泛菌属菌Pantoea sp.M3及其用于降解孔雀石绿的方法

摘要

本发明公开了一种泛菌属菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022)。这种细菌具有降解孔雀石绿的能力。取对数期该菌株，按2％～4％的重量百分比浓度添加到浓度为0.5mg/L～5mg/L的灭菌孔雀石绿降解培养液中，降解培养液组成按g/L计为：葡萄糖0.5～1；NaCl 0.01～0.1；MgSO

说明书

技术领域

本发明涉及泛菌属的新菌株，还涉及该菌株在降解孔雀石绿中的应用。

背景技术

孔雀石绿(malachite green，MG)作为杀真菌剂曾广泛应用于水产养殖业。MG进入生物体后，转化生成隐孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)。MG及LMG在生物体组织中积累起来，不易代谢，具有致癌、致突变作用。加拿大欧盟等国均规定在食用水产品中禁止检出MG及其LMG。我国于2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。由于MG的代谢周期缓慢，一般鱼塘多年难以根本消除。因此，对渔业水域中MG的残留问题也应当加以高度重视。

目前处理水中孔雀石绿的主要方法有物理方法，化学方法和生物方法。物理方法主要是通过吸附，沉降作用去除。化学方法主要有光助Fenton反应，异相光催化，光电催化，电化学方法等。但是这些处理方法投资大、流程复杂，物理吸附并未能将孔雀石绿分解去除，吸附后废水中仍有孔雀石绿残留，而且容易造成二次污染。

因此，人们采用微生物的方法降解MG。细菌降解孔雀石绿的报道很少。一项德国发明专利(Akad.Wiss.Microbial breakdown of xenobiotic dyes oftriphenylmethane series[P].German patent：PN290004，PY1991.05.16.)筛选得到分枝杆菌Mycobacterium sp.和棒状杆菌属Corynebacterium sp，对于20mg/L孔雀石绿，在24℃可以在2h内使脱色率达到47％，在32℃，pH 6.8，22小时内，完全脱色。Rajesh筛选得到一株库尔特氏杆菌能够降解孔雀石绿(Rajesh，1999)，该菌可在30min内完全使0.365～1.825mg/L的孔雀石绿完全脱色。Sun-YoungAn1等2002年发现一株柠檬酸杆菌属(Citrobacter)可完全脱色3.65mg/L的孔雀石绿。但是现有的微生物处理方法主要集中于MG的脱色研究，检测方法也多用紫外分光光度法，精确度不高，而且对其主要代谢产物LMG没有同时检测。代谢产物隐孔雀石绿同时降解后的检测的研究未见报道。

发明内容

1、要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种降解孔雀石绿高效、快速的细菌及其使用方法，利用该菌能够有效降解孔雀石绿。

2、技术方案

采用的技术方案如下：

一种泛菌属菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年3月12日)，其具有降解孔雀石绿的能力。

该菌种的主要特征为：菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，兼性厌氧，过氧化氢酶、V.P.试验、MR试验、柠檬酸盐阳性，氧化酶、吲哚试验阴性，葡萄糖发酵产酸产气，不能水解淀粉。富集培养基上菌落呈白色圆形，边缘平滑，表面凸起，边缘整齐。在该培养基上30℃培养24h，菌落直径1mm～3mm.不能以孔雀石绿作为唯一碳源生长。

提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，PCR扩增16S rDNA，扩增引物为细菌通用引物。正向引物为27f：5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；反向引物为1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR产物经电泳检验后委托上海博雅生物技术有限公司进行测序，将所得测序序列结果提交GeneBank，得到M3的16S rDNA序列的Genebank编号：EF192586。

本发明采用先富集后筛选的方法获得该菌株。其步骤如下：

1)从多次喷洒过孔雀石绿的鱼塘底泥中，取适量鱼塘底泥接种于含0.04mg/L MG的富集培养基中，30℃、150rpm黑暗培养。富集培养基的配方为(mg/L)：葡萄糖1000；NaCl 10；MgSO₄10；NH₄NO₃100；K₂HPO₄100；KH₂PO₄100；酵母膏60；pH 7.0。

