新抗生素卡莫霉素(Chemomicin)B、C、D及其制造方法

摘要

本发明涉及一组新化合物卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)及其制备方法、以卡莫霉素B、C、D为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素B、C、D在制备抗肿瘤药物中的应用，所说卡莫霉素B、C、D是由诺卡氏菌地中海康乐变株1747－64(Nocardia Mediterranei Var.Kanglensis 1747－64)培养物中分离得到的新角蒽环类抗生素(Angucyclinone)，体外活性实验结果证明，卡莫霉素B、C、D对人食道癌细胞KYSE150有很强的抑制活性，作为一种新的抗肿瘤药物，具有良好的开发前景。

说明书

技术领域：

本发明涉及一组新的角蒽环类抗生素(Angucyclinone)：卡莫霉素B、C、D及其制备方法、以卡莫霉素B、C、D为活性成分的药物组合物以及卡莫霉素B、C、D在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

迄今发现来源于微生物的抗生素已超过万余种，其中许多作为医药，农药已得到广泛应用。Angucyclinone类抗生素是20世纪60年代发现的一类具有广泛生物学活性的抗生素，其结构与蒽环类抗生素比较相近，其中A环呈角的形式并于蒽环上。大部分Angucyclinone抗生素都具有抗肿瘤活性，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的活性较弱，个别此类抗生素还具有酶抑制剂活性、抗病毒活性、受体拮抗剂活性和免疫抑制活性。由于这类抗生素具有广泛生物学活性，引起了世界上许多研究者的注意，并对这类抗生素进行了深入的研究。到目前为止，已经发现的Angucyclinone这类抗生素已有一百多个[Rohr，J.NatRep.9(2)：103-137，1992]。

随着新抗生素大规模筛选研究不断向纵深发展，微生物发酵液中含量高、易分离的主组分抗生素大多已被分离出来，发现新抗生素的难度越来越大了。要进一步发现有显著生物活性的抗生素，需要有新的研究策略，如菌种上选择稀有放线菌、极端环境微生物等；化学上采用现代色谱-光谱联用技术以实现微快准早期结构判断，分离微量组分等等。

本实验室在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素过程中，分离得到具有抗肿瘤活性的Angucyclinone抗生素-卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)，经紫外光谱、红外光谱、质谱及核磁共振波普学数据分析，确定卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)为三个新结构的抗生素。该结构式与迄今已知结构的所有Angucyclinone类抗生素不同，目前尚未见到与莫霉素B、C、D具有相同结构及活性的相关报道。  迄今为止，已经发现的Angucyclinone类抗生素中，也未见到有Angucyclinone类抗生素成为抗肿瘤药物上市的。因此，卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)作为新结构抗肿瘤抗生素具有良好的研发应用前景。

本发明的目的之一是，提供如式(1)、(2)、(3)所示卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)的结构；

本发明的目的之二是，提供卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)的制备方法；

本发明的目的之三是，提供以卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)为活性成分的药物组合物；

本发明的目的之四是，提供卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)及其组合物在制备抗肿瘤药物中得应用。

发明内容：

本发明提供了如式(1)、(2)、(3)所示结构的卡莫霉素B、C、D(ChemomicineB、C、D)：

通过一系列光谱学分析，确定了卡莫霉素B、C、D(ChemomicinB、C、D)的结构。

本发明所说的卡莫霉素B是一种白色的粉末状物质，分子式为C₁₉H₁₈O₆，其结构特征为一种具有蒽醌环的四环结构，其中A环的C-3上有羟甲基结构。其易溶于甲醇、乙酸乙酯、二甲亚砜等溶剂，微溶于水、氯仿。当氯仿∶甲醇＝9∶1时，卡莫霉素B在硅胶板上的R_f＝0.35。本发明所说的卡莫霉素C是一种红色颗粒结晶状物质，分子式为C₁₉H₁₆O₆，其结构与卡莫霉素B很相似，是卡莫霉素B的C-6a位和C-12a位脱氢后的降解产物。其易溶于甲醇，乙酸乙酯，二甲亚砜等溶剂，微溶于水，氯仿。当氯仿∶甲醇＝9∶1时，卡莫霉素C在硅胶板上的R_f＝0.35。本发明所说的卡莫霉素D是一种棕褐色粉末状物质，分子式为C₁₉H₁₄O₅，是卡莫霉素C在C-4a位和C-12b位之间脱水后的降解产物，溶解性与前两个很相似。当氯仿∶甲醇＝9∶1时，卡莫霉素D在硅胶板上的R_f＝0.55。

