公开/公告号CN101048170A
专利类型发明专利
公开/公告日2007-10-03
原文格式PDF
申请/专利权人 生物合成实验室有限公司;圣保罗国情研究援助基金会;亚拉·屈里;
申请/专利号CN200580021319.1
申请日2005-05-06
分类号
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人李瑛
地址 巴西圣保罗
入库时间 2023-12-17 19:11:48
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2011-04-13
授权
授权
2007-11-28
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-10-03
公开
公开
技术领域：
本发明涉及引起痛觉丧失或在哺乳动物内作用于阿片样物质受体的化合物。更具体而言，本发明涉及来自Crotalus durissusterrificus蛇毒并且具有止痛作用的肽的类似化合物、它们的用途、药物组合物以及制备和纯化方法。
背景技术：
根据来自Sociedade Brasileira para o Estudo da Dor[巴西疼痛研究学会](SBED，2004 http://www.dor.org.br/dor_impactos.asp)的资料，至少有30％的个体在其一生中的某些时刻会受到疼痛的侵袭，而且这些个体中有10％至40％的人疼痛持续一天以上。疼痛是病痛、丧失工作能力的主要原因，并且它引起了严重的社会心理学和经济学后果。这些个体中大约有40％的人有许多天不能工作。尽管没有有关巴西人口中疼痛病症影响的官方统计，但它们的出现在近些年确实存在上升的趋势。此外，世界范围内慢性疼痛的发生率在人口的7％至40％之间浮动。结果，遭受慢性疼痛折磨的那些人群中有50％至60％的个体变得部分或完全、暂时或永久性的丧失劳动能力，显著影响了生活质量。
有关在人类中观察到蛇毒的治疗效用可以回溯到20世纪初(Brasil，V.Biol.Med.So Paulo，1：7-21，1934，Brazil，V.An.Paul.Med.Cir.，60：398-408，1950；Klobusitzky D.Anais doInstituto Pinheiros，1：3-23，1938)，而且文献介绍了利用这些蛇毒作为治疗剂的重要综述。这些综述描述了，例如，利用Crotalusadamanteus的蛇毒治疗癫痫症以及利用来自Agkistrodonpiscivorus，Vipera ruselli和Notechis scutatus的蛇毒作为止血剂(Klobusitzky，D.Anais do Instituto Pinheiros，1：3-23，1938)。
有关在人类中观察到蛇毒的止痛特性的报道可以回溯到30年代初(Monaelesser & Taguet，1933，a pud on Brazil，V.An.Paul.Med.Cir.，6O：398-408，1950)。就南美响尾蛇(Crotalus durissusterrificus)蛇毒(下文称为”CdtV”)的止痛作用而言，最初的研究工作是由Vital Brazil博士进行的。在这些研究中，Vital Brazil博士制备了高度稀释的响尾蛇蛇毒溶液，命名为响尾蛇溶解物。所述的响尾蛇溶液被分发给巴西和国外的几名医师并用于治疗不同的疼痛病症和不适，主要是肿瘤来源的疼痛。该研究的结果证明了响尾蛇的蛇毒在不同疼痛综合症的治疗中非常有效(Brazil，V.Biol.Med.Paulo，1：7-21，1934，Brazil，V.An.Paul.Med.Cir.，60：398-4O8，1950)。
关于蛇毒来源产物在治疗引起疼痛的疾病中的用途，InstituteButantan研究所通过将这些蛇毒与甲醛的混合对所谓减毒毒液产品的开发是值得强调的。这些产品预计用于治疗不同的疼痛性疾病，尤其是在通常的止痛剂无效的情况下。由于此产品可取代吗啡用于治疗，所以此产品被证实具有强止痛效用。减毒毒液还被证实具有持久的止痛效果，因为患者在接受减毒毒液治疗时通常在两次给药之间间隔1至3天。
尽管Vital Brazil博士所观察到的结果显示了Crotalusdurissus terrificus蛇毒的止痛作用，但天然蛇毒中存在的导致止痛效果的活性物质仍然是未知的。
利用疼痛评估的实验模型进行此蛇毒止痛作用机制的研究始于1990年。
当用热板试验进行评估时，这些研究显示出施用于小鼠中的CdtV诱发了持久的抗疼痛效果，表明此蛇毒通过作用于中枢神经系统能引起痛觉丧失(Giorgi R.等，Toxicon，31：1257-65，1993；Picolo G.等Toxicon 36：223-227，1998)。药理学研究显示在热板试验中所观察到的抗疼痛作用中涉及κ阿片样物质受体(Giorgi R.等，Toxicon，31：1257-65，1993；Brigatte P.等Toxicon 39：1399-1410，2001)。长期利用蛇毒进行治疗在热板试验中引起了对抗疼痛作用的耐受性，但不是驱体依赖。耐受性是通过药效机制介导的。未观察到与吗啡的交叉耐受性(Brigatte P.等Toxicon 39：1399-1410，2001)。另一方面，由于所述蛇毒的持久抗疼痛作用(单次用药5天后)，在开始治疗后长达65天内，如果每隔5天施用一次所述蛇毒则不显现出耐受现象(Brigatte P.等，Toxicon 39：1399-1410，2001)。
除了在热板试验中观察到的效果之外，在两个炎性疼痛的实验模型中证实了天然蛇毒的止痛作用：在乙酸诱发的腹部扭曲(abdominalcontortions)模型中(Giorgi R.等，Toxicon，31：1257-65，1993)和角叉菜胶诱发的痛觉过敏模型中(Picolo G.et al.，Eur JPharmacol 391：55-62，2000)。在角叉菜胶模型中，蛇毒的止痛效果也是长效的，在施用单剂所述蛇毒后效果持续至多达5天。此效果涉及外周δ阿片样物质受体的参与(Picolo G.等.，Eur J Pharmacol391：55-62，2000)。
另一方面，在前列腺素所诱导的痛觉过敏模型中，响尾蛇蛇毒的抗疼痛作用是由κ和δ阿片样物质受体介导的(Picolo G.等，Eur JPharmacol 469：57-64，2003)。在两个痛觉过敏模型中(角叉菜胶和前列腺素)，CdtV所诱导的抗疼痛作用还涉及L-精氨酸/一氧化氮(NO)/cGMP途径的激活、cGMP-依赖性蛋白激酶的激活以及ATP-敏感性钾通道的活化(Picolo G.等Eur J Pharmacol 469：57-64，2003，Picolo和Cury，Life Science 75：559-73，2004)。
应重点强调的是所述蛇毒还能在持续疼痛的模型中诱发抗疼痛作用，如在大鼠坐骨神经慢性收缩引起的神经性疼痛模型中(Gutierrez，V.P.，Chacur，M.，Sampaio，S.C.，Picolo，G.，Cury，Y.Memórias do Instituto Butantan vol.60，p.50，2003)和在大鼠足底内注射Walker 256癌细胞引起的癌症疼痛模型中(Brigatte，P.，Sampaio S.C.，Gutierrez，V.，Curi，R.Rangel-Santos，A.C.，Guerra，J.L.，Cury Y.，XXXVI Congresso Brasileiro deFarmacologia e Terapêutica Experimental，Programa e Resumos，p.195，2004)。神经性疼痛模型中的蛇毒作用效果也是长期的，因为在施用单剂量蛇毒后长达3天时间都能检测到此效果。正如在角叉菜胶或前列腺素所诱导的痛觉过敏模型中所观察到的，κ和δ阿片样物质受体、L-精氨酸/NO/cGMP途径以及ATP-敏感型钾通道的开放是造成此模型中蛇毒产生效果的原因(Gutierrez，V.P.，Chacur，M.，Sampaio，S.C.，Picolo，G.，Cury，Y.Memórias do InstitutoButantan，vol.60，p.50，2003)。
蛇的毒液是由蛋白质和生物学活性肽的复杂混合物组成的。从这些蛇毒中已分离了几种具有不同治疗指征的活性物质。例如，我们拥有专利US5182260(Maraganore，J.H.，1993)，其中从南美水腹蛇(Water Moccasin)蛇毒中分离了血小板活化的多肽抑制剂；或者专利US5763403(Lyan，E.C.Y.，1998)，其中从Agkistrodon halysbrevicaudus蛇的毒液中获取了狼疮抗凝蛋白；或者专利US6489451(Li，B.X.，2002)，其中从白花蛇(Agkistrodon acutus)的毒液中纯化出抗血栓形成酶。关于疼痛治疗中所用的产物，美国专利US6555109(Shulov，A.，2003)描述了一种分离自Vipera xanthinapalestinae蛇毒液的非毒性片断，及其用于控制包括慢性疼痛在内的不同类型疼痛的衍生产物。此外，美国专利US6613745(Gopalakrishnakone，P.，2003)介绍了所具有的氨基酸序列来自或基于眼镜王蛇(Ophiophagus hannah)蛇毒中存在的止痛因子氨基酸序列的肽。
一种存在于Crotalus durissus terrificus蛇毒液中的毒素-响尾蛇胺的止痛活性也可在文献中找到。研究证实，当通过皮下或腹膜内途径给小鼠注射纯化的响尾蛇胺时，存在止痛的剂量-反应关系。止痛作用受纳洛酮抑制，表明其中涉及了阿片样物质受体(Mancin C.A.等，Toxin 36：12，1927-1937，1998)。