2)待培养液混浊且颜色转浅后，将悬浊液转接至下一批次新鲜培养液中(同步骤1中)，并逐步加大MG浓度，如此重复，直至MG浓度达5mg/L。

3)驯化后得到的混合培养物经富集培养基平板涂布分离和纯化，最终筛选得到MG高效降解菌株。

4)经生理生化及16S rDNA鉴定，确定上述菌株是泛菌属(Pantoeasp.)M3.保存在富集培养基的斜面，使用前外加以外加孔雀石绿(0.5mg/L)的上述培养基进行驯化。

该菌种培养方法为：富集培养液灭菌(同上)，30℃接种菌株M3，150rpm摇床培养至对数期。

用于降解孔雀石绿的方法：取对数期该菌株，按2％～4％的重量百分比浓度添加到浓度为0.5mg/L～5mg/L的灭菌孔雀石绿降解培养液中，降解培养液组成按g/L计为：葡萄糖0.5～1；NaCl 0.01～0.1；MgSO₄ 0.01～0.1；NH₄NO₃0.02～0.1；K₂HPO₄ 0.01～0.1；KH₂PO₄ 0.01～0.1；酵母膏0.06～0.3；pH值6.0～8.0。20～30℃降解5～10天，降解效果较好。

3、有益效果

本发明提供了一种用于高效降解孔雀石绿的细菌泛菌属菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022)，本发明可有效去除渔业水体中残留的孔雀石绿及其主要代谢产物隐孔雀石绿。本发明对低浓度孔雀石绿渔业水体具有很好的处理效果，对温度适应范围比较广。该菌株对20～30℃的0.5～2mg/L的孔雀石绿降解率在90％以上。使用方法方便，降解性能稳定，可同时降解孔雀石绿主要代谢产物隐孔雀石绿。

本发明所涉及细菌已提交保藏：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2007年3月12日，保藏编号：CCTCC No.M 207022。

附图说明

图1为葡萄糖浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；

图2为葡萄糖浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响；

图3为NH₄NO₃浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；

图4为NH₄NO₃浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响；

图5为不同磷浓度条件下对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；

图6为不同磷浓度条件下对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响；

图7为温度对对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；

图8为温度对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明

实施例1：

取适量鱼塘底泥接种于含0.04mg/L MG的富集培养基中，30℃、150rpm黑暗培养。待培养液混浊且颜色转浅后，将悬浊液转接至下一批次新鲜培养液中，并逐步加大MG浓度，如此重复，直至MG浓度达5mg/L。驯化后得到的混合培养物经富集培养基平板涂布分离和纯化，最终筛选得到MG高效降解菌株M3。

实施例2：

将菌株接种于5mg/L的孔雀石绿富集培养基中，活化至对数期，培养基成分按mg/L计为：葡萄糖1000；NaCl 10；MgSO₄ 10；NH₄NO₃ 100；K₂HPO₄100；KH₂PO₄ 100；酵母膏60；pH 7.0。将所得菌液按2％～4％的重量百分比浓度接入含孔雀石绿0.5～5mg/L孔雀石绿培养基中，培养5天后测定降解率，可分别达到97.54％，97.1％，100％和77.8％，可见该菌对孔雀石绿特别是较低浓度的孔雀石绿降解效果更好。

实施例3：

在降解体系中设置不同葡萄糖浓度来比较MG降解效果(图1和图2)。由图1和图2可见，在葡萄糖浓度为0mg/L时，M3生长缓慢，培养10d后MG浓度降低仍不明显，说明M3不能以MG作为唯一碳源进行生长和代谢，其缓慢的生长和降解可能是由于初始接入的菌悬液影响而发生。较高葡萄糖浓度500mg/L和1000mg/L时，MG的降解速率和菌株生长情况基本一致，1d内菌株即可到达生长稳定期，在2d内均可将MG几乎完全降解。因此，葡萄糖作为菌株生长基质的碳源，其浓度对微生物的生长有一定影响，浓度越高，菌体增殖越快，对MG降解越强。从经济性角度考虑，不超过500mg/L葡萄糖就完全有利于M3对MG的降解。

