基因的基因表达水平和标准偏差之间的关联，使得可以测定背景水平和可信表达水平阈值。总体来讲，数据完全落在容许限度内(Tu等，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：14031-14036)。以下单独讨论的基因具有的表达水平高于这些临界表达水平。所讨论基因的成对“t检验”值也列于表1。在各种情况下，p值是合理的(接近或低于0.05)，表明复制物之间存在相似性，不同测试组之间存在可能显著的差异。许多显著上调的基因，包括MAD及Ying Yang-1(YY-1)(Austen等，1997，Curr.Top.Microbiol.Immunol.224：123-130)，其编码蛋白所具有的功能与保护细胞免于凋亡相关。许多晶体蛋白与涉及保护细胞免受应力的已知热休克蛋白具有序列同源性和相似的功能，这些晶体蛋白也被Lin^-HSC治疗上调。α-晶体蛋白的表达通过免疫组织化学分析定位在ONL(图19)。图19表明，用Lin^-HSC治疗后在被拯救的外核层细胞中晶体蛋白αA上调，但在用对照细胞处理的对侧眼中未上调。左图显示了被拯救的视网膜中的IgG染色(对照)。中图显示了被拯救的视网膜中的晶体蛋白αA。右图显示了未被拯救的视网膜中的晶体蛋白αA。

将来自用人Lin^-HSC拯救的rd1/rd1小鼠视网膜的信使RNA杂交至人特异性Affymetrix U133A微阵列芯片上。经严格分析后，发现了许多基因，其mRNA表达是人特异性的、高于背景，与鼠Lin^-HSC拯救的视网膜和注射了人对照细胞的、未被拯救的视网膜相比，在人Lin^-HSC拯救的视网膜中明显更高(图20，图C)。CD6(一种在原生的和新分化的CD34+造血干细胞表面表达的细胞粘附分子)和干扰素α13(另一个由造血干细胞表达的基因)都是通过微阵列生物信息学技术发现的，验证了评价方法的有效性。此外，在人Lin^-HSC拯救的小鼠视网膜样品中，几种生长因子及神经营养因子高于背景表达(图20，图D)。

使用谱系定型造血细胞标记负选择含EPC的骨髓源Lin^-HSC群。虽然可用作EPC的骨髓源Lin^-HSC亚群不是由常用的细胞表面标记所表征的，但这些细胞在发育中或受损的视网膜血管系统中的行为完全不同于在Lin⁺或成熟内皮细胞群中所观察到的。这些细胞选择性地靶向视网膜血管发生部位，参与伸展血管的形成。

遗传性视网膜变性疾病通常伴发视网膜血管损失。对这类疾病的有效治疗要求功能恢复以及维持复杂组织结构。尽管最近几项研究已经研究了营养因子或干细胞自身的基于细胞传递的用途，但这二者的某种组合可能是必需的。例如，使用生长因子疗法治疗视网膜变性疾病导致血管不可调节地过度生长，造成正常视网膜组织结构的严重破坏。使用神经或视网膜干细胞治疗视网膜变性疾病可重建神经元功能，但功能性血管对维持视网膜功能完整性也是必需的。本发明的Lin^-HSC的细胞渗入到rd/rd小鼠视网膜血管，在不破坏视网膜结构的情况下稳定变性的血管系统。当细胞注射入P15 rd/rd小鼠中时也观察到这种拯救作用。由于rd/rd小鼠中的血管变性在P16时开始，所以这个观察结果扩展了有效Lin^-HSC治疗的治疗窗。在注射了本发明的Lin^-HSC的眼中视网膜神经元和光感受器得以保持，视觉功能得以维持。