本发明所说卡莫霉素B、C、D是在从稀有放线菌筛选抗肿瘤抗生素的过程中，由诺卡氏菌地中海变株1747-64(Nocardia Mediterranei Var.Kanglensis 1747-64)培养物中分离得到的。所说产生菌已于2005年12月8日送交位于北京的“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”进行保藏，其保藏编号为：CGMCC No.1554。

为了获得卡莫霉素B、C、D及其抗肿瘤活性，本发明采取了以下技术路线与步骤：

1、卡莫霉素B、C、D的发酵及培养：首先是将生长于斜面的诺卡氏菌地中海变株1747-64菌接种于种子培养基，在旋转摇床上培养，然后转入发酵培养基在往复振荡摇床上培养，收获发酵液；

2、卡莫霉素B的提取，分离：  发酵培养物中，加入弱酸(如2N的盐酸等)，抽滤除去菌丝，得到上清液，再用非极性有机溶剂(如乙酸乙酯或丙酮等)萃取，减压浓缩得到浸膏。浸膏先经硅胶柱层析，然后采用Sephadex LH-20对含有目标化合物的组分实施进一步分离，洗脱溶剂为甲醇。最后用聚酰胺薄膜进行制备，甲醇洗脱，低温减压浓缩蒸干，最后得到白色粉末目标化合物卡莫霉素B；

3、卡莫霉素C、D的提取，分离：将经聚酰胺薄膜分离得到的卡莫霉素B纯品用少量甲醇溶解，然后加入少量水，于50℃下加热48小时变性降解，经高效薄层板制备而得到；

4、卡莫霉素B、C、D的结构鉴定：根据UV、IR、HR-MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、DEPT数据测试和¹H-¹H相关谱(¹H-¹H COSY)、¹H-¹³C相关谱(HSQC)以及反向检测远程¹H-¹³C异核多键相关谱(HMBC)的分析，确定了卡莫霉素B、C、D的结构；

5、卡莫霉素B、C、D的生物学活性测定：  采用MTT法进行了体外抗肿瘤活性试验，所选用的肿瘤细胞株为人食道癌细胞KYSE150。研究结果表明，卡莫霉素B、C、D具有非常显著的抗肿瘤活性。

本发明还提供了卡莫霉素B、C、D的药物组合物。所说药物组合物，是以卡莫霉素B、C、D为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体所组成。

以上所说药学上可接受的载体是指，药学领域常规的药物载体，如稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙等。此外，还可在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明还提供了卡莫霉素B、C、D及其组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

发明效果：

本发明提供的结构式(1)、(2)、(3)所示化合物为三个新的Angucyclinone类抗生素卡莫霉素B、C、D(Chemomicin B、C、D)，经生物学活性实验证明，这三个化合物均具有十分显著的抗肿瘤作用，可望今后研究开发成为新的临床有效的抗肿瘤抗生素。

