利用水稻转录因子基因SNAC2提高植物耐冷耐盐能力

摘要

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物耐冷和耐盐有关。将该基因的完整翻译区与玉米的强启动子(Ubiquitin1)结合后直接转入一般植物体，转基因植株的耐冷和耐盐能力显著提高。本发明克隆得到SNAC2基因介导的赋予植物对低温和盐胁迫耐受能力的DNA序列，它是(a)SEQ IDNO：1中第112－1023位碱基所示的DNA序列，或(b)编码与(a)编码的蛋白质相同的蛋白质的DNA序列。本发明还涉及所述基因的DNA序列在增加水稻对干旱和盐胁迫耐受能力中的应用。

说明书

                         技术领域

本发明涉及植物基因工程领域。具体涉及一种水稻DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。所述的基因与植物耐冷和耐盐有关。将该基因的完整翻译区(Coding sequence)与玉米的强启动子(Ubiquitin1)结合后直接转入一般植物体，转基因植株的耐冷和耐盐能力显著提高。

                         背景技术

植物在生长的过程中会受到诸多环境因素的影响，干旱、盐害和低温往往导致农作物的大规模减产，在许多地区是农业发展的瓶颈。为了抵抗或适应环境不利因素，植物体感受细胞外环境条件的变化并通过多种途径将其传递到细胞内，会诱导表达一些应答基因，产生一些使细胞免受干旱、高盐、低温等胁迫伤害的功能蛋白、渗透调节物质以及传递信号和调控基因表达的转录因子，从而对外界的变化做出相应的反应(Xiong等Cell signaling during cold，drought and salt stress.Plant Cell.14(suppl)，S165-S183，2002)。而那些功能基因对环境做出反应的过程中能否正确表达受到调控因子特别是转录因子的精细调节。而目前在许多植物中发现AP2/EREBP，Zinc finger，Myb，bZIP和NAC类转录因子家族在不同的逆境胁迫下，可诱导表达或被抑制，因而认为这些转录因子家族在植物对逆境的应答过程中起着非常重要的调控作用。因此分离和鉴定对逆境起核心调控作用的转录因子，并用于作物抗逆境的遗传改良，对育种有着重要的意义。目前人们已在植物抗性改良方面作了尝试，利用DREB1A和DREB2A培育的转基因拟南芥植株，其低温耐性和干旱，高盐耐性都比野生型强(Liu Q等Two transcription factors，DREB1 and DREB2，with anEREBP/AP2 DNA domains separate two cellular signal thansduction pathways in drought-andlow-temperature-responsive gene expression，respectively，in Arabidopsis.Plant Cell.1998，10：1391-1406.)。美国Michigan州立大学的Thomashow MF研究小组利用拟南芥CBF1基因，进行遗传转化，也培育出耐寒性增强的植株。

水稻是最重要的粮食作物之一，耐冷或耐盐的水稻对我们来说具有重要的意义，因而找出与抗冷或耐盐的转录因子，培育耐冷和耐寒的品种对提高水稻产量具有重要意义。

                                  发明内容

本发明的目的是从水稻中分离克隆一个包含有耐冷和耐盐相关转录因子基因完整编码区段的DNA片段，利用这个基因改良水稻或其它植物的抗逆性。对这个基因进行结构分析其属于植物特异的转录因子NAC家族，而且是与逆境相关的，因此被命名为SNAC2。

本发明涉及分离和应用一种包含SNAC2基因的DNA片段，该片段赋予植物在低温等逆境条件下，增强耐受能力。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO：1所示，或者基本上相当于SEQ IDNO：1所示的高度同源DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO：1所示序列的亚片段。

可以采用已经克隆的SNAC2基因作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的SNAC2基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到包含SNAC2基因的序列，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，可获得对低温，高盐胁迫耐受力得到增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的翻译。

携带有本发明SNAC2基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant MolecularBiology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant MolecularBiology(2^nd Edition)。

可使用包括本发明的SNAC2基因的表达载体转化宿主是包括水稻在内多种植物，培育抗盐或抗寒的植物品种。

本发明基因是受逆境诱导表达的，因此其启动子是诱导型启动子，将本发明的启动子区段与任何感兴趣的基因同时连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在逆境条件下可诱导表达基因，提高植物对逆境的耐受能力。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