鸦片及其衍生产物是有效的止痛剂，它们还具有其它的药理学效应。内源和外源的阿片样物质是用于控制疼痛，特别是慢性或难治的疼痛的最常用的止痛剂之一，例如，用于控制癌症疼痛、神经性疼痛和慢性炎症疼痛。这些药物，通过作用于特异的受体，在人类和动物中引起了痛觉丧失，改变了对有害化学、机械或热刺激的病理生理学响应(Yaksh，T.L.Acta Anaesth.Scand.41：94-111，1997)。
至少有三个不同的内源性阿片样物质肽家族被确定：脑啡肽、内啡肽和强啡肽。各家族来自独特的多肽前体并且具有特有的解剖学分布。这些前体被命名为前脑啡肽、阿片-促黑素细胞皮质素原和强啡肽原，具有Tyr-Gly-Gly-Phe-Met/Leu氨基酸序列(其中Tyr、Gly、Phe、Met和Leu分别对应于酪氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸)，位于阿片样物质肽的N末端部分(Przewlocki R.和Przewlocka B.Eur.J.Pha rmacol.429：79-91，2001，Reisine T.和Pasternak，G.In：The Pharmacolcogical Basis of Therapeutics，Hardman J.G.e Limbird L.E.eds，9th ed，New York，McGraw-Hill，pp.521-555，1996)。
阿片样物质通过作用于传入神经末梢，抑制腺苷酰环化酶，减少了cAMP的产生(Schultz，J.E.J.和Gross，G.J.Pharmacol.Ther.，89：123-137，2001)并抑制了钙通道的开放，从而阻断了神经递质的释放(Junien，J.L.和Wettstein，J.G.Life Science，51：2009-18，1992；Zaki，P.A.等Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，36：379-401，1996；Yak sh，T.L.Acta Anaesth.Scand.41：94-111，1997)。
此外，阿片样物质激活了L-精氨酸-一氧化氮-cGMP途径，引起钾通道开放，随后细胞膜超极化(Ferreira，S.H.等，Eur.J.Pha rmacol.，1217：225-7，1991；Ferreira，S.H.等Br.J.Pharmacol.，114：303-8，1995；Nozaki-Taguchi，N.和Yamamoto，T.Anesth.Anal.，87：388-93，1998；Amarante，L.H and Duarte，I.D.Eur JPharmacol.，454：19-23，2002)。阿片样物质激动剂对K+通道的抗疼痛效应涉及ATP敏感性和电压依赖性K+通道(Welch，S.和Dunlow，L.D.J.Pharmacol.Exp.Ther.，267：390-399，1993；Rodrigues，A.R A.和Duarte I.D.G.Br.J.Pharmacol，129：110-114，2000；Schultz，J.E.J.和Gross，G.J.Pharmacol.Ther.，89：123-137，2001)。
此外，几项研究已显示包括κ阿片样物质激动剂在内的阿片样物质止痛剂影响了分裂素激活的蛋白激酶(MAPK)(Li，J.G.等，J.Biol.Chem.，274：12087-12094，1999；Eitan，S.等，J.Neuroscience，23：8360-8369，2003；Lesscher，H.M.B.等，Neuroscience，116：139-144，2003)。
除了存在多种呈现阿片样物质活性的肽之外，多种阿片样物质受体的存在也是药理学上得到表征的。因此，研究者认为阿片样物质止痛剂通过与特异的受体相互作用发挥效用，所述受体由至少3个主要的种类组成：μ(mu)、κ(kappa)和δ(delta)(Yaksh，T.L.Eur.J.Anaesthesiol.1：201-243，1984)，分布于中枢神经系统和外周组织，具有独特的药理学活性、解剖学分布和功能(Junien，J.L.和Wettstein，J.G.Life Science，51：2009-2018，1992；Yaksh，T.L.Acta Anaesth.Scand.41：94-111，1997)。
阿片样物质的中枢和外周作用是它们治疗效用的重要组成部分。μ受体是造成阿片样物质的大部分止痛作用以及它们的某些不良影响的原因，诸如呼吸和心血管抑制、欣快症、依赖性、镇静和几种神经内分泌功能的改变[Brownstein，M.J.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，90：5391-5393，1993]。
这些二次效应主要作为这些激动剂在中枢神经系统中作用的后果发生。这是疼痛控制中阿片样物质止痛剂使用不当的主要原因。δ阿片样物质受体可能在外围更重要，尽管它们也引起中枢的痛觉丧失。除了痛觉丧失之外，这些受体调制胃肠运动性和几种激素功能。另一方面，κ阿片样物质受体诱发痛觉丧失而不引起μ受体所特有的不良影响，诸如便秘、发痒、呼吸抑制、驱体依赖和/或成瘾。不过，κ受体保持某些中枢介导的作用，诸如镇静和烦躁不安，但不涉及驱体依赖(Vanvoigtlander等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，224：7-12，1983；Wood，P.L.和Iyengar，S.In：The opioid receptors.Pasternak，G.W.ed.Humana press，Clifion，N.Y.，1988)。这些受体负责平衡液体吸取、食物摄取、肠运动性、温度控制和几种内分泌功能(Leander，J.Pharmacol.Exp.Ther.，227：35-41，1983；Leander等，J.Pharmacol.Exp.Ther.234，463-469，1985；Morley等.，Peptides 4，797-800，1983；Manzanares等，Neuroendocrinology52，200-205，1990；Iyengar等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，238，429-436，1986)。
吗啡和可待因是临床上最常用的阿片样物质止痛剂，被用作μ阿片样物质受体的激动剂。这些阿片样物质造成了众所周知的不合需要的不良影响，例如，驱体依赖的产生。κ或δ受体激动剂分别通过作用于κ和δ阿片样物质受体达到止痛效果。这些激动剂超过例如吗啡等典型μ受体激动剂的优势在于它们能够造成痛觉丧失但不引起不合需要的针对吗啡所描述的二次行为效应。已知阿片样物质受体与其配体之间的结构关系是造成所述受体选择性和特异性的原因。不过，有几项研究表明阿片样物质受体与几个膜区室的特异相互作用可有助于这些阿片样物质选择性的与特异受体相互作用的能力(Janecka A.等Mini Rev Med Chem.2：565-572，2002；Naito A.和Nishimura K.CurrTop Med Chem.4：135-145，2004；Singh VK等Neuroimmunomodulation.4：285-297，1997)。本发明涉及与脑啡肽、内啡肽或强啡肽不同源的新肽，还涉及对κ阿片样物质受体具有优先活性的合成肽。
通过文献已知当阿片样物质针对特异类型或亚型受体的特异性和选择性提高时，用于治疗目的的阿片样物质发生副作用的概率会下降。那些与κ和/或δ阿片样物质受体具有亲和力的激动剂已被证实具有强止痛活性，而不出现严重的不良反应，诸如驱体依赖、呼吸抑制和平滑肌组织运动抑制等吗啡和μ受体激动剂衍生物通常观察到的效应(Nagase，H.；Kawai，K.；Kawamura，K.；Hayakawa，J.；Endoh，T.；patent US6323212，2001)。阿片样物质引起的诸如驱体依赖和呼吸抑制等副作用是与这些药物对中枢神经系统的作用相关的。类似吗啡、纳洛酮、羟甲左吗南、脑啡肽、内啡肽和强啡肽及类似物等传统的阿片样物质通常是疏水分子。因此，这些阿片样物质能透过诸如血脑屏障等膜，很容易积聚在脂肪组织和器官内。此渗透性还与中枢神经系统中的副作用相关，诸如欣快症和成瘾。此外，这些肽必须以高剂量施用，这样就会引起与长期接触阿片样物质有关的毒性反应(专利US5602100；Brown，W.L.，1997)。在本领域中找到的某些专利建议联合使用多种拮抗剂和激动剂，制剂形式或非制剂形式的，作为抗疼痛和抗炎制剂。这些研究建议利用在不同的疼痛途径和/或发炎机制中具有伴随作用的药物组合物干扰这两种过程(疼痛和发炎)的起因，例如，在诸如口腔和/或牙齿处置等外科手术过程中使用。这些制剂可以是5HT-2受体拮抗剂、5HT-3受体拮抗剂、组胺拮抗剂、五羟色胺激动剂、环加氧酶抑制剂、神经激肽1受体拮抗剂、神经激肽2受体拮抗剂、嘌呤受体拮抗剂、钙通道拮抗剂、缓激肽B1受体拮抗剂、缓激肽B2受体拮抗剂和μ阿片样物质受体激动剂。此外，在这些专利(专利US6420432；Demopulos，G.，2002；US2003096807 A1；Demopulos，G.，2003)中还介绍了所述的联合使用药物治疗软骨损伤。
在本领域中可发现许多有关阿片样物质肽、阿片样物质受体和阿片样物质受体激动剂和拮抗剂的分子药理学和遗传操作的工作。这些研究覆盖了阿片样物质的生化和分子效应、内源阿片样物质神经化学定位以及它们与行为相关的受体。此外，对这些阿片样物质与痛觉丧失和疼痛、压力、耐受性和依赖性、学习和记忆、酒精和药物滥用、性活动和激素活性、怀孕和内分泌变化、一般的脑活动和运动力、神经系统障碍、胃肠、肾和肝功能以及心血管响应的关系也进行了研究(Bodnar，R和Hadjimarkou，Peptides，24，1241-1302，2003)。
在专利US5866346(Yu.L.，1999)中，Lei Yu介绍了利用强啡肽作为XOR1受体的配体的方法。因此，优选作为κ阿片样物质受体激动剂的化合物可以是XOR1受体的配体。