附图说明：

附图1-Chemomicin B在MeOH中的紫外光谱；

附图2-Chemomicm B的红外光谱(KBr压片)；

附图3-Chemomicin B的HR-ESI-MS谱；

附图4-Chemomicin B在DMSO-d₆中的¹H-NMR谱；

附图5-Chemomicin B在DMSO-d₆+D₂O中的¹H-NMR谱；

附图6-Chemomicin B在DMSO-d₆中的¹³C-NMR谱；

附图7-Chemomicin B在DMSO-d₆中的DEPT谱；

附图8-Chemomicin B在DMSO-d₆中的¹H-¹H COSY谱；

附图9-Chemomicin B在DMSO-d₆中的HSQC谱；

附图10-Chemomicin B在DMSO-d₆中的HMBC谱；

附图11-Chemomicin C在MeOH中的紫外光谱；

附图12-Chemomicin C的红外光谱(KBr压片)；

附图13-Chemomicin C的HR-ESI-MS谱；

附图14-Chemomicin C在DMSO-d₆中的¹H-NMR谱；

附图15-Chemomicin C在CD₃OD中的¹H-NMR谱；

附图16-Chemomicin C在CD₃OD中的¹³C-NMR谱；

附图17-Chemomicin C在CD₃OD中的DEPT谱；

附图18-Chemomicin C在CD₃OD中的¹H-¹H COSY谱；

附图19-Chemomicin C在CD₃OD中的HSQC谱；

附图20-Chemomicin C在CD₃OD中的HMBC谱；

附图21-Chemomicin D在MeOH中的紫外光谱；

附图22-Chemomicin D的红外光谱(KBr压片)；

附图23-Chemomicin D的HR-ESI-MS谱；

附图24-Chemomicin D在CD₃OD中的¹H-NMR谱；

附图25-Chemomicin D在CD₃OD中的¹³C-NMR谱；

附图26-Chemomicin D在CD₃OD中的DEPT谱；

附图27-Chemomicin D在CD₃OD中的¹H-¹H COSY谱；

附图28-Chemomicin D在CD₃OD中的HSQC谱；

附图29-Chemomicin D在CD₃OD中的HMBC谱。

具体实施方案：

以下实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>：卡莫霉素B、C、D的发酵

将生长于斜面的(2％可溶性淀粉、1％KNO₃、0.05％NaCl、0.05％K₂HPO₄，、0.001％FeSO₄·7H₂O，、0.05％MgSO₄·7H₂O，、2％琼脂、pH7.0)Nocardia MediterraneiVar.Kanglensis 1747-64菌接种于种子培养基(2％葡萄糖，1％黄豆粉，0.5％酵母粉，0.5％CaCO₃，pH6.5)50ml/250ml的摇瓶，在28℃于旋转摇床上培养48小时，然后以5％的接种量，转入发酵培养基(3％葡萄糖、1％花生饼粉、1％酵母粉、0.5％蛋白胨、0.1％CaCO₃，、pH6.5)100ml/500ml的三角瓶中，在28℃下于往复振荡摇床上培养72小时，收获发酵液共20L。

<实施例2>：卡莫霉素B、C、D的提取

以上所得发酵液用2N的HCl调pH至3～4，布氏漏斗里垫上滤纸抽滤，除去菌丝等，得到上清发酵液。用发酵液1/3体积的乙酸乙酯萃取三次，将三次萃取得到的乙酸乙酯合并后，加入无水硫酸钠干燥脱水，静置3～4小时，减压浓缩得到浸膏。

<实施例3>：卡莫霉素B、C、D的分离

以上所得浸膏先经硅胶柱层析以氯仿∶甲醇梯度洗脱进行初步分离，洗脱梯度分别为氯仿∶甲醇＝100∶1(共202mL)，氯仿∶甲醇＝20∶1(共300mL)，氯仿∶甲醇＝9∶1(共200mL)，收集各个馏分，将含有目标化合物-卡莫霉素B的组分合并浓缩；然后采用SephadexLH-20对含有目标化合物的组分进行进一步分离，洗脱溶剂为甲醇，流速为1mL/3分钟，共用甲醇350mL，收集洗脱液中的各个组分，并将含有目标化合物(卡莫霉素B)的组分合并浓缩；然后再采用聚酰胺薄膜制备(20×20cm，氯仿∶甲醇∶水＝9∶1∶0.5)，收集R_f＝0.65的绿色荧光带(卡莫霉素B)，甲醇洗脱后浓缩，再用Sephadex LH-20进行柱层析以除去聚酰胺薄膜中的杂质，低温旋转蒸干后真空干燥，得到卡莫霉素B的纯品，纯度为97.5％，共30mg。