成体骨髓源Lin^-HSC在玻璃体内注射入患有视网膜变性疾病的小鼠中时，施加深度的血管营养性和神经营养性作用。这种拯救作用在治疗后持续达6个月，而且在完全视网膜变性之前(直到小鼠出生后16天，所述小鼠通常至出生后30天表现出完全视网膜变性)注射Lin^-HSC时最有效。这种拯救作用在两种视网膜变性小鼠模型中观察到，而且引人注目地是，当受体是患有视网膜变性的免疫缺陷啮齿类动物(例如SCID小鼠)时用成人骨髓源HSC，或者当供体是患有视网膜变性的小鼠时，能够实现这种拯救。虽然最近几个报道描述了在利用野生型基因的病毒型基因拯救之后，患有视网膜变性的小鼠或狗中的部分表型拯救(Ali等，2000，Nat Genet 25：306-310；Takahashi等，1999，J.Virol.73：7812-7816；Acland等，2001，Nat.Genet.28：92-95)，但本发明是第一个通过血管拯救获得的通用细胞型治疗作用。因此，此方法对治疗具有100个以上已知相关突变的一组疾病(例如色素性视网膜炎)的潜在用途比创建针对每个已知突变的单个基因疗法更实用。

神经营养性拯救作用的确切分子基础还不清楚，但仅在有伴发的血管稳定/拯救的情况下观察到。注射干细胞本身的存在不足以产生神经营养性拯救，在外核层中明显不存在干细胞源神经元排除了所注射细胞转变为光感受器的可能性。由微阵列基因表达分析获得的数据表明已知具有抗凋亡效应的基因明显上调。由于在视网膜变性中观察到的大多数神经元死亡都为凋亡方式，所以这种保护可能对在这些疾病中延长光感受器和其它视觉功能关键性神经元的寿命具有重大疗效。c-myc是一种通过上调各种下游凋亡诱导因子而参与凋亡的转录因子。c-myc表达在rd/rd小鼠中增至高于野生型4.5倍，表明它可能涉及在rd1/rd1小鼠中观察到的光感受器变性。已知两个在Lin^-HSC保护的视网膜中显著上调的基因Mad1和YY-1(图20，图A)抑制c-myc活性，从而抑制c-myc诱导的凋亡。还已表明，Mad1过表达抑制Fas诱导的胱天蛋白酶-8活化，胱天蛋白酶-8是凋亡途径的另一种关键组分。这两种分子的上调可通过防止一般在rd/rd小鼠中导致变性的凋亡启动而在保护视网膜免于血管和神经变性方面发挥作用。

另一组在Lin^-HSC保护的视网膜中大幅上调的基因包括晶体蛋白家族成员(图20，图B)。与热休克蛋白及其它应激诱导蛋白相似，晶体蛋白可被视网膜应激激活，提供抗凋亡的保护作用。在视网膜营养失调大鼠模型中，αA-晶体蛋白的异常低表达同光感受器损失相关，最近一个rd/rd小鼠视网膜的蛋白质组学分析表明，晶体蛋白上调的诱导是对视网膜变性的响应。根据我们的EPC拯救的rd/rd小鼠视网膜的微阵列数据，晶体蛋白的上调看起来在EPC介导的视网膜神经保护中起重要作用。

诸如c-myc、Mad1、Yx-1的基因和晶体蛋白可能是神经元拯救的下游介导物。神经营养性物质可调节抗凋亡基因表达，但我们用小鼠干细胞拯救的视网膜的微阵列分析未证实诱导增加水平的已知神经营养因子。另一方面，用人特异性芯片分析人骨髓源干细胞介导的拯救的确表明，多个生长因子基因的表达低但显著地增加。

上调基因包括成纤维细胞生长因子家族的某些成员与Otoferlin。Otoferlin基因中的突变与遗传障碍相关，引起听觉神经疾病所致的耳聋。有可能是由注射的Lin^-HSC产生的Otoferlin也有助于预防视网膜神经疾病。在历史上，一直以来都假设在视网膜变性的病人及动物中观察到的血管变化是由于光感受器死亡所引起的代谢需求减少的继发结果。本文数据表明，至少对患有遗传性视网膜变性的小鼠来说，保持正常的血管系统可能也有助于维持外核层的组分。近来文献中的报道会支持这样一个观点：组织特异性血管系统具有的营养作用超出了仅提供血管“养分”的预期作用。例如，在VEGFR1活化后，肝内皮细胞当遭遇肝损伤时可被诱导产生肝细胞再生与维持的关键性生长因子(LeCouter等，2003，Science 299：890-893)。