尽管文献中已描述了蛇毒以及作用于阿片样物质受体的肽的用途，但以纯化形式包括口服途径在内施用时，存在于Crotalusdurissus terrificus蛇毒中的活性止痛物质的特性或其效能仍然是未确定的。这些资料同样并未解释所述活性物质的化合物类似物的效能以及它们对阿片样物质受体的特异作用。
发明内容：
本发明基于Crotalus durissus terrificus蛇毒液中存在的活性止痛物质的发现及表征。它还确认了所述物质在以纯化形式施用、包括口服途径施用时的止痛作用。本发明还基于Crotalus durissusterrificus蛇毒中存在的活性物质的类似化合物具有止痛效力的事实，以及基于所述化合物对阿片样物质受体发挥作用的事实。
就第一个主要的独立方面而言，本发明涉及存在于Crotalusdurissus terrificus蛇毒液中的止痛物质的新类似化合物，它们具有酷似结构如下化合物的药理学特性：
Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys(SEQID NO：1)
其中：
Xaa通常是焦谷氨酸，
R1＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr，
R2＝Pro或Arg，
R3＝Glx或Asx或Gly，
R4＝Asn或Gln或Leu，
R5＝Glx或Asx，
R6＝Glx或Lys，
它们的盐、溶剂化物或类似化合物，除了当所述的化合物是十四肽，其中的R1＝Phe，R2＝Pro，R3＝Glu，R4＝Asn，R5＝Glu以及R6＝Gln时，第7位和第14位的半胱氨酸残基由分子内二硫桥连接(SEQ ID NO：2)。
更具体而言，本发明涉及相应于SEQ ID NO：1的化合物，其特征在于第7位和第14位的半胱氨酸残基由分子内二硫桥连接(SEQ ID NO：4)；尤其是具有氨基酸序列Xaa-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys的十四肽的类似化合物，其中Xaa是焦谷氨酸，且第7位和第14位的半胱氨酸残基由分子内二硫桥相连(SEQ ID NO：2)；例如呈现肽序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：4的十四肽。
依照本发明，“类似化合物”的概念适用于具有部分化学结构呈现(即使是部分)序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4肽的与其止痛作用相关的药理学特性或者其与阿片样物质受体直接或间接相互作用(激动剂或拮抗剂)的化合物。
作为补充的方面，本发明还包括模拟包含SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO 4的肽的药理学特性的化合物，其特征在于增加、删除或改变模拟肽性质以调节它们的药物动力学和药效学特性，包括用一个或多个L型氨基酸替代D型氨基酸或非常规氨基酸，或者甚至在第4位出现脯氨酸残基或在第5或第10位出现γ-羧化的谷氨酸残基。D型氨基酸和非常规氨基酸的例子在文献中有所描述(不局限于此)，例如，在专利US6613745(新加坡国立大学，2003)或书籍“A Textbook of Drug Design and Development”，第二版，Harwood Academic Publishers，Singapore中。
作为另一补充方面，本发明包括呈现序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的肽的类似化合物，其特征在于被纯化或是纯化形式的。
依照本发明，术语“纯化的”相当于化合物基本上无细胞成分、蛇毒的其它组分、培养基或所述“化合物”化学合成中所用试剂等其它物质产生的污染物。优选的，“纯化的化合物”在量上大于所述混合物干重的50％，更优选的，它的量大于混合物干重的90％，尤其是大于95％。
作为第二个主要的独立方面，本发明包括药物组合物，其特征在于含有一种或多种药用可接受载体或稀释剂以及包含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的一种或多种化合物，它们的盐、溶剂化物或类似化合物，优选纯化的。
本发明中所包括的药物组合物的例子有，例如，溶液、悬浮液、糊剂、胶囊、凝胶、片剂、粉剂、颗粒剂、亲媒胶体、控释体系、微粒、微球体或毫微球体、脂质体和有机物涂层相关制剂，等等。本发明中涉及的药物组合物的可能性施用途径有：口服、肌肉内、静脉内、皮下、局部、肺部、鼻内、口腔、直肠、舌下、皮内、腹膜内、鞘内等等，以即时的、延时的、延长的或控释的形式。本发明中所涉及的药物形式、载体、稀释剂和施用途径的例子可参阅文献(但不局限于此)，例如，书籍Remington’s Pharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，USA。
作为补充方面，本发明还包括特征在于在同一剂量单位或以试剂盒形式含有一种或多种活性成分的药物组合物，所述的活性成分与呈现序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的肽的类似化合物相关。
作为另一特定的方面，当组合物是液体、半固体或用于重构的干燥形式时，这些组合物中包含水基稀释剂。作为本发明的另一具体方面，所述组合物可用于口服，这种组合物呈现出超过可注射组合物的优势，因为使用这些施用途径能减轻患者痛苦并更具有治疗可接受性。
就第三个主要的独立方面而言，本发明包括使用一种或多种含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的化合物、它们的盐、溶剂化物或类似化合物，优选为纯化的或纯的，用于制备止痛用药物组合物或用于治疗、诊断或预防由阿片样物质受体所调控的疾病。
作为一个特定的方面，本发明包括使用一种或多种含序列SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的化合物、它们的盐、溶剂化物或类似化合物，优选为纯化的或纯的，用于制备具有直接或间接的阿片样物质受体，尤其是κ阿片样物质受体的激动剂或拮抗剂特性的组合物。
作为另一具体方面，本发明包括使用一种或多种含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的化合物、它们的盐、溶剂化物或类似化合物，优选为纯化的或纯的，作为止痛物质，尤其是用于口服药物组合物和/或在使用后长达5天内具有长期止痛效用的化合物。
作为另一具体方面，本发明包括利用一种或多种含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的化合物、它们的盐、溶剂化物或类似化合物，优选已纯化的或纯的，制备组合物用于治疗、诊断或预防急性或慢性疼痛，包括癌症相关性疼痛、神经性疼痛如三叉神经痛、偏头痛、交感神经性营养不良、疱疹后神经痛、幻肢痛、后脑血管意外(中风)、糖尿病神经病变、瘤形成相关性疼痛、纤维肌痛、牙疼、痛经、肾绞痛、月经绞痛或胆绞痛、关节痛、包括类风湿性关节炎或变性关节炎在内的关节炎、眼内高压、关节镜检查后疼痛、妇产科腹腔镜检查后疼痛、经皮肾镜取石术所产生的疼痛、前列腺切除术后后阴部根疼痛、胸廓切开术后疼痛、儿科患者扁桃体切除术后疼痛、子宫切除术后疼痛、剖腹产术后疼痛或烧伤痛、可卡因或阿片样驱体依赖、细胞增殖、小细胞肺癌、抑郁症和精神病、炎症、由于血管发生增加造成的相关疾病、创伤、冠状动脉局部缺血性疾病、帕金森氏症和运动障碍、肝脑病、认知性疾病、阿耳茨海默氏病、由于肝胆汁郁积造成的发痒或多囊卵巢妇女的高胰岛素血症。
就第四个主要的独立方面而言，本发明包括利用含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的一种或多种化合物、它们的盐、溶剂化物或类似化合物(优选为纯化的或纯的)治疗、诊断和预防疼痛性疾病或由阿片样物质受体所介导的疾病的方法。
作为一特定方面，本发明包括利用含序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的一种或多种化合物治疗、诊断和预防由阿片样物质受体所调控的疾病的方法，所述的化合物对于阿片样物质受体，尤其是对κ阿片样物质受体具有直接或间接的激动剂或拮抗剂的特性。
就另一特定方面而言，本发明包括特征在于利用含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的一种或多种化合物，通过口服途径和/或利用在施用后至多达5天内具有持久止痛效果的药物组合物治疗、诊断和预防疼痛性疾病的方法。
就另一特定方面而言，本发明包括利用含序列SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的一种或多种化合物治疗、诊断和预防诸如急性或慢性疼痛等病症的方法，所述疼痛包括癌症疼痛、神经性疼痛如三叉神经痛、偏头痛、交感神经性营养不良、疱疹后神经痛、幻肢痛、后脑血管意外(中风)、糖尿病神经病变、瘤形成相关性疼痛、纤维肌痛、牙疼、痛经、肾绞痛、月经绞痛或胆绞痛、关节痛、包括风湿性关节炎或变性关节炎在内的关节炎、眼内高压、关节镜检查后疼痛、妇产科腹腔镜检查后疼痛、经皮肾镜取石术所产生的疼痛、前列腺切除术后后阴部根疼痛、胸廓切开术后疼痛、儿科患者扁桃体切除术后疼痛、子宫切除术后疼痛、剖腹产术后疼痛或烧伤痛、可卡因或阿片样驱体依赖、细胞增殖、小细胞肺癌、抑郁症和精神病、炎症、由于血管发生增加造成的相关疾病、创伤、冠状动脉局部缺血性疾病、帕金森氏症和运动障碍、肝脑病、认知性疾病、阿耳茨海默氏病、由于肝胆汁郁积造成的发痒或多囊卵巢病妇女的高胰岛素血症。
就第五个主要的独立方面而言，本发明包括含序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的肽的类似化合物、它们的盐、溶剂化物或类似化合物的生产和纯化方法。