将卡莫霉素B的纯品，于50℃下旋转蒸干，至卡莫霉素B变性降解。将降解后的样品用少量甲醇溶解，经高效TLC板制备(氯仿∶甲醇＝9∶1)，收集R_f＝0.35黄色带(卡莫霉素C)和R_f＝0.55的暗褐色带(卡莫霉素D)，用氯仿∶甲醇＝19∶1的溶剂洗脱，室温旋转蒸干，真空干燥后得到卡莫霉素C的纯品，纯度为95.3％，共12mg；卡莫霉素D的纯品，纯度为92.6％，共8mg。

<实施例4>：卡莫霉素B、C、D的结构鉴定

卡莫霉素B的理化特性见表1。根据UV(图1)、IR(图2)、HR-ESI-MS(图3)、¹H-NMRDMSO-d₆为溶剂(图4)、DMSO-d₆+D₂O为溶剂(图5)、¹³C-NMR DMSO-d₆为溶剂(图6)、DEPT DMSO-d₆为溶剂(图7)数据和¹H-¹H COSY相关谱DMSO-d₆为溶剂(图8)、¹H-¹³C相关谱HSQC DMSO-d₆为溶剂(图9)以及反向检测远程¹H-¹³C异核多键相关谱HMBCDMSO-d₆为溶剂(图10)的分析结果，确定了卡莫霉素B的结构。

                         表1.卡莫霉素B的理化特性

颜色及形状    白色粉末分子式和分子量HPLC-ESI-MSHRESI-MS(m/z)Found：Calcd：UVλ_max^MeOHnm(ε)IRυ_max(KBr)cm^-1R_f值溶解性    C₁₉H₁₈O₆ MW＝342    [M-H]^-＝341    341.1029[M-H]^-    341.1031    202(17，995)，230(35，263)，345(6，005)    3436，2926，2860，1646，1577，1455，1340    0.35  氯仿∶甲醇＝9∶1    易溶于甲醇，乙酸乙酯，DMSO；微溶于水，氯仿

本发明根据高分辨质谱HR-ESI-MS(图3)，同时结合¹H-NMR(图4)、¹³C-NMR(图6)和DEPT(图7)谱，确定了Chemomicin B的分子式为C₁₉H₁₈O₆，不饱和度N＝11。通过对¹H-NMR(图4)、¹³C-NMR(图6)，DEPT谱(图7)及HSQC(图9)谱的综合分析，ChemomicinB的19个碳信号中有3个羰基信号，8个芳香碳或烯碳信号(其中包括4个次甲基碳，2个季碳，2个含有羟基或羟甲基取代的季碳)，1个含羟基取代的季碳信号，另外还有3个次甲基信号，4个亚甲基信号(其中1个有羟基取代)。3个羟基质子信号，化学位移分别为δ11.83(形成氢键的酚羟基质子)，5.26(2个羟基质子)，当加入D₂O交换以后这3个质子信号消失。

根据IR谱(图2)，在3436cm^-1有羟基信号，在1646cm^-1附近有羰基信号，这与¹³C-NMR谱(图6)中的低场羰基信号δ204.1(C-1)，197.0(C-7)，195.1(C-12)相吻合。根据¹H-NMR谱(图4)中化学位移在7.0～8.0ppm之间的ABX偶合体系，同时结合HSQC谱(图9)和¹H-¹HCOSY谱(图8)可以确定，C-9，C-10，C-11位上的质子化学位移分别为δ7.29，7.74，7.55，碳化学位移分别为δ122.7，136.5，117.6。根据HMBC谱(图10)的远程偶合关系，可以确定C-7a，C-8，C-11a，C-12的位置及化学位移值，由于8-OH质子与7-羰基形成分子内氢键，从而导致7-羰基碳的化学位移向低场位移至δ197.0，可以确定C-7的位置。由于C-8位有-OH取代，化学位移向低场位移至159.8。