                                  附图说明

序列表SEQ ID NO：1显示的是本发明分离克隆的包含有SNAC2基因编码区DNA片段序列。其中SEQ ID NO：1中第112-1023位碱基所示的序列为编码区(CDS)

图1：SNAC2基因分离和鉴定流程图。

图2：用Northern杂交检测SNAC2基因在干旱，高盐，低温和ABA等逆境胁迫不同时间点的表达水平。

图3：是本发明构建的SNAC2基因超量表达载体pU1301-SNAC2。

图4：SNAC2基因在转基因植株中的表达情况，第一道为对照，其余为转基因独立转基因植株。

图5：苗期SNAC2超量表达转基因家系在低温胁迫后恢复期的生长情况。其中，每个小红桶一半种植对照，一半为本发明的转基因植株。低温胁迫为4℃生长箱16小时光照/8小时黑暗胁迫5天，然后在正常条件恢复生长。

图6：苗期SNAC2超量表达转基因家系在高盐中的生长情况。发芽4天的幼苗转至含有150mM NaCl的MS培养基中生长18天后的图片(A)及株高和根长的统计结果(B)。

图7：酵母中的反式激活实验和酵母单杂交实验验证SNAC2具有转录激活和DNA结合的特性。A为反式激活实验；B为酵母单杂交实验。

图8：SNAC2基因在植物细胞内的亚细胞定位。其中A为构建的载体示意图；B为在共聚焦显微镜的观察结果，(i)为愈伤切片在荧光染料碘化丙啶染色后观察的结果，(ii)为绿色荧光下GFP表达的图像，(iii)为红绿荧光合成的结果。

图9：是本发明用于构建融合表达基因的载体载体(pCAMBIA1391U-EGFP)

                                具体实施方式

本发明的前期工作获得了来源于水稻品种明恢63(一种中国普遍推广应用的一个水稻品种)的cDNA克隆99C10。该cDNA是SNAC2基因的全长cDNA，是一个抗旱相关转录因子。主要依据有以下几个方面：(1)采用cDNA芯片数据(未发表)分析发现cDNA克隆99C10在水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)干旱胁迫处理15天表达量增加3.5倍。对其进行测序，分析发现该基因就是OsNAC6(Genebank数据库登录号为AK068392)。鉴于该克隆表达量在干旱处理后的明显差异和其功能特征，认为99C10克隆所代表的基因在逆境下参与调控基因的表达。(2)对其进行逆境条件下的表达谱分析(图2)，发现在胁迫处理的过程中，表达量有明显的提高。(3)，将其全长基因在植株中超量表达，转基因植株的耐冷性和抗高盐能力大大增强(图4和图5)。这些结果都表明SNAC2基因是一个逆境相关调控基因，不仅参与调控抗旱，也参与调控抗高盐和寒冷。

以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆包含有SNAC2基因完整编码区段的DNA片段以及验证SNAC2基因功能的方法(发明流程如图1所示)。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：分离克隆包含有SNAC2基因区段的DNA片段

通过水稻品种“中旱5号”(由中国上海农科院提供的一个公开使用的一个水稻品种)的干旱诱导基因表达谱分析，发现了一个受干旱强烈诱导(干旱胁迫后期表达量提高3.5倍以上)的EST(表达序列标签)，经序列分析发现，该基因为转录因子家族NAC的一个成员，并且是全长序列，其对应日本水稻全长数据库(http://cdna01.dna.affrc.go.jp)中的cDNA克隆J013149P14。根据该克隆序列，本发明设计了引物T050F，该引物的序列如下所示：(5’-CAGGTACCGCCAAGCCCTCCTCTCCTCTTCCCAT-3’，序列特异引物外加接头KpnI位点)和T050R(5’-CAGGATCCCCTCGTCGTCGTTCAGTCC-3’，序列特异引物外外加接头BamHI)，将该克隆的1-1269bp序列从“中旱5号”品种中反转录扩增出来。扩增产物就是本发明的序列1-1269bp(该序列在本发明的SEQ ID NO：中，其表达载体pU1301-SNAC2参见：图3)。具体步骤为：采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)从干旱胁迫处理的水稻品种“中旱5号”中提取叶片总RNA(提取方法根据上述TRIZOL试剂说明书)，利用反转录酶(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA第一链，反应条件为：65℃5min，42℃50min，70℃10min。根据cDNA克隆J013149P14的序列设计的巢式引物将其从反转录产物中扩增出来，反应条件为：94℃预变性2min；94℃30sec，55℃30sec，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。该克隆命名为PGEM-SNAC2。