作为一个特定方面，本发明包括含序列SEQ ID NO 4的化合物、它们的盐和类似化合物的生产方法，所述的化合物在第7和14位的半胱氨酸残基之间含有一个分子内二硫桥，其特征在于涉及利用酶促试剂或通过氧化剂(诸如碘、空气、氧气或铁氰化钾)的氧化作用氧化第7和第14位巯基的步骤，或者甚至其特征在于涉及其结构中含所述氨基酸序列的化合物的纯化步骤。
其中
R5＝Glx或Asx，
R6＝Glx或Lys
其中半胱氨酸残基由分子内二硫桥联接。
另一特定的方面是，本发明包括含有序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的化合物、它们的盐、溶剂化物或类似化合物的纯化方法，通过利用选择性沉淀和/或色谱法分离纯化合成的、半合成的或生物来源的化合物的混合物来完成，所述的生物来源混合物有例如：Crotalus durissus terrificus蛇的天然毒液或甚至重组微生物的细胞培养物或它们相应的裂解产物。
在选择性沉淀的情况下，使用了溶于乙腈和水混合物中的三氟乙酸溶液，尤其是在大约1∶2比例的乙腈和水的混合物中三氟乙酸的浓度大约为0.1％特别有效。
就色谱分离而言，利用反相HPLC柱并应用具有梯度浓度的流动相，使用溶于乙腈和水的三氟乙酸溶液作为流动相尤其有效。
具有序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4的肽的类似化合物的合成和纯化方法的例子包括，例如(但不局限于)，以下出版物中所描述的：“Amino Acid and PeptideSynthesis”，2nd Edition，Oxford University Press，Bath，GreatBritain；Principles of Biochemistry，3rd Edition，WorthPublishers，USA。
就第六个主要的独立方面而言，本发明包括模拟具有氨基酸序列SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的肽的止痛活性的化合物的鉴定方法。
作为第六个特定方面，本发明包括用于鉴定模拟具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的肽的止痛活性的化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：
a)具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的肽的生物学活性的评估，以测定其止痛活性，
b)测试化合物(对照)的生物学活性评估，以测定止痛活性和
c)将所获得的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的生物学活性的结果与所获得的测试化合物(对照)的结果进行比较。
或者
a)引入已标记的具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的肽使其接触测试样品，
b)将测试化合物加入与已标记的具有氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4的肽接触的测试样品中，和
c)评估已标记的氨基酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：3、SEQ ID NO：4与测试样品之间的肽连接。
模拟肽的止痛活性的化合物的鉴定方法的例子参阅(不局限于)，例如，专利US5877026(Lampe R.A.，1999)。
具体实施方式
通过以下非限制性的实验实施例对本发明进行补充性说明：
实施例1.从Crotalus durissus terrificus的蛇毒中分离和纯化ENPAK-k
将来自Crotalus durissus terrificus蛇的20mg冻干未精制的毒液(由Butantan研究所的爬虫学实验室提供)稀释于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的1.5ml比例为1∶2的乙腈/水溶液中。上清液用Sep-Pak C18(2g，12cc，Millipore)柱分级分离并用不同浓度的乙腈/水(含0.1％的TFA)洗脱。此步骤重复60次并将获自各个乙腈/水浓度级分的收集液冻干。
将获自20％乙腈/水(含0.1％的三氟乙酸-TFA)洗脱的级分溶于水中并加到HPLC反相柱(Shimadzu Co.Ltd.)上，用6mm×150mm的CAPCELL PAK C18柱(Shiseido Co.Ltd.)，洗脱液为线性梯度15％至35％的乙腈/水(含0.1％的TFA)，以1ml/分钟流速在室温下洗脱25分钟。用紫外分光光度仪监测，在215nm波长处收集获自保留时间为10.7分钟的级分。
所获得的级分再次进行HPLC，利用6mm×150mm的CAPCELL PAKC18柱，洗脱液为15％乙腈/水(含0.1％的TFA)的恒溶剂，流速1ml/分钟室温洗脱，用紫外分光光度仪监测，在215nm波长处收集获自保留时间为14分钟的级分。用Ettan MALDI-Tof/Pro(AmershamBiosciences)通过MALDI-TOF质谱测定法证实了所得到的级分具有高纯度，分子离子峰[(M+H)+，单一同位素的]在m/z 1534.6处。将此级分冻干并在本发明中被命名为ENPAK-k。
实施例2.ENPAK-k氨基酸序列的测定
由于N末端封闭，序列不能通过Edman降解获得，所以通过质谱测定法测定所产生肽的氨基酸序列。
最初，将二硫桥还原并烷基化。将得到的纯ENPAK-k试样溶于10μl水中。在此溶液中加入溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中的5mM二硫苏糖醇10μl，将溶液在60℃保温30分钟。冷却至室温后，加入溶于25mM碳酸氢铵缓冲液中的55mM碘乙酰胺溶液10μl，然后室温放置30分钟。此产物的MALDI-TOF MS显示出在m/z1650.7处的分子离子峰[(M+H)+，单一同位素的]，证明了在天然肽中存在二硫桥。
通过ESI串联质谱法用Q-Tof UltimaTM(Micromass)分析还原的烷基化肽。来自m/z 825.90处的双电荷离子[(M+2H)2+，单一同位素的]的串联质谱提供了b和y离子系列，给出了14个假定氨基酸残基的序列，表示为：pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Lys/Gln-Gly-Glu-Ser-Lys/Gln-Pro-Cys，分析用质谱测定法获得的数据，其中pGlu表示焦谷氨酸残基，而Lys/Gln意味着在此位置可能是Lys或Gln。两个Cys残基通过二硫桥相互连接。
这样，就会有4种可能的序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7对应于ENPAK-k。以下是获得的序列：
其中半胱氨酸残基通过分子内二硫桥连接，而由三字母代码表示的氨基酸分别相应于：
pGlu＝焦谷氨酸
Phe＝苯丙氨酸
Ser＝丝氨酸
Pro＝脯氨酸
Glu＝谷氨酸
Asn＝天冬酰胺
Cys＝半胱氨酸
Gln＝谷氨酰胺
Lys＝赖氨酸
Gly＝甘氨酸
当将这些氨基酸序列与保存于Swiss Prot数据库中的已知蛋白质序列进行比较时，显示出肽SEQ ID NO：2与crotapotin的C末端部分的氨基酸序列具有同一性，crotapotin是来自Crotalus durissusterrificus种的蛇毒的响尾蛇毒素的无毒酸性亚基(Faure G，Guillaume JL，Camoin L，Saliou B，Bon C.Biochemistry，1991，13，8074-8083)；除了crotapotin的C末端部分中半胱氨酸残基不象在肽SEQ ID NO：2中那样存在分子内二硫桥之外。
来自Crotalus durissus terrificus种蛇毒的响尾蛇毒素的无毒酸性亚基crotapotin的C末端部分：
pGlu-Phe-Ser-Pro-Glu-Asn-Cys-Gln-Gly-Glu-Ser-Gln-Pro-Cys(SEQ ID NO：8)
实施例3.肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7的合成，作为非限制性的例子
通过Fmoc策略，用H-Cys(Trt)-2-ClTrt树脂作为固相支持物以人工固相肽合成获得肽SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7。
然后通过在室温加入乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷(1∶1∶8)使各个合成的肽从树脂上裂解下来，历时1小时，随后通过TFA/硫苯甲醚/1，2-乙二硫醇(94∶5∶1)溶液在室温作用2小时脱保护。经所述处理后，在TFA溶液中加入乙醚以沉淀所述的肽。用乙醚将沉淀洗3次以获得SH-游离的未精制肽。通过用0.1M的甲醇和碘溶液室温处理30分钟，然后加入0.1M抗坏血酸的水溶液使二硫桥形成。之后，用20×150mm的YMC-Pak ODS(Yamamura Kagaku Co.Ltd.)通过反相HPLC纯化所获取的粗肽，洗脱液为含0.1％TFA的线性梯度15％至35％的乙腈/水，以流速8ml/分钟室温洗脱25分钟。在HPLC和质谱测定中将所产生的合成肽与天然ENPAK-k肽进行比较：
其中的半胱氨酸残基由分子内二硫桥连接，
证明了肽SEQ ID NO：2与天然ENPAK-k相同。更进一步的，肽SEQ ID NO：2显示出与天然ENPAK-k相同的止痛活性。肽SEQ ID NO：3也被证明有止痛活性，而另两种肽(SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7)则在相似的条件下显示出无活性。