实施例4：

氮源是促进细菌生长的重要营养元素之一。在降解体系中设置不同氮源(NH₄NO₃)浓度，比较MG降解效果。由图3可知氮浓度对M3的生长具有一定影响，氮浓度增大，可以促进菌体的生长。这和MG降解情况相似。从图4可见，2d内高氮浓度200mg/L时，MG降解率就可达到92.8％，而低氮浓度20mg/L时，MG降解率仅为65.6％。但是，若增加培养时间(6d)，不同氮源浓度MG降解率均可达到95.9％以上。由此可见，提高氮浓度能提高M3对MG的起始降解速率，但即使在低氮浓度条件下通过延长培养时间(6d)也能使MG几乎完全降解。因此，从经济角度考虑，氮源浓度选择不超过20mg/L就能有利于MG降解，并可通过适当增加培养时间以达到有效降解MG的目的。

实施例5：

磷源也是微生物生长的重要元素之一。在培养体系中设置不同的磷浓度，比较MG降解效果。由图5可知，同20mg/L相比，100mg/L磷浓度时M3生长更好，因此，提高磷浓度有利于M3的生长。这与MG的降解情况有所不同。从图6中可知，50mg/L和100mg/L磷浓度下M3对MG的降解情况相似，100mg/L条件下降解速率略快。磷浓度为20mg/L时，2d内MG几乎不被降解，4d后降解率也仅达到40％，而在高磷浓度条件下(50mg/L和100mg/L)MG降解率可分别达到82.05％和97.95％。随着培养时间的不断延长(6d)，不同磷浓度条件下M3对MG的降解率均可达到96.4％以上。由此可见，提高磷浓度能提高M3对MG的起始降解速率，但即使在低磷浓度条件下通过延长培养时间(6d)也能使MG几乎完全降解。因此，从经济角度考虑，不超过20mg/L磷浓度就能有利于MG的降解，并可以通过适当增加处理时间就能达到有效降解MG的目的。

实施例6：

在体系中设置不同温度，比较MG降解效果。由图7可见，温度对菌株M3的生长影响不大，但是，温度对菌株降解MG速率的影响很大(图8)。随着温度升高，菌株对MG的起始降解速率不断增加，在25℃时降解速率最大。10d后，低温度15℃时，M3对MG的降解率仅达到了46.76％，而20℃和25℃时，M3对MG的降解率分别达到91.6％和94.55％。Akad的德国专利中(PN290004，PY1991.05.16).所筛选的菌株Corynebacterium sp.和Mycobacterium sp.可在24℃降解脱色MG至53％，在32℃时可完全降解脱色MG。因此，本发明筛选出的菌株M3在实际污染处理中能适应更广泛的环境条件，优于已报道的其他菌株。

实施例7：

将菌株接种于0.5mg/L的孔雀石绿富集培养基中，活化至对数期，培养基成分按mg/L计为葡萄糖800；NaCl 8；MgSO₄ 50；NH₄NO₃ 80；K₂HPO₄ 80；KH₂PO₄ 80；酵母膏300；pH 8.0。将所得菌液按3％的重量百分比浓度接入含孔雀石绿0.5mg/L孔雀石绿培养集中，培养5天后测定降解率，可达到90％以上。

实施例8：

将菌株接种于0.5mg/L的孔雀石绿富集培养基中，活化至对数期，培养基成分按mg/L计为葡萄糖500；NaCl 100；MgSO₄ 100；NH₄NO₃ 20；K₂HPO₄10；KH₂PO₄ 10；酵母膏100；pH 6.0。将所得菌液按4％的重量百分比浓度接入含孔雀石绿0.5mg/L孔雀石绿培养集中，培养5天后测定降解率，可达到90％以上。