实施例2：检测水稻内源基因SNAC2的诱导表达

以水稻品种“中旱5号”为材料，在3叶期分别进行干旱、冷害和高盐胁迫以及ABA(脱落酸)处理。干旱处理是用20％的聚乙二醇(商品名为PEG6000)浸泡幼苗根部，分别于0h，0.5h，1h，2h，4h，6h后取样。冷害处理是将上述水稻幼苗置于4℃生长箱，0h，1h，8h，12h后取样。高盐胁迫是将幼苗根部浸泡在200mM/L NaCl溶液中并在0h，4h，8h，16h后取样。ABA处理是将幼苗根部浸泡在100μM/L ABA溶液中并在0h，0.5h，3h，6h，12h和24h后取样。提取叶片的总RNA(Trizol试剂，购自Invitrogen公司)后按Sambrook等的《分子克隆》(科学出版社，北京，1999年版)有关实验操作方法进行RNA转膜，并以SNAC2为探针做Northern杂交。结果表明，本发明克隆的基因SNAC2能被干旱、冷害、高盐和脱落酸(ABA)诱导表达(如图2所示)，是一个与逆境相关的转录因子。

实施例3，SNAC2基因超量表达载体的构建，转化

根据实施例2的结果，知道本发明基因SNAC2是能被干旱、冷害、高盐和ABA诱导表达的，为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达，从转基因植株的表型来验证。方法是：首先将实施例1中得到的阳性克隆pGEM-SNAC2质粒用BamHI和KpnI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带玉米强启动子Ubiquitin1的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(来自澳大利亚CAMBIA实验室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米强启动子Ubiquitin1的农杆菌介导的遗传转化载体)，酶切完毕，用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含SNAC2基因的酶切片段和酶切的pU1301载体做连接反应，转化大肠杆菌DH10β(菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，获得本发明的转化载体pU1301-SNAC2(构建过程如图3所示)。

本发明的遗传转化方法是，通过农杆菌介导的水稻遗传转化的方法将其导入到水稻品种中花11(中国水稻研究所提供的一个公开使用的一个水稻品种)中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗移栽，得到转基因植株。本发明的具体的转化步骤参见Hiei等人报道的转化方法(参见：Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，Plant Journal 6：271-282)进行。或者参照本申请人专利号为ZL200410061011.7(发明名称：利用水稻干旱诱导基因启动子LEAP改良植物抗旱性，专利授权日：2006年5月31日)所示的方法进行。本发明通过上述方法获得的转基因水稻植株命名为T050U。本发明总共获得独立转基因水稻植株23株。

实施例4：SNAC2基因转基因T2家系苗期耐冷筛选

为了验证转基因水稻植株的耐冷性是否增强以及其增强是否与转入的SNAC2基因有关，本发明采用Northern杂交技术(Church GM and Gilbert W，Genomic sequencing.Proc Natl Acad SciUSA，1984，81：1991-1995)对部分转基因水稻植株中SNAC2基因的表达进行检测(图3为Northern杂交(方法同实施例2)的结果，并对本发明T2代植株的部分家系进行了耐冷性筛选。具体步骤如下：T2代家系的种子在含有50mg/ml潮霉素的MS培养基发芽5天后，将发芽一致的幼苗移栽到小红桶中，一半种植转基因超量表达植株，一半种植阴性对照植株。在植株长到4叶期时，对其进行4℃低温处理(4℃生长箱，16小时光照/8小时黑暗)，处理5天后，观察了转基因植株和对照植株的表型，似乎没有显著性差异，但将它们转到正常自然环境恢复生长3天后，发现大部分对照植株卷叶并萎焉，而转基因植株只有很少的卷叶现象；当恢复生长7天后，对照植株基本全都枯黄死去，而转基因超量表达家系还有近50％的存活率(见图5)。该结果说明SNAC2基因的确与耐冷相关，其超量表达能提高转基因植物的耐冷性，转基因水稻植株的抗性增强确实与转入的SNAC2基因有关。