根据¹H-NMR谱(图4)、¹H-¹HCOSY谱(图8)和HSQC谱(图9)的分析，可以确定另外两大结构片段(如下图片段I和II)。根据HMBC谱(图10)的远程偶合关系，次甲基质子δ3.37(H-12a)与化学位移δ197.0(C-7)、δ195.1(C-12)、δ44.9(C-6a)、δ55.8(C-12b)存在远程偶合，次甲基质子δ3.55(H-12b)与δ71.2(C-4a)，δ55.8(C-12a)，δ44.9(C-6a)存在远程偶合，可以确定C-12a和C-12b位置，这样可以把结构片段I跟C环连接起来。根据UV谱(图1)，230nm附近的强吸收峰符合α、β不饱和酮的计算值，推测结构片段II与羰基相连接，这样确定C-1为羰基。质子δ1.45(H-5)与δ20.4(C-6)，δ44.9(C-6a)，δ55.8(C-12b)，δ71.2(C-4a)存在远程偶合，δ2.28(4-H)与δ120.1(C-2)，δ164.2(C-3)，δ71.2(C-4a)，δ31.1(C-5)，δ55.8(C-12b)，δ63.1(C-13)有远程偶合，可以推导出结构片段I和II是通过C-4a和C-12b这两个碳连接起来的，确定了C-4a的位置，这样把A环和B环连接起来。经过与Kanglemycin C的文献资料比较，同时结合如下图所示HMBC的研究，确定卡莫霉素B的结构如式(1)所示。

卡莫霉素B在DMSO-d₆中的NMR数据如表2所示。

表2.卡莫霉素B在DMSO-d₆I中的NMR数据

Position  δ_c^a  δ_H^b(mult，J HZ) ¹H-¹H COSYHMBC1234 4a-OH5 6 6a77a8-OH9101111a1212a12b13-CH₂  13-OH  204.1  120.1  164.2  41.6   71.2  31.1   20.4   44.9  197.0  118.2  159.8  122.7  136.5  117.6  134.9  195.1  43.7  55.8  63.1     5.91(s)   2.28(d，18.0)  2.69(dd，2.5，18.0)  5.26(s)  1.45(m)  1.45(m)  1.99(dd，13.0，3.0)  1.80(m)  2.93(ddd，3.5，3.5，3.0)    11.83(s)  7.29(d，8.5)  7.74(t，7.5，8.0)  7.55(d，7.5)    3.37(dd，3.0，3.0)  3.55(s)  4.06(d，5.0)  4.08(d，5.0)  5.26(s)   4H，13H   4H  2H，4H，13H  13H  6H，12bH  6H，12bH  5H，  5H，6aH  6H，12aH，     10H  9H，11H  10H    6aH，12bH  5H，12aH  2H，13OH，4H  2H，13OH，4H  13H 4，12b，13 2，3，4a，5，12b，132，3，4a，54a，5，12b4a，6，6a，12b4a，6，6a，12b4a，12a 1，6，12a  7a，8，97a，8，118，11，11a7a，9，12  6a，7，12，12b4a，5，6a，7，12a2，32，3 

¹H-NMR(500 M HZ，δin ppm，J in HZ)，¹³C-NMR(125MHZ，δin ppm)

卡莫霉素C的理化特性见3。本发明根据UV(图11)、IR(图12)、高分辨质谱HR-ESI-MS(图13)，同时结合¹H-NMR(图15和图14)、¹³C-NMR(图16)和DEPT(图17)谱，确定了Chemomicin C的分子式为C₁₉H₁₆O₆，不饱和度N＝12。通过对¹H-NMR(图14和图15)、¹³C-NMR(图16)，DEPT谱(图17)及HSQC(图19)谱的综合分析，ChemomicinC的19个碳信号中有3个羰基信号，10个芳香碳或烯碳信号(其中包括4个次甲基碳，4个季碳，2个含有羟基或羟甲基取代的季碳)，1个有羟基取代的季碳信号，另外还有1个次甲基信号，4个亚甲基信号(其中1个有羟基取代)。根据¹H-NMR谱，溶剂为DMSO-d₆(图14)，可以观察到3个羟基质子信号，化学位移分别为δ11.91(形成氢键的酚羟基质子)，5.24(2个羟基质子)，在溶剂为CD₃OD时(图15)，这3个质子信号消失。