基于序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的分子模拟研究，证实了本发明的其它重要序列：
Xaa-R1-Ser-R2-R3-R4-Cys-Glx-Gly-R5-Ser-R6-Pro-Cys(SEQID NO：1)
尤其是
其中
Xaa通常是焦谷氨酸，
R1＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr，
R2＝Pro或Arg，
R3＝Glx或Asx或Gly，
R4＝Asn或Gln或Leu，
R5＝Glx或Asx，
R6＝Glx或Lys。
实施例4.在各纯化阶段的止痛组分的鉴定：大鼠爪压力试验
为了评估动物的疼痛敏感性，使用了由Butantan研究所的Biotério中心提供的重量在170-190g之间的Wistar雄性大鼠。将动物供养在实验室中，使其处于光照和黑暗各12小时的循环，并将温度控制在22±1℃，动物可随意摄取水和食物。所用的方案得到Butantan研究所的学会动物保护委员会(CEUAIB)的认可，方案编号是019/2000。
使用大鼠爪压力试验评估疼痛敏感性(Analgesy-Meter ugoBasile，Italy)，按照Randall & Selitto所述的方法进行(RandallL.O.和Selitto J.J.Arch.Intern.Pharmacodyn.111：209-219，1957)。
在此试验中，将克(g)级别并强度渐增(16g/s)的力持续施加于大鼠后爪之一的背部表面，当动物作出反应“抽回”爪子时此作用力被中断。在此模型中，疼痛阈值表示为引起反应所必需的力(g)。此试验在诱发痛觉过敏之前(初始测量)和之后3小时(最终测量)时进行。
制备前列腺素E2(PGE2)贮液用于诱发痛觉过敏，即，将500μg的PGE2溶于1ml乙醇中。在使用的时候，将此贮液重稀释于无菌盐水中。所用的前列腺素的剂量是100μl盐水中含100ng，通过腹膜内注射途径施用。在注射PGE2后3小时评估痛觉过敏情况。
在每步纯化中，将所获得的物质稀释于11ml体积的盐水中。每只动物接受2ml的此溶液，在临诱发痛觉过敏之前通过口服途径给予。用给予盐水的动物作为对照。
实施例5.分离自Crotalus durissus terrificus蛇毒的天然肽ENPAK-k的抗疼痛作用效力及持续时间的评估
将依照实施例1纯化60mg粗蛇毒分离的天然肽ENPAK-k稀释于33ml体积的盐水中。在临诱发痛觉敏感之前通过口服(p.o.)使每只动物接受2ml此溶液。将口服接受盐水的动物用作对照。
使用大鼠爪压力试验评估疼痛敏感性。疼痛阈值由缩回爪子所必需的力(以克计)表示，在口服天然肽(ENPAK-k)或盐水(对照组)之前(0时间点)和之后3、72和120小时(最终测量)时测定此值。在每次最终测量之前3小时注射用作痛觉过敏剂的前列腺素(100ng/只爪子)。表1给出的数据是每组5只动物的平均值±S.E.M。
表1：分离自Crotalus durissus terrificus蛇毒的天然肽(ENPAK-k)的抗疼痛作用的效力和持续时间
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
IM＝初始测量；FM＝最终测量；g＝以克为单位的重量
此实施例显示了分离自Crotalus durissus terrificus蛇毒的天然肽ENPAK-k的有效性和持久的抗疼痛作用。
实施例6.在作为非限制性例子的前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中合成肽SEQ ID NO：2的止痛活性的剂量-反应曲线
将不同剂量的合成肽SEQ ID NO：2稀释于盐水中并在临诱导痛觉过敏之前通过不同途径给予。将通过同一途径接受盐水的动物用作对照。
通过足底内注射途径(i.pl.)给予100ng/只爪子剂量的前列腺素E2诱导痛觉过敏。在注射PGE2之前(初始测量-IM)和注射之后3小时(最终测量-FM)时评估痛觉过敏情况。
使用大鼠爪压力试验评估疼痛敏感性。疼痛阈值由抽回爪子所必需的力(以克计)表示，在足底内注射前列腺素E2(100ng/条腿)之前(初始测量)和注射之后3小时(最终测量)时测定此值。在痛觉过敏刺激之前通过以下途径和剂量给予合成肽：
A)口服途径，2ml体积，剂量为0.0016；0.008；0.04；0.2；1；5和25μg/kg，在临诱导痛觉过敏之前给予(表2)。
B)足底注射途径，50μl体积，剂量为0.00000256；0.0000128；0.00032和0.0016μg/只爪子，在临诱导痛觉过敏之前给予(表3)。
C)静脉内注射途径，200μl体积，剂量为0.0000128，0.000064，0.00032，0.0016和0.008μg/kg，临诱导痛觉过敏之前给予(表4)。
D)测试一个附加的组，以吗啡作为阳性对照。口服吗啡，剂量为0.004；0.2；1和5μg/kg(表5)。
通过各个途径给予盐水用作所有实验中的对照。
结果分析是比较初始测量和最终测量的平均值，或者在测定时，比较不同实验组获取的平均值。此数据用于确定ED50、ED60和ED90。
在表2、3、4和5中：IM＝初始测量；FM＝最终测量；g＝以克表示的重量；当口服和静脉注射时，肽剂量以μg/kg表示，或者当足底途径给予时，剂量以μg/只爪子表示。数据表示每组5只动物的平均值±S.E.M。
表2.在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中经口服途径给予合成肽SEQ ID NO：2的止痛活性的剂量-反应曲线
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
这些结果显示了在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中口服给予合成肽SEQ ID NO：2的强止痛作用。为了测定50、60和90％的有效剂量，分析数据确定疼痛阈值(痛觉过敏)降低的百分率，比较最终和初始测量值，然后确定痛觉过敏逆转的百分率，比较处理组(肽)和对照组(盐水)。用CurveExpert 1.3程序分析这些数据。结果证明在此例中所述肽的50、60和90％有效剂量分别是0.004146、0.006348和0.02106μg/kg。特别值得注意的是只有0.0016、0.008、0.04和0.2的剂量被用于确定有效剂量。
表3：在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中经足底内注射途径给予合成肽SEQ ID NO：2的止痛活性的剂量-反应曲线
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
这些结果显示了在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中通过足底内注射途径给予合成肽SEQ ID NO：2的强止痛作用。为了测定50、60和90％的有效剂量，分析数据确定疼痛阈值(痛觉过敏)降低的百分率，比较最终和初始测量值，然后确定痛觉过敏逆转的百分率，比较处理组(肽)和对照组(盐水)。用CurveExpert 1.3程序分析这些数据。结果证明在此例中所述肽的50、60和90％有效剂量分别是0.000002327、0.000004904和0.0028758μg/kg。
表4：在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中经静脉内注射途径给予合成肽SEQ ID NO：2的止痛活性的剂量-反应曲线
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
这些结果显示了在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中通过静脉内注射途径给予合成肽SEQ ID NO：2的强止痛作用。为了测定50、60和90％的有效剂量，分析数据确定疼痛阈值(痛觉过敏)降低的百分率，比较最终和初始测量值，然后测定痛觉过敏逆转的百分率，比较处理组(肽)和对照组(盐水)。用CurveExpert 1.3程序分析这些数据。结果证明在此例中所述肽的50、60和90％有效剂量分别是0.0000458、0.0002144和0.002701μg/kg。
表5：在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中经口服途径给予吗啡的止痛活性的剂量-反应曲线
吗啡剂量＝μg/kg
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
这些结果显示了在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中通过口服途径施加吗啡的止痛作用。为了测定50、60和90％的有效剂量，分析数据确定疼痛阈值(痛觉过敏)降低的百分率，比较最终和初始测量值，然后测定痛觉过敏逆转的百分率，比较处理组(肽)和对照组(盐水)。用CurveExpert 1.3程序分析这些数据。结果证明在此例中所述肽的50、60和90％有效剂量分别是0.0551516、0.100504和0.326728μg/kg。
实施例7.在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中合成肽SEQ IDNO：2的抗疼痛作用持续时间的评估