实施例5：SNAC2基因转基因T2家系苗期抗盐筛选

在实施例4中我们已证明本发明基因SNAC2转基因植株苗期的耐冷性极显著高于对照，为了验证SNAC2转基因水稻植株是否还具有其他的抗逆效果，本实施例中对其进行了高盐环境中植株的生长势比较。具体方法如下：将上述T2代转基因超量表达家系，在含有50mg/ml潮霉素的MS培养基发芽4天长势一致的转基因和对照的幼芽转到含有150mmol/L NaCl的MS培养基的小方盒中生长，观察长势并在18天后测量了每株幼苗的根长和株高。测量结果表明在高盐生长环境中，SNAC2超量表达或诱导表达转基因和对照植株的根长没有差异；但株高有很明显的差异，对照植株在高盐环境中生长受到明显的抑制，它们的生长势将近只有转基因超量表达家系的60％(见图6)。这些结果表明在高盐生长环境中，SNAC2超量表达转基因幼苗比对照植株有更高的耐盐能力，表明本发明基因SNAC2转基因植株能显著提高植物的抗高盐性。

实施例6：SNAC2基因具有转录激活和DNA结合的特性

转录因子具有DNA结合特性和转录激活特性，在信号传导或逆境诱导下，结合下游基因启动子的顺式作用元件，从而启动下游靶基因的表达。而本发明基因为诱导型转录因子，为了验证本发明基因SNAC2是否具有转录激活和DNA结合功能，本实例利用在酵母细胞的反式激活实验和单杂交实验来验证SNAC2蛋白作为转录因子的DNA结合活性和转录调控(激活)功能。首先将SNAC2基因构建到酵母GAL4-DB融合表达载体pDEST32(购自Invitrogen公司)，将其转化酵母细胞Y187(购自CLONTHCH公司)，经β-Galactosidase酶活性实验(Yeast handbook，CLONTECH)，观察酵母是否显蓝色确定报告基因LacZ的表达，从而确定基因是否具有激活功能。实验结果表明本发明的基因确实具有转录激活特性(图7A)。Hu等(Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.ProcNatl Acad Sci USA，2006，103：12987-12992)研究结果表明SNAC1能结合在拟南芥中鉴定的NAC识别位点NACRS类似的DNA序列，为了进一步验证水稻其它的NAC类蛋白SNAC2是否也能结合这一序列，本实施例分析了SNAC2蛋白与OsERD1启动子(来自水稻基因ERD1)中含CATGTG和CACG序列的DNA在酵母中的互作关系。申请人将全长的SNAC2编码序列与酵母载体pGAD-RecT7(购自CLONTHCH公司)的GAL4-activation domain融合后的表达载体pGAD-SNAC2和pHIS-cis(见Hu等Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcriptionfactor enhances drought resistance and salt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：12987-12992)共同转化酵母细胞Y187，同时也转化了阳性对照(pHIS53/p53GAD)和阴性对照(pGAD-SNAC2/pHIS53)。结果显示在没有3-AT的酵母平皿SD/Leu^-/Trp^-/His^-上，目标转化子、阴性对照和阳性对照转化子都能生长；但当加入20mmol/L的3-AT(3-氨基三唑)时，阴性对照转化子不能在SD/Leu^-/Trp^-/His^-培养基上生长，而阳性对照和目标转化子都能很好的生长(图6B)。此结果表明SNAC2也能识别并结合到OsERD1启动子区包含CATGTG和CACG的序列，在酵母细胞中具有转录激活功能；同时也说明水稻的NAC蛋白能识别与拟南芥NAC蛋白识别类似的序列。这些结果表明本基因具有转录激活和DNA结合的转录因子的特性。