表3.卡莫霉素C的理化特性

颜色及形状  红色颗粒状结晶分子式和分子量HPLC-ESI-MSHRESI-MS(m/z)Found：Calcd：UVλ_max^MeOH nm(ε)IRυ_max(KBr)cm^-1R_f值溶解性  C₁₉H₁₆O₆ MW＝340  [M+Na]⁺＝363[2M+Na⁺]＝703  341.10248[M+H]⁺  341.10196  417(4，614)，267(12，182)，230(28，710)，212(35，535)  3383，2923，2854，1640，1617，1455，1281，1128  0.35    氯仿∶甲醇＝9∶1  易溶于甲醇，乙酸乙酯，DMSO；微溶于水，氯仿

由于Chemomicin C是Chemomicin B在50℃加热后变性降解而来，Chemomicin B脱2个H后变成Chemomicin C。通过与Chemomicin B的DEPT谱(图7)比较，发现在化学位移为40.0～50.0ppm之间少了2个次甲基碳信号，而在140.0～150.0ppm之间多了2个芳香季碳信号，由此提示，所脱的2个H位于2个次甲基碳上，脱H后形成双键。根据¹H-¹HCOSY谱(图18)，推测出所脱的2个H位于C-6a和C-12a上，结合下图所示。HMBC谱(图20)的研究，综合比较Chemomicin B与Chemomicin C的光谱学数据，确定卡莫霉素C的结构如式(2)所示。

卡莫霉素C在CD₃ODI和DMSO-d₆ II中的NMR数据如表4所示。

表4.卡莫霉素C在CD₃OD(I)和DMSO-d₆(II)中的NMR数据

Position(I)            (II)                                             (I)δ_c^a δ_H^b(mult，J Hz)δ_H^b(mult，J Hz)¹H-¹H COSYHMBC1234 4a-OH5 6 6a77a8-OH9101111a1212a12b13-CH₂ 13-OH198.5121.1164.942.0 71.028.7 21.1 144.9190.8116.0162.3124.6137.2119.9133.5184.5143.153.564.7     5.91(s)   2.81(d，18.0)  2.41(d，18.0)  5.24(s)  1.63(m)  1.63(m)  2.61(m)  2.61(m)     11.91(brs)  7.32(d，9.0)  7.74(t，7.5，8.0)  7.56(d，6.5)     4.03(s)  4.11(s)  4.11(s)  5.24(s) 6.0(s) 2.82(dd，18.0，2.5)2.45(d，18.0) 1.68(m)1.77(m)2.67(m)2.67(m)    7.20(d，8.0)7.62(t，8.0，8.0)7.57(d，8.0)   4.11(s)4.17(s)4.17(s)  4H，13H 2H，13H  6H6H5H，6H5H，6H    10H9H，11H10H      2H，4H，13H2H，4H，13H  4，12b，13 1，2，3，4a，51，2，3，4a，5，12a，12b，13 4a，6，6a，1 2b4a，6，6a1，4a，5，7，6a，12a1，4a，5，7，6a，12a    7a，8，118，11a7a，9，12   1，4a，5，6a，12，12a2，3，42，3，4 

¹H-NMR(500MHz，δin ppm，J in Hz)，¹³C-NMR(125MHz，δin ppm)

卡莫霉素D的理化特性见表5。本发明根据UV(图21)、IR(图22)、高分辨质谱HR-ESI-MS(图23)，同时结合¹H-NMR(图24)、¹³C-NMR(图25)及DEPT(图26)谱，确定了Chemomicin D的分子式为C₁₉H₁₄O₅，计算得到其不饱和度N＝13。通过对¹H-NMR(图24)、¹³C-NMR(图25)、DEPT谱(图26)及HSQC(图28)谱的综合分析，ChemomicinD的19个碳信号中有2个低场的羰基信号，14个芳香碳信号(其中包括5个次甲基碳，6个季碳，3个含有羟基或羟甲基的季碳)，3个亚甲基信号(其中1个有羟基取代)。

表5.卡莫霉素D的理化特性

颜色及形状  棕褐色粉末分子式和分子量HPLC-ESI-MSHRESI-MS(m/z)Found：Calcd：UVλ_max^MeOHnm(ε)IRυ_max(KBr)cm^-1R_f值溶解性  C₁₉H₁₄O₅ MW＝322  [M+Na]⁺＝345[2M+Na]⁺＝667  323.09130[M+H]⁺  323.09140  210(23，847)，266(10，783)，446(4，258)  3262，2923，2853，1613，1456，1255  0.55    氯仿∶甲醇＝9∶1  易溶于甲醇，乙酸乙酯，氯仿，DMSO；微溶于水