在证明了所述合成肽在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中的抗疼痛作用之后，进一步研究此作用的持续时间。用大鼠爪压力试验评估疼痛敏感性。疼痛阈值由抽回爪子的反应所必需的力(以克计)表示，在口服合成肽(1μg/kg)或盐水(对照组)之前(初始测量)和之后24、48、72、96、120和144小时(最终测量)时测定此值。在每次最终测量前3小时对不同的组给予剂量为100ng/只爪子的PGE2(表6)。
表6：在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中合成肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用的持续时间
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
IM＝初始测量；FM＝最终测量；g＝以克为单位的重量
这些结果表明所述肽的抗疼痛作用在单次给药后长达120小时仍能检测到。
实施例8.在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中阿片样物质受体参与合成肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用的评估
使用大鼠爪压力试验评估疼痛敏感性。疼痛阈值由诱使其抽回爪子所必需的力(以克计)表示，在足底内注射前列腺素E2(100ng/只爪子)之前(初始测量，IM)和之后3小时(最终测量，FM)时测定此值。在临给予痛觉过敏刺激物(PGE2)之前口服合成肽(1μg/kg)或盐水(对照组)。通过足底内注射途径(i.pl.)给予ICI174，864-ICI(10μg/只爪子)、δ阿片样物质受体拮抗剂、nor-Binalthorphimine-BNI(50μg/条腿)、κ阿片样物质受体拮抗剂和CTOP(20μg/条腿)、μ阿片样物质受体拮抗剂，同时伴随着注射PGE2(表7)。数据显示的是每组5只动物的平均值±S.E.M。
此外，在以5μg/kg剂量的所述肽诱发的抗疼痛作用中还检测了κ和δ阿片样物质受体(表8)。数据显示的是每组5只动物的平均值±S.E.M。
表7：在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中阿片样物质受体参与合成肽(1μg/kg)的抗疼痛作用的评估
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
IM＝初始测量；FM＝最终测量；g＝以克为单位的重量
这些数据表明了在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中，κ阿片样物质受体与合成肽SEQ ID NO：2(1μg/kg)的抗疼痛作用有关。
表8：在前列腺素E2-诱导的痛觉过敏模型中阿片样物质受体参与合成肽(5μg/kg)的抗疼痛作用的评估
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
IM＝初始测量；FM＝最终测量；g＝以克为单位的重量
这些数据表明了在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中，甚至在使用高剂量(5μg/kg)合成肽时，κ阿片样物质受体也与合成肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用有关。
实施例9.在作为非限制性例子的角叉菜胶诱导的痛觉过敏模型中合成肽SEQ ID NO：2的止痛活性
在角叉菜胶诱导的炎性痛觉过敏中评估所述合成肽的抗疼痛作用。在角叉菜胶-诱导炎性痛觉过敏(200μg/只爪子)之前(初始测量)和之后3小时(最终测量)时进行大鼠爪压力试验。在临诱导痛觉过敏之前以1μg/kg的剂量经口服途径给予所述的合成肽(2ml)(表9)。将以相同途径给予的盐水用作对照。数据表示每组5只动物的平均值±S.E.M.。
表9：在角叉菜胶诱导的痛觉过敏模型中合成肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
IM＝初始测量；FM＝最终测量；g＝以克为单位的重量
此结果表明合成肽也能在角叉菜胶诱导的炎性痛觉过敏模型中产生抗疼痛作用。
实施例10.在角叉菜胶-诱导的痛觉过敏模型中测定鸦片样物质受体参与合成肽SEQ ID NO：2的止痛活性的情况
如同在PGE2模型中所测定的，研究了在角叉菜胶-诱导的痛觉过敏中阿片样物质受体参与肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用的情况(表10)。因此，用特异的μ受体拮抗剂CTOP(20μg/只爪子)、特异的κ受体拮抗剂nor-BNI(50μg/只爪子)或特异的δ受体拮抗剂ICI174.864(10μg/只爪子)处理动物，经足底内途径伴随着角叉菜胶注射。在临加角叉菜胶之前口服1μg/kg剂量的肽。数据表示每组5只动物的平均值±S.E.M.。
表10：在角叉菜胶-诱导的痛觉过敏模型中评估阿片样物质受体参与合成肽(1μg/kg)的抗疼痛作用的情况
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异
IM＝初始测量；FM＝最终测量；g＝以克为单位的重量
正如在PGE2-诱导的痛觉过敏模型中所观察到的，只有κ阿片样物质受体拮抗剂能干扰所述肽的抗疼痛作用。
实施例11.在坐骨神经慢性收缩引起的痛觉过敏-一种持久的疼痛模型中合成肽SEQ ID NO：2的止痛活性
依照Bennett，G.J和Xie，Y.K.(Pain，33：87-107，1988)所述方法在坐骨神经处进行手术诱发神经性疼痛。用氟烷麻醉动物。在大腿中间区域移开股骨二头肌暴露坐骨神经。接近坐骨神经的三根分叉部，在离三根分叉部7mm远的部位，在其周围做4个松散的结扎(铬肠线4-0)，相互之间间隔大约1mm。沿神经进行结扎，直至离最初的点4-5mm处。用4-0号丝缝合线分层缝合切口。
实施例11A.痛觉过敏的评估
依照Randall & Sellito(1957)描述的方法进行大鼠爪压力试验(Analgesy-Meter ugo Basile，Italy)以评估痛觉过敏。在手术之前(BM-基础测量)和之后第14天进行此试验以鉴定神经性疼痛的发展情况。手术后第14天，在口服施用0.0016、0.008、0.04、0.2、1和5μg/kg剂量的合成肽或作为对照的盐水之前(初始测量-IM)和之后1、3、24、48、72和96小时进行此试验(表11)。
通过比较基础测量平均值和初始测量平均值或者通过比较初始测量平均值和最终测量平均值，或者当测完时，通过比较不同实验组所获得的平均值，对结果进行分析。数据表示为每组5只动物的平均值±S.E.M。
表11：合成肽SEQ ID NO：2对坐骨神经所诱导的痛觉过敏的止痛作用的持续时间
BM＝手术前的基础测量，IM＝手术后第14天，给予所述肽之前的初始测量，FM＝手术后第14天，在给予肽或盐水之后不同时间的最终测量，g＝以克为单位的重量
肽剂量以μg/kg表示。
在第14天IM测定之后立即给予肽或盐水。BM、IM和FM的值以克(g)±S.E.M.表示。
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第14天的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
所获得的数据表明在单次给予后长达3天时在神经性疼痛模型中仍检测到所述肽能引起抗痛觉过敏的作用。
用以0.0016、0.008、0.04、0.2和1μg/kg剂量的合成肽处理动物后1小时获得的结果确定50、60和90％的有效剂量。分析数据确定疼痛阈值(痛觉过敏)降低的百分率，比较基础测量和初始测量值，然后测定痛觉过敏逆转的百分率，比较处理组(肽)和对照组(盐水)。用CurveExpert 1.3程序分析这些数据。结果证明在此例中所述肽的50、60和90％有效剂量分别是0.205517、0.283173和0.5747158μg/kg。
实施例11B.异常性疼痛的测定
依照Chaplan等(1994)所述方法加以修改后进行定量试验评估异常性疼痛对施加于大鼠爪上的触觉刺激的反应。在此试验中，将大鼠分别放置在底部有金属丝网眼的塑料笼中，使得可以接触到这些动物的爪。简而言之，对右后爪施加对数级数的10根校准的Semmes-Weinstein单丝(von Frey hairs，AesthesiometerSemmer-Weinstein，Stoelting Co.，E.U.A)以测定引起爪抽回反应所必需的刺激强度极限劲度。以log 10(mg×10)计的头发的对数劲度值如下(括弧之间是以克数表示的值)：3.61(0.407g)；3.84(0.692g)；4.08(1.202g)；4.17(1.479g)；4.31(2.041g)；4.56(3.630g)；4.74(5.495g)；4.93(8.511g)；5.07(11.749g)和5.18(15.136g)。应重点指出的是在异常性疼痛的研究中不使用重量大于15.136g的细丝。
将所述细丝逐一垂直摆放于双后爪足底区下并保持8秒的时间长度。连续两次能造成其抽回爪子的所述细丝被认为是引起反应(100％反应)所必需的力(以克数计)。没有对更大刺激(15.135g)的反应时，此细丝被认为是切割值。
用行为反应计算50％爪抽回的阈值(绝对阈值)，计算方法是用最大可能性拟合方法拟合高斯积分心理测量函数。此拟合方法可以进行参数分析。
进行此试验和此处理的时间与测定痛觉过敏所用的时间相同(表12)。
通过比较基础测量平均值和初始测量平均值，或者当测完时，通过比较不同实验组获得的平均值对结果进行分析。数据表示每组5只动物的平均值±S.E.M.。
表12：合成肽SEQ ID NO：2对坐骨神经收缩诱导的异常性疼痛的抗疼痛作用的测定
BM＝手术前的基础测量；IM＝手术后第14天给予所述肽之前的初始测量；FM＝手术后第14天在给予肽或盐水后不同时间的最终测量；数据表示为log 10(mg×10)±S.E.M.