反式激活实验具体实施步骤为：

1.将SNAC2基因全长融合到酵母表达载体pDEST32(购自Invitrogen公司)。

根据全长cDNA克隆序列按照pDEST32载体的读码框(见Invitrogen说明)设计基因引物F(5-TAGAATTCGACGAGGAGCTGGTGATGC-3，特异引物外加EcoRI位点)和R(5-TAGGATCCATTTAGGTGACACTATAG-3，特异引物外加BamHI位点)，将得到的PCR产物经过PEG8000纯化后与中间载体pDONR221(购自Invitrogen公司)进行BP重组反应，反应体系为5μl，PCR产物200ng，pDONR221 50ng，5XBP Clonase Reaction Buffer 2μl，BPClonase Mix 2μl，置于25℃5个小时左右，转化大肠杆菌DH10β(购自Invitrogen公司)，筛选阳性克隆，然后将所需阳性克隆质粒通过LR重组反应(详见Gateway重组系统说明)将其携带的基因片段融合到酵母表达载体pDEST32，步骤为：BP反应阳性质粒100ng，pDEST32 50ng，5XLR Clonase Buffer 2μl，LR Clonase Mix 2μl，25℃5个小时左右，转化大肠杆菌DH10β(购自Invitrogen公司)，筛选阳性克隆。

2.醋酸锂(LiAc)法酵母感受态的制备及转化(CLONTECH，Yeast Protocols Handbook)

1)试剂及其配方

A，YPD培养基(medium)

20g蛋白胨(Difco peptone)

10g酵母提取物(Yeast extract)

20g葡萄糖(glucose)

用蒸馏水定容至1L，pH7按照常规方法高压蒸汽(121℃)灭菌15分钟

B，SD/Leu培养基(medium)

6.7g酵母氮碱(Yeast nitrogen base without amino acids)

20g琼脂粉(Agar powder)

20g葡萄糖(glucose)

0.69g-Leu DO Supplement(购于CLONTECH公司)

用蒸馏水定容至1L，按照常规方法高压蒸汽(121℃)灭菌15分钟

C，10TE buffer：0.1M Tris-HCl，10mM EDTA pH 7.5，高压蒸汽(121℃)灭菌

D，10LiAc：1M lithium acetate(醋酸锂)，pH 7.5，高压蒸汽(121℃)灭菌

E，PEG/LiAc solution(聚乙二醇/醋酸锂溶液)

                    终浓度.         配10ml溶液的配方

PEG4000             40％            8ml of 50％PEG

TEbuffer            1X              1ml of 10X TE

LiAc                1X              1ml of 10X LiAc

2)步骤：

A，先用1ml YPD溶液将直径大小为2-3mm的酵母单菌落打散，转移到含有10ml YPD培养基的三角瓶中，

B，在转速为250rpm下，30℃培养16-18小时，使OD600＞1.5

C，取5ml左右上述菌液到另一含有50mlYPD培养基的三角瓶，检测浓度使OD600＝0.2-0.3

D，30℃培养3小时(230rpm)，此时，OD600＝0.4-0.6，如果OD600＜0.4，可能培养有问题

E，将菌液至于50ml离心管，室温1000xg离心5分钟，

F，去掉上清，用灭菌的双蒸水重悬细胞，室温1000xg离心5分钟，

G，去上清，用1ml现配的1x TE/1x LiAc将酵母细胞混匀

H，将200ng融合质粒DNA置于1.5-ml离心管，加入100ul酵母感受态细胞混匀，加入600ul PEG/LiAc，高速离心混匀，30℃培养30min(200rpm)

I，加入70ul的DMSO(100％，二甲基亚砜)，轻柔上下颠倒数次，42℃水浴15min后置于冰上2min

J，室温14000rpm离心5秒，去上清，用500ul 1x TE buffer打散细胞。

K，取100ul转化细胞均匀涂于-Leu/SD平皿，在30℃培养箱倒置培养2-4天直至克隆出现。

3，用β-Galactosidase实验中报告基因LacZ表达情况验证SNAC2基因及其缺失突变体的转录活性。

1)试剂及配方

A，Z buffer

Na₂HPO₄·7H₂O                            16.1g/L

NaH₂PO₄·H₂O                             5.5g/L

KCl                                          0.75g/L

MgSO₄·7H₂O                               0.246g/L

调节pH到7.0，按照上述常规方法灭菌。

B，X-gal stock solution(20mg/ml)

C，Z buffer/X-gal solution

100ml  Z buffer：

0.27ml β-mercaptoethanol

1.67ml X-gal stock solution

2)步骤：

A，将转化的克隆长到1-3mm(30℃，2-4天)