由于Chemomicin D是Chemomicin C在50℃加热后变性降解而来，Chemomicin C脱水后变成Chemomicin D。根据¹³C-NMR谱(图25)和DEPT谱(图26)，同时与ChemomicinC的光谱学数据进行比较，发现少了1个位于低场δ190.0～200.0ppm的羰基碳信号，1个位于δ40.0～50.0ppm的亚甲基信号，1个位于δ50.0～60.0ppm的次甲基信和1个位于δ60.0～80.0ppm的有羟基取代的季碳信号，而在δ110.0～160.0ppm多增加了4个芳香碳信号。在¹H-NMR谱(图24)中，δ6.74(H-2，H-4)出现了2个芳香质子信号，δ6.0附近的烯碳质子信号消失。由此可以确定，4a-与12b-之间脱水后，A环形成一个芳香环。与ChemomicinC的化学结构比较，C-1的羰基变成-OH取代，C-4亚甲基变成芳香次甲基，结合下图所示¹H-¹HCOSY谱(图27)和HMBC谱(图29)和，确定卡莫霉素D的结构如式(3)所示。

卡莫霉素D在CD₃OD中的NMR数据如表6所示。

表6.卡莫霉素D在CD₃OD中的NMR数据

Position  δ_c^aδ_H^b(mult，J Hz)    ¹H-¹H COSY  HMBC12344a5 6 6a77a8-OH9101111a1212a12b13-CH₂   156.9  114.7  147.1  118.2  142.8  29.3   21.6   145.7  189.8  115.9  162.1  124.4  137.2  119.9  135.3  185.2  145.3  117.8  64.6    6.74(s)   6.74(s)   2.65(m)  2.68(m)  2.65(m)  2.68(m)      7.1 8(d，8.5)  7.60(t，8.0，7.5)  7.50(d，7.0)      4.50(m)  4.50(m)     13H     13H     6H    6H    5H    5H        10H，11H    9H，11H    9H，10H        2H，4H    2H，4H   1，4，12b   2，12b   4，6a，12b  4，6a，12b  4a，6a，7a  4a，6a，7a      7a，8，11  8，11a  7a，9，12      2，3，4  2，3，4

¹H-NMR(500MHz，δinppm，J in Hz)，¹³C-NMR(125MHz，δin ppm)

实施例5：卡莫霉素B、C、D的生物学活性实验

采用MTT法进行体外抗肿瘤活性试验，选用的细胞株为人食道癌细胞KYSE150。具体操作步骤是，将以上实施例所得卡莫霉素B、C、D分别溶解在DMSO中，浓度范围为0.08ug/ml-10.0ug/ml，将处于对数生长期的人食道癌细胞KYSE150经0.125％的胰酶消化，用RPMI 1640培养液稀释细胞至5000个/孔。肿瘤细胞中加入待测样品，37℃，5％的CO₂培养3天，每孔加入MTT 20ul，37℃继续培养4小时，吸出孔内100ul培养液后，加入10％酸化SDS液(100ul/孔)，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。在酶标仪检测各孔吸光度值(OD值，检测波长570纳米)。实验结果表明，卡莫霉素B、C、D对人食道癌细胞KYSE150的IC₅₀分别为0.49ug/ml、0.76ug/ml、0.33ug/ml，均显示出很强的抑瘤活性，不同药物浓度对人食道癌细胞KYSE150的抑制率如表7所示。

表7.不同浓度卡莫霉素B、C、D对人食道癌细胞KYSE150的抑制率

    药品浓度(ug/mL)    Chemomicin B    抑制率(％)    Chemomicin C    抑制率(％)    Chemomicin D    抑制率(％)    10    99.4    98.9    98.6    5    99.6    99.1    99.0    2.5    99.0    98.8    98.7    1.25    98.6    98.1    98.4    0.63    66.1    31.8    58.2    0.31    18.3    0    48.5    0.16    4.8    0    9.3    0.08    0    0    1.2