已报道血管内皮细胞和邻近的肝实质细胞之间相似的指示性相互作用与肝器官形成有关，之后很久才形成功能性血管。在视网膜变性个体中的内源性视网膜血管系统可能不会促成如此有力的拯救，但如果该血管系统用来源于骨髓造血干细胞群的内皮祖细胞支撑，则它们会使血管系统对变性更有抗性，同时有利于视网膜神经元以及血管存活。在患有视网膜变性的人中，延迟完全视网膜变性发作可提供数年的额外视觉能力。用本发明Lin^-HSC治疗的动物明显保持了足可支持其视力的ERG。

在临床上广泛认识到，尽管仍能保持视觉功能，但光感受器与其它神经元可能已有实质损失。在某些情况下，关键阈值相交，视觉丧失。由于几乎所有的人遗传性视网膜变性都发病早但发病慢，因此可鉴别视网膜变性个体，并用本发明的自体骨髓干细胞移植物玻璃体内治疗，以延迟视网膜变性和伴发的视觉丧失。为增强这些干细胞的靶向与渗入，期望存在活化的星型胶质细胞(Otani等，2002，Nat.Med.8：1004-1010)；这可在存在相关的神经胶质增生时通过早期治疗实现，或通过使用激光刺激活性星型胶质细胞局部增殖实现。任选地，在眼内注射前用一种或多种神经营养物质活体外转染干细胞可用于增强拯救作用。该方法可用于治疗其它视觉神经元变性疾病，例如其中存在视网膜神经节细胞变性的青光眼。

本发明的Lin^-HSC群含有EPC群，其可在不破坏视网膜结构的情况下通过靶向活性星型胶质细胞并渗入既有模板中而促进血管发生。本发明的Lin^-HSC群还在患有视网膜变性的眼中提供了令人惊讶的长期神经营养性拯救作用。此外，遗传修饰的、含EPC的自体Lin^-HSC组合物可移植入局部缺血或异常血管化的眼中，并可稳定渗入新血管和神经元层中，长期持续地局部传递治疗分子。这种以生理学上有意义的剂量局部传递表达药物的基因代表了一种治疗目前无法治愈的眼疾的新范例。

例如，正常小鼠视网膜中的光受体主要为视杆，但在用本发明的Lin^-HSC拯救后观察到的外核层主要含视锥。大部分遗传性人视网膜变性由原发性视杆特异性缺陷所致，一般认为视锥丧失是视杆功能失调的继发结果，视杆功能失调可能与视杆表达的某些营养因子的缺失有关。在面对视杆/视网膜变性时由Lin^-HSC促进的诱导视锥存活的本发明方法提供了一个方法，以在例如色素性视网膜炎的疾病中更好地保持视锥为主的人类黄斑。

可实施上述实施方案中的众多变化和修改而不背离本发明新特征的精神和范围。本文阐述的具体实施方案无限制意图或不应被推断为有限制作用。

               序列表

<110>The Scripps Research Institute

     Friedlander，Martin

     Otani，Atsushi

     DaSilva，Karen

     Moreno，Stacey(Hanekamp)

<120>分离的谱系阴性造血干细胞及用其治疗的方法

<130>TSRI-988.2 PCT

<150>10/933,634

<151>2004-09-03

<150>10/833,743

<151>2004-04-28

<150>10/628,783

<151>2003-07-25

<150>60/467,051

<151>2003-05-02

<150>60/398,522

<151>2002-07-25

<160>2

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>4742

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码His-标记的人T2-TrpRS的DNA

<400>1

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg    60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc    120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg    180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc    240

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ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg    4740

at                                                                   4742

<210>2

<211>392

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>His-标记的人T2-TrpRS

<400>2

Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly

 1               5                  10                  15

Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr

            20                  25                  30

Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His

        35                  40                  45

Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe

    50                  55                  60

Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly

65                  70                  75                  80

His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn

                85                  90                  95

Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys

            100                 105                 110

Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys

        115                 120                 125

Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser

    130                 135                 140

Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val

145                 150                 155                 160

Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly

                165                 170                 175

Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln

            180                 185                 190

Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg

        195                 200                 205

Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr

    210                 215                 220

Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro

225                 230                 235                 240

Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr

                245                 250                 255

Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr

            260                 265                 270

Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly

        275                 280                 285

Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val

    290                 295                 300

Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys

305                 310                 315                 320

Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly

                325                 330                 335

Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu

            340                 345                 350

His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe

        355                 360                 365

Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala

    370                 375                 380

Leu Glu His His His His His His

385                 390