B，将合适大小的圆形无菌Watman滤纸放置于10cm无菌平皿，加入2.5-5ml左右Zbuffer/X-gal solution，将其润湿，忌气泡。

C，用镊子将另一张干净无菌滤纸置于长有克隆的平皿上，轻压滤纸，使克隆粘附到滤纸上

D，当滤纸已湿润，用镊子揭开滤纸，将粘附有克隆的面朝上，放置于液氮10秒后，将其置于室温解冻，这样冻融的目的是使酵母细胞破碎

F，小心将这滤纸克隆面朝上置于先前润湿的滤纸上，忌气泡

G，将滤纸在30℃放置(30min-8hr)，根据蓝色斑出现的情况来判断基因是否具有激活功能。

酵母单杂交实验具体实施步骤为：

1.将SNAC2基因全长融合到酵母表达载体pGAD-Rec2(购自CLONTECH公司)。

根据全长cDNA克隆序列按照pGAD-Rec2载体的读码框设计基因引物F(5-TAGAATTCGACGAGGAGCTGGTGATGC-3，特异引物外加EcoRI酶切位点)和R(5-TAGGATCCCCTCGTCGTCGTTCAGTCC-3，特异引物外加BamHI酶切位点)，将得到的PCR产物双酶切并用氯仿异戊醇纯化后与经过同样双酶切的载体pGAD-Rec2连接，转化大肠杆菌DH10β(购自Invitrogen公司)，用同样的酶切方法验证筛选阳性克隆，获得酵母转化载体pGAD-SNAC2。

2.将含有CATGTG和CACG核心序列的OsERD1启动子区90bp三次重复序列连入载体pHIS2(购自CLONTECH公司)。

将含有核心序列为CATGTG和CACG的OsERD1启动子区90bp(5’-CCCCGCGCGACGTCGACAAGTCGACAAGTGCGAGGAGCTAGCCATGTGGGTCGTGCCCGCGCGCGCCACGGCACGGCAACCCCGGAAACG-3’)三次串联重复序列经公司合成两端带有EcoRI和SacI位点定向连入酵母载体pHIS2，用同样的酶切方法验证筛选阳性克隆，获得酵母转化载体pHIS2-cis。

3.感受态细胞的制备和酵母载体的转化(方法与反式激活实验相同)，将目标双载体(同时准备阳性对照和阴性对照)转化后的细胞涂皿SD/Leu-/Trp-后30℃培养箱生长直至菌落大小为2mm左右。

4.将同一菌落在含有0mM，10mM，20mM，30mM和40mM的3-AT的SD/Leu-/Trp-/His-的平皿上划线生长看菌的长势。

实施例7，SNAC2的亚细胞定位

为了确定SNAC2基因在细胞的表达部位，进一步进行了GFP-NLS(核定位信号)融合蛋白构建，即根据GFP的表达情况来确定基因在细胞内的表达模式。首先参照前人发表的NAC基因(Miki Fujita，Kazuo Shinozaki et al，A Dehydration-induced NAC protein，RD26，is involved in anovel ABA-dependent stress-signaling pathway.Plant J(2004)39，863-876和Honghong Hu et al，Overexpressing a NAM，ATAF，and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance andsalt tolerance in rice.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：12987-12992)分析该基因的核定位信号(NLS)可能位于71-83AA，根据此序列与GFP融合后在细胞内的表达部位可确定该基因的亚细胞定位。将本发明序列的1-144AA片段融合到pCAMBIA1391-GFP载体(带有ubiquitin1启动子)上，因此我们通过P_SNAC2：⊿SNAC2-GFP转基因植株中GFP在细胞内的表达部位即可推测SNAC2蛋白的细胞定位。pCAMBIA1391-EGFP载体是在国际上通用的植物遗传转化载体pCAMBIA1391基础上改建的(如图9所示)，将其携带的GUS基因换成EGFP基因，GFP前带有Ubiquitin1启动子，pCAMBIA1391载体来自澳大利亚CAMBIA实验室公开使用(Center for the Application ofMolecular Biology to International Agriculture)。