肽剂量以μg/kg表示。
在第14天IM测定之后立即给予肽或盐水。
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第14天的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
数据表明在单次给予后长达3天时在神经性疼痛模型中仍检测到所述肽能引起抗异常性疼痛的作用。
实施例11C.自发性疼痛的测定
在坐骨神经收缩手术后第14天、口服给予肽(5μg/kg)或盐水之前和之后1、3、24、48、72、96、120和144小时观察大鼠以评估自发性疼痛(表13和14)。为了观察自发性疼痛的特征症状，将动物一只接一只放在透明塑料箱中。在30分钟适应期之后，观察大鼠10分钟，测定其舔食(以秒计)的持续时间和举起的时间。作为动物正常理毛行为的一部分而进行的舔食和举起动作不算。
表13.合成肽CNF021.03对坐骨神经收缩诱导的自发性疼痛的抗疼痛作用-爪子舔食持续时间(以秒计)
IM＝手术后第14天给予所述肽之前的初始测量；FM＝手术后第14天在给予肽或盐水后不同时间的最终测量
数据表示为舔食爪子的时间(以秒计)。数据表示每组5只动物的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
表14.合成肽CNF021.03对坐骨神经收缩诱导的自发性疼痛的抗疼痛作用-爪子举起的持续时间(以秒计)
IM＝手术后第14天给予所述肽之前的初始测量；FM＝手术后第14天在给予肽或盐水后不同时间的最终测量
数据表示为举起爪子的时间(以秒计)。数据表示每组5只动物的平均值±S.E.M.。
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
这些结果表明肽能干扰舔食和举起时间(表13和14)，显示了在神经性疼痛模型中此肽对自发性疼痛的抑制作用。
实施例12.在坐骨神经收缩模型中合成肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用涉及到阿片样物质受体
证明了所述肽对坐骨神经慢性收缩诱导的痛觉过敏和异常性疼痛中有抗疼痛作用之后，进一步研究了此作用中涉及到阿片样物质。为此，用特异的μ受体拮抗剂CTOP(20μg/只爪子)、特异的κ受体拮抗剂nor-BNI(50μg/只爪子)或特异的δ受体拮抗剂ICI 174,864(10μg/只爪子)处理动物。通过足底内途径注射拮抗剂。在临注射阿片样物质受体拮抗剂之前给予剂量为5μg/kg的所述肽。
比较基础测量平均值和初始测量平均值，或初始测量平均值和最终测量平均值，或者当测完时，通过比较用不同实验组获得的平均值进行结果分析(表15和16)。
表15.在神经性疼痛模型中，合成肽SEQ ID NO：2的抗痛觉过敏作用中涉及到阿片样物质受体的鉴定
BM＝手术前的基础测量；IM＝手术后第14天给予所述肽之前的初始测量；FM＝手术后第14天在给予肽或盐水后不同时间的最终测量；数据表示为克(g)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第14天的初始测量平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
数据表明δ阿片样物质受体拮抗剂在坐骨神经慢性收缩模型中阻断了所述肽的抗痛觉过敏作用。κ阿片样物质受体拮抗剂部分抑制了此作用。μ阿片样物质受体拮抗剂不影响所述肽的作用。
表16.在神经性疼痛模型中，合成肽SEQ ID NO：2的抗异常性疼痛作用中涉及到阿片样物质受体的鉴定
BM＝手术前的基础测量；IM＝手术后第14天给予所述肽之前的初始测量；FM＝手术后第14天在给予肽或盐水(对照)后不同时间的最终测量；在第14天测定IM值后立即给予所述肽或盐水。IM和FM值表示为log 10(mg×10)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第14天的初始测量平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
数据表明δ阿片样物质受体拮抗剂在坐骨神经慢性收缩模型中阻断了所述肽的抗异常性疼痛作用。κ阿片样物质受体拮抗剂部分抑制了此作用，而μ阿片样物质受体拮抗剂不影响所述肽的作用。
实施例13.合成肽SEQ ID NO：2在癌症疼痛，一种持久性疼痛模型中的止痛活性-用WALKER 256肿瘤进行的研究
Walker 256肿瘤细胞由Paulo大学生物医学研究所生理学和生物物理学系的Dr.Rui Curi.教授惠赠。处死携带肿瘤的动物并切下肿瘤组织，放置于含0.9％盐水的皮氏培养皿中。然后，将肿瘤切成小块，转移入含盐水的烧杯中。用细切工具将此材料切碎，直至肿瘤完全成碎片。然后，用纱布过滤此材料并收集液体至烧杯中。所有的步骤均在冰上进行。将烧杯里的材料转移到50ml塑料管中并在4℃1200rpm离心10分钟。离心后，弃去上清液并将沉淀重悬于0.9％的盐水中。为了进行细胞计数，将细胞悬浮液稀释(1∶100)于盐水中。将试样(200μ1)取出并放置于含20Oμl 1％台盼蓝的试管中。用Neubauer’s盒在光学显微镜下测定细胞数目。折射光的细胞被认为是活的，由此测定细胞存活率。
在确定细胞数目后，在大鼠右侧腹膜内注射含1×107个细胞的悬浮液1ml以获得液态瘤(腹水)。
注射后5天，处死有腹水的大鼠并从腹膜腔中收集腹水液，放置在含EDTA的试管中。此液体用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4稀释100倍。如上所述用台盼蓝稀释后完成细胞计数。通过用PBS进行稀释确定肿瘤细胞计数达到100μl中1×106个细胞。在预备试验中确定此细胞数目用于在大鼠中诱导癌症疼痛。在该最后的细胞数目调整中，需考虑加入悬浮液中的抗生素(Benzetacil)的量(150,000个单位抗生素/10ml悬浮液)。使用抗生素是为了避免微生物污染。通过足底内注射途径将细胞注入大鼠后爪。对照动物是在相同实验条件下将PBS注射入对侧爪。
为了评估合成肽在此动物模型中的抗疼痛作用，在Walker肿瘤细胞注射后5天，用剂量为6μg/kg的所述肽或盐水(对照)口服处理动物。在注射肿瘤细胞之前(BM-基础测量)以及注射后5天、给予所述肽之前(IM-初始测量)和之后2小时(FM-最终测量)检测痛觉过敏、异常性疼痛和自发性疼痛。
比较基础和初始测量平均值，或初始和最终测量平均值，或当测完时，通过比较不同实验组中所获得的平均值对结果进行分析(表17、18、19)。
表17.合成肽CNF021.03对WALKER 256肿瘤所诱导的痛觉过敏的抗疼痛作用
BM＝注射肿瘤前的基础测量；IM＝植入肿瘤后第5天给予所述肽之前的测量；FM＝植入肿瘤后第5天在给予肽后2小时的测量；数据表示为克(g)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第5天的初始测量平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
表18.合成肽CNF021.03对WALKER 256肿瘤所诱导的异常性疼痛的抗疼痛作用。
BM＝注射肿瘤前的基础测量；IM＝植入肿瘤后第5天给予所述肽之前的测量；FM＝植入肿瘤后第5天在给予肽后2小时的测量；数据表示为log 10(mg×10)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第5天的初始测量平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
表19.合成肽CNF021.03对WALKER 256肿瘤所诱导的自发性疼痛的抗疼痛作用
BM＝注射肿瘤前的基础测量；IM＝植入肿瘤后第5天给予所述肽之前的测量；FM＝植入肿瘤后第5天在给予肽后2小时的测量；数据表示为举起或舔食后爪的持续时间(以秒计)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第5天的初始测量平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
结果表明所述肽阻断了Walker肿瘤所诱导的痛觉过敏(表17)、异常性疼痛(表18)和自发性疼痛(表19)。这些数据显示所述的肽能抑制癌症疼痛。
实施例14.在WALKER 256肿瘤诱导的癌症疼痛模型中合成肽SEQID NO：2的抗疼痛作用涉及到阿片样物质受体的评估
证实所述肽对Walker 256肿瘤所诱导的痛觉过敏和异常性疼痛的抗疼痛作用之后，进一步对此作用中涉及到阿片样物质受体进行了研究。为此，用特异的μ受体拮抗剂CTOP(20μg/只爪子)、特异的κ受体拮抗剂nor-BNI(50μg/只爪子)或特异的δ受体拮抗剂ICI 174,864(10μg/只爪子)处理动物。通过足底内途径注射这些拮抗剂。在临注射阿片样物质受体拮抗剂之前口服给予剂量为6μg/kg的所述肽。比较基础测定平均值和初始测定平均值，或初始测定平均值和最终测定平均值，或者当测完时，通过比较用不同实验组获得的平均值进行结果分析(表20)。
表20.在WALKER 256诱导的癌症模型中合成肽SEQ ID NO：2的抗痛觉过敏作用涉及到阿片样物质受体的鉴定
BM＝注射肿瘤前的基础测量；IM＝植入肿瘤后第5天给予所述肽之前的测量；FM＝植入肿瘤后第5天在给予肽后2小时的测量；数据表示为克(g)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第5天的初始测量平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
数据表明κ阿片样物质受体拮抗剂阻断了所述肽的抗痛觉过敏作用。δ阿片样物质受体拮抗剂部分抑制了此作用，而μ阿片样物质受体拮抗剂不影响所述肽的作用。
表21.在WALKER 256诱导的癌症模型中合成肽SEQ ID NO：2的抗异常性疼痛作用涉及到阿片样物质受体的鉴定
BM＝注射肿瘤前的基础测量；IM＝植入肿瘤后第5天给予所述肽之前的测量；FM＝植入肿瘤后第5天在给予肽后2小时的测量；数据表示为log 10(mg×10)的平均值±S.E.M.