融合基因载体构建的具体方法如下：设计引物PF(5-GGATCCCTCCTCTCCTCTTCCCAT，加接头BamHI位点)和PR(5-GAATTCGTTCTTCTTGCGG，加入接头EcoRI)，以上述实施例1中构建的载体pGEM-SNAC2为模板，通过扩增程序(94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃0.5min，30个循环；72℃延伸5min)将其扩增出来，扩增产物通过EcoRI和HindIII双酶切，连入已进行同样双酶切的pCAMBIA1391-EGFP载体。将融合载体p1391-GFP-NLS用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻愈伤(其具体方法同实施例3所述)，在潮霉素(其具体方法同实施例3所述)的选择压力下得到抗性愈伤，在荧光显微镜下观察到GFP表达(如图8A所示)，将表达的抗性愈伤制成切片，并在共聚焦显微镜下观察GFP在细胞内的表达情况。图8B显示在共聚焦显微镜下GFP只在细胞核中表达，说明1-144AA的序列已包含NLS，可将GFP定位在细胞核，即SNAC2蛋白定位在细胞核。本实例证明本发明序列的1-144AA片段包含完整的NLS，可将SNAC2蛋白定位在细胞核内。

                                    序列表

<110>华中农业大学

<120>利用水稻转录因子基因SNAC2提高植物耐冷耐盐能力

<130>

<141>2007-03-12

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1529

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1529)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(112)..(1023)

<223>

<400>1

gccaagccct cctctcctct tcccaacact agtaggataa agccacagag agagcagtag    60

tagtagcgag ctcgccggag aacggacgat caccggagaa gggggagaga g atg agc    117

Met Ser

1

ggc ggt cag gac ctg cag ctg ccg ccg ggg ttc cgg ttc cac ccg acg    165

Gly Gly Gln Asp Leu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr

5                   10                  15

gac gag gag ctg gtg atg cac tac ctc tgc cgc cgc tgc gcc ggc ctc    213

Asp Glu Glu Leu Val Met His Tyr Leu Cys Arg Arg Cys Ala Gly Leu

20                  25                  30

ccc atc gcc gtc ccc atc atc gcc gag atc gac ctc tac aag ttc gat    261

Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys Phe Asp

35                  40                  45                  50

cca tgg cag ctt ccc cgg atg gcg ctg tac gga gag aag gag tgg tac    309

Pro Trp Gln Leu Pro Arg Met Ala Leu Tyr Gly Glu Lys Glu Trp Tyr

55                  60                  65

ttc ttc tcc ccg cga gac cgc aag tac ccg aac ggg tcg cgg ccg aac    357

Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg Pro Asn

70                  75                  80

cgc gcc gcc ggg tcg ggg tac tgg aag gcg acc ggc gcc gac aag ccg    405

Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp Lys Pro

85                  90                  95

gtg ggc tcg ccg aag ccg gtg gcg atc aag aag gcc ctc gtc ttc tac    453

Val Gly Ser Pro Lys Pro Val Ala Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Tyr

100                 105                 110

gcc ggc aag gcg ccc aag ggc gag aag acc aac tgg atc atg cac gag    501

Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Glu Lys Thr Asn Trp Ile Met His Glu

115                 120                 125                 130

tac cgc ctc gcc gac gtc gac cgc tcc gcc cgc aag aag aac agc ctc    549

Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Ala Arg Lys Lys Asn Ser Leu

135                 140                 145

agg ttg gat gat tgg gtg ctg tgc cgg att tac aac aag aag ggc ggg    597

Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys Gly Gly

150                 155                 160

ctg gag aag ccg ccg gcc gcg gcg gtg gcg gcg gcg ggg atg gtg agc    645

Leu Glu Lys Pro Pro Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Gly Met Val Ser

165                 170                 175

agc ggc ggc ggc gtc cag agg aag ccg atg gtg ggg gtg aac gcg gcg    693

Ser Gly Gly Gly Val Gln Arg Lys Pro Met Val Gly Val Asn Ala Ala

180                 185                 190

gtg agc tcc ccg ccg gag cag aag ccg gtg gtg gcg ggg ccg gcg ttc    741

Val Ser Ser Pro Pro Glu Gln Lys Pro Val Val Ala Gly Pro Ala Phe

195                 200                 205                 210

ccg gac ctg gcg gcg tac tac gac cgg ccg tcg gac tcg atg ccg cgg    789

Pro Asp Leu Ala Ala Tyr Tyr Asp Arg Pro Ser Asp Ser Met Pro Arg

215                 220                 225

ctg cac gcc gac tcg agc tgc tcg gag cag gtg ctg tcg ccg gag ttc     837

Leu His Ala Asp Ser Ser Cys Ser Glu Gln Val Leu Ser Pro Glu Phe

230                 235                 240

gcg tgc gag gtg cag agc cag ccc aag atc agc gag tgg gag cgc acc     885

Ala Cys Glu Val Gln Ser Gln Pro Lys Ile Ser Glu Trp Glu Arg Thr

245                 250                 255

ttc gcc acc gtc ggg ccc atc aac ccc gcc gcc tcc atc ctc gac ccc     933

Phe Ala Thr Val Gly Pro Ile Asn Pro Ala Ala Ser Ile Leu Asp Pro

260                 265                 270

gcc ggc tcc ggc ggc ctc ggc ggc ctc ggc ggc ggc ggc agc gac ccc     981

Ala Gly Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro

275                 280                 285                 290

ctc ctc cag gac atc ctc atg tac tgg ggc aag cca ttc tag            1023

Leu Leu Gln Asp Ile Leu Met Tyr Trp Gly Lys Pro Phe

295                 300

acgaccaaaa aaaaaaaaaa acaaccgcat tggcagcaat ggtgtcactg aacaccgtgc  1083

aggctagcta gcttcatggc cggtgaactt tgactcaggc gagccgccgg agttgactca  1143

aagataatta aaagaagtgt tttaagtgga ttggattgga ttagacagag gagatgagga  1203

ctcgagaaag gcggcgatga gaccgtggtt ggggggaccc tggcctggac tgaacgacga  1263

cgaggcagca gcagaaagat ggtgcaattg catcgggtgg catgtcagtg tgtgtgtata  1323

gtggcatgta catagtacat ggtgattgat tcggtataca gggggctagc tttcctgttt  1383

ctgtttcttc attggttaat tattactccc attataaggt cttcttcagg gttgctagct  1443

taattaatta attaattagc ccagtggttg aagtgtaagt caaaattcat caagtcagag  1503

actggaataa tacaatacag tactgc                                       1529

<210>2

<211>303

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>2

Met Ser Gly Gly Gln Asp Leu Gln Leu Pro Pro Gly Phe Arg Phe His

1               5                   10                  15

Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Met His Tyr Leu Cys Arg Arg Cys Ala

20                  25                  30

Gly Leu Pro Ile Ala Val Pro Ile Ile Ala Glu Ile Asp Leu Tyr Lys

35                  40                  45

Phe Asp Pro Trp Gln Leu Pro Arg Met Ala Leu Tyr Gly Glu Lys Glu

50                  55                  60

Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Arg Asp Arg Lys Tyr Pro Asn Gly Ser Arg

65                  70                  75                  80

Pro Asn Arg Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Trp Lys Ala Thr Gly Ala Asp

85                  90                  95

Lys Pro Val Gly Ser Pro Lys Pro Val Ala Ile Lys Lys Ala Leu Val

100                 105                 110

Phe Tyr Ala Gly Lys Ala Pro Lys Gly Glu Lys Thr Asn Trp Ile Met

115                 120                 125

His Glu Tyr Arg Leu Ala Asp Val Asp Arg Ser Ala Arg Lys Lys Asn

130                 135                 140

Ser Leu Arg Leu Asp Asp Trp Val Leu Cys Arg Ile Tyr Asn Lys Lys

145                 150                 155                 160

Gly Gly Leu Glu Lys Pro Pro Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Gly Met

165                 170                 175

Val Ser Ser Gly Gly Gly Val Gln Arg Lys Pro Met Val Gly Val Asn

180                 185                 190

Ala Ala Val Ser Ser Pro Pro Glu Gln Lys Pro Val Val Ala Gly Pro

195                 200                 205

Ala Phe Pro Asp Leu Ala Ala Tyr Tyr Asp Arg Pro Ser Asp Ser Met

210                 215                 220

Pro Arg Leu His Ala Asp Ser Ser Cys Ser Glu Gln Val Leu Ser Pro

225                 230                 235                 240

Glu Phe Ala Cys Glu Val Gln Ser Gln Pro Lys Ile Ser Glu Trp Glu

245                 250                 255

Arg Thr Phe Ala Thr Val Gly Pro Ile Asn Pro Ala Ala Ser Ile Leu

260                 265                 270

Asp Pro Ala Gly Ser Gly Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser

275                 280                 285

Asp Pro Leu Leu Gln Asp Ile Leu Met Tyr Trp Gly Lys Pro Phe

290                 295                 300