*p＜0.05与基础测量的平均值有显著差异
§p＜0.05与第5天的初始测量平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
数据表明κ阿片样物质受体拮抗剂阻断了所述肽的抗异常性疼痛作用。δ阿片样物质受体拮抗剂部分抑制了此作用，而μ阿片样物质受体拮抗剂不影响所述肽的作用。
实施例15.在热板试验中合成肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用的评估
此试验用于评估干扰中枢神经系统中疼痛感受的药物，例如，吗啡及其衍生产物，因为热刺激直接激活疼痛感受器，避免了组织损伤以及随后的炎症。此试验中所获得的数据表明某化合物的抗疼痛作用主要是由脊椎上的综合反应造成的。
此试验依照Jacob，J.J.C.和Ramabadran，K.(Br.J.Pharmacol.，64：91-8，1978)所述的方法进行。为了进行此试验，将小鼠放置在50℃±1的金属表面。结果表示为观察到舔食双前足的等待时间(以秒-s计)(反应时间)。在给动物口服生理盐水(对照)或合成肽(1和3μg/kg，体积200μl)之前(初始测量-IM)和之后2小时(最终测量-FM)进行此试验。各动物被认为是其自身的对照。比较IM和FM的平均值，或者当测定完成时，通过比较不同实验组之间的平均值对结果进行分析(表22)。
表22.用热板试验评估的合成肽SEQ ID NO：2的抗疼痛作用
IM＝初始测量；FM＝最终测量；数据表示为克(g)的平均值±S.E.M
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异。
此结果证明了合成肽也可通过作用于中枢神经系统诱导抗疼痛作用。
实施例16.修饰的合成肽SEQ ID NO：3的抗疼痛活性
通过足底内途径(i.pl.)给予剂量为100ng/只爪子的前列腺素E2以诱导痛觉过敏。在注射PGE2之前(初始测量-IM)和之后3小时(最终测量-FM)评估痛觉过敏情况。
用大鼠爪压力测试评估痛觉过敏情况。疼痛阈值表示为使动物作出反应抽回爪子所需施加的力(以克计)，在足底内注射前列腺素E2(100ng/条腿)之前(初始测量)和之后3小时(最终测量)进行测定。
将修饰的合成肽SEQ ID NO：3稀释于体积为11ml的盐水中。在临诱导痛觉过敏之前通过口服(p.o.)使各动物接受2ml的所述溶液。用口服了盐水的动物作为对照。
数据表示为克(g)的平均值±S.E.M
*p＜0.05与初始测量的平均值有显著差异
#p＜0.05与对照组(盐水)的平均值有显著差异。
结果表明修饰的合成肽SEQ ID NO：3在PGE2诱导的痛觉过敏中具有抗疼痛作用。
序列表
<110>申请人：Laboratório Biosintética Ltda.等
<120>发明名称：源自响尾蛇cortalus durissus terrificus蛇毒的止痛肽的类似化合物、它们的用途、组合物、制备和纯化方法
<130>文件参考号：PI0401702-1
<140>目前的专利申请：
<141>目前的提交日期：2005-05-06
<150>早期的专利申请：BR PI0401702-1
<151>早期专利提交日期：2004-05-06
<160>序列数：8
<170>软件：PatentIn
<210>SEQ ID NO 1
<211>长度：14
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：止痛剂；作用于阿片样物质受体；
Xaa(1)通常是焦谷氨酸；Xaa(2)＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr；Xaa(4)＝Pro或Arg；
Xaa(5)＝Glx或Asx或Gly；Xaa(6)＝Asn或Gln或Leu；Xaa(10)＝Glx或Asx；
Xaa(12)＝Glx或Lys
<400>序列：1
Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys
1 5 10
<210>SEQ ID NO 2
<211>长度：14
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：止痛剂；分离自响尾蛇CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS毒液；作用于阿片样物质受体；
Xaa(1)通常是焦谷氨酸
<400>序列：2
Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gln Gly Glu Ser Gln Pro Cys
1 5 10
<210>SEQ ID NO 3
<211>长度：14
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：止痛剂；作用于阿片样物质受体；
Xaa(1)通常是焦谷氨酸
<400>序列：3
Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gln Gly Glu Ser Lys Pro Cys
1 5 10
<210>SEQ ID NO 4
<211>长度：14
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：Xaa(1)通常是焦谷氨酸；
Xaa(2)＝Phe或Trp或Tyr或Leu或Thr；Xaa(4)＝Pro或Arg；Xaa(5)＝Glx或Asx或Gly；Xaa(6)＝Asn或Gln或Leu；Xaa(10)＝Glx或Asx；Xaa(12)＝Glx或Lys；
<400>序列：4
Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys
1 5 10
<210>SEQ ID NO 5
<211>长度：8
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：止痛剂化合物制备的中间物或作用于阿片样物质受体的中间物；Xaa(4)＝Glx或Asx；Xaa(6)＝Glx或Lys
<400>序列：5
Cys Glx Gly Xaa Ser Xaa Pro Cys
1 5
<210>SEQ ID NO 6
<211>长度：14
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：
Xaa(1)通常是焦谷氨酸
<400>序列：6
Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Lys Gly Glu Ser Gln Pro Cys
1 5 10
<210>SEQ ID NO 7
<211>长度：14
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：
Xaa(1)通常是焦谷氨酸
<400>序列：7
Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Lys Gly Glu Ser Lys Pro Cys
1 5 10
<210>SEQ ID NO 8
<211>长度：14
<212>类型：肽
<213>生物体：
<220>特征：
<221>名称/关键词：肽
<222>位置：
<223>其它信息：CROTAPOTIN的C末端部分，来自响尾蛇CROTALUS DURISSUS TERRIFICUS种蛇毒的响尾蛇毒蛋白的无毒酸性亚基(SWISS PROT/P08878)；Xaa(1)通常是焦谷氨酸
<400>序列：8
Xaa Phe Ser Pro Glu Asn Cys Gln Gly Glu Ser Gln Pro Cys
1 5 10
机译： 产自响尾蛇蛇毒的镇痛肽类似物化合物，其用途，组成，制备和纯化方法
机译： 南美响尾蛇（CROTALUSDURISSUSTERRIFICUSSNAKES）类似化合物的止痛肽来源于毒液，其用途，组成，制备和纯化方式
机译： 拟南芥蛇毒的止痛肽类似物化合物，其用途，组成，制备和纯化方法
