用于在一次性卡盒中进行集成式自动DNA或蛋白质分析的布置、所述卡盒的制备方法和使用所述卡盒进行DNA或蛋白质分析的操作方法

摘要

使用一种具有一微型通道和/或微型空穴系统的卡盒(卡片)进行自动DNA或蛋白质分析，其中，所述微型通道或微型空穴具有用于容纳干燥试剂的几何结构。就工业生产而言，所述卡盒例如通过注模成型用一平面卡片底板制成。将所述试剂装入敞开的通道内，对其进行干燥处理，再用一膜密封所述通道。借此可为一完成的卡盒配备一试样，通过将所述卡盒插入一读出设备即可开始全自动的测量过程。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于在一次性卡盒中进行集成式自动DNA或蛋白质分析的布置。其中，所谓的“卡盒”指的是一储蓄卡形式的平面卡片。此外，本发明还涉及一种制备所述卡盒的方法。最后，本发明还涉及一种使用所述卡盒进行DNA或蛋白质分析的操作方法。

背景技术

为进行以解答人类基因问题为目的的核酸分析，例如对全血中的白细胞的分析，必须先在作为试样制备步骤的第一阶段使细胞破碎，随后将在此过程中释放出来的DNA分离。第二阶段是进行用于选择性DNA繁殖(扩增)的PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)，借此将需要检测的DNA的浓度提高至足以在第三阶段时对其进行检测的程度。

最后几个分步骤在实验室中是根据已知的现有技术分开进行的。上文所述的三个阶段都包括多个工作步骤，且彼此独立由不同仪器实施。各工作步骤大部分为手动实施的。

这些步骤的实现依赖于实验室仪器的存在，例如一细胞破碎仪、一PCR仪(即所谓的热循环器)、可能需要的一适用于定量PCR的PCR仪、一电泳仪、杂交台、一光阅读器、所谓的Eppendorf管、多个移液器与一用于冷却试剂的冷却盒，并且必须由受过训练的人员在遵守有关感染危险、废物处理或诸如此类的安全规章的情况下实施。尤其是必须对试剂溶液进行多次测定体积(即精确)的调配(移液)。这些步骤不仅费时，且成本高昂。

现有技术中已知有用于生化分析的设备，其根据WO 02/073153 A1特别使用基于硅的测量模块，这些测量模块可集成在一芯片卡中。另外，根据WO 02/072262 A1，进行分析所需使用的试剂已以干燥存放的形式集成在分析模块内。

发明内容

因此，本发明的目的是在一小型卡盒中实现一成本低廉、操作简单的完整DNA或蛋白质分析过程。特别要实现下列相对于实验室方法的改进：

—将所有物质(可能情况下除水之外)全部集成在一封闭的一次性卡盒中；

—在室温条件下以储存稳定的形式准备试剂；

—所有步骤在卡盒中自动进行；

—除分析用试样(例如血液)的注入外，不存在手动工作步骤；

—与有损健康的物质之间不发生直接接触(血液和试剂废物废物滞留在卡盒中)；

—卡盒的几何结构允许进行快速有效的热循环；

—所有检测过程以电方式进行，且易于读取；

—所用卡盒尺寸较小，制备成本低廉。

根据本发明，这个目的通过一种根据权利要求1所述的带有一卡盒的布置而达成。权利要求34涉及的是所述卡盒的制备方法。所述卡盒的操作方法是独立权利要求38和42的说明对象。其中，权利要求38针对DNA分析，权利要求42针对蛋白质分析。各从属权利要求说明的是所述布置、所述制备方法和分析过程中的操作方法的改进方案。

本发明特别以WO 02/072262 A1及其所述的其他现有技术为出发点。这一文献对一种分析设备进行了说明，所述分析设备带有干燥储存在流体通道内、在室温条件下稳定的试剂，正常使用所述试剂前加入水将其调成溶液。本发明还以未公开的DE 10 2004 021780 A1和DE 10 2004 021822 A1为出发点。此外，使用可以电方式读取的检测模块也是一种已知方法。

与此不同，本发明涉及的是一种具有一由微型通道和/或微型空穴构成的系统的一次性卡盒，所述系统用于接收试样后进行一预定的处理过程，其中，所述卡盒具有用于容纳干燥试剂的结构，所述结构分配有用于进行细胞破碎和PCR的构件以及用于进行电化学检测的构件。其中，所述通道特别具有各种针对问题的结构。尤其是破碎通道有利地具有能使干燥试剂达到最佳湿润效果的阶梯形横截面，而PCR室和Elisa试剂通道则具有盆形凹陷。

借此可达到在一操作过程中进行试样引入和制备、DNA扩增和真正意义上的DNA检测的目的。

通过本发明用于容纳干燥试剂的微型通道或微型空穴几何结构系统可获得适合进行DNA分析和蛋白质分析的条件。所述系统包括下列重要特征和措施：

—送入微型通道或微型空穴中的试剂为蒸气压力可忽略的可干燥物质。由于所述物质在室温条件下保持稳定，因而其也保持有适合进行细胞破碎和/或PCR和/或检测的特性。另外，由所述物质与添加物构成的混合物可形成薄膜，且所述混合物可用石蜡薄层水密覆盖。

根据本发明，所述试剂添加物在制备卡盒时就以干燥物质的形式送入卡盒通道的凹陷中。由此产生的优点在于：

—制备卡盒时对试剂简单而精确的应用；

—充填试剂通道时对试剂的保护，也就是说，保证试剂不会被水流冲走，而是在充填整个通道过程中都保持。通道充填过程完毕后才通过扩散过程溶解试剂斑点，从而产生一均匀的试剂溶液。

根据另一特别的实施方式，凹陷以预先选定的间距沿试剂通道定位。其中，所述间距可等距布置或特别优选按一可变的间距样式布置。

可优选用剂量可变的干燥试剂充填凹陷。通过将不同的干燥试剂剂量与凹陷的间距样式相结合，可经调节后使制成的试剂溶液具有预期的浓度分布。

为实现某些特定功能，例如有磁珠和溶解试剂参与的细胞破碎，要求不可溶解的成分(即磁珠)必须均匀分布在干燥试剂中。为此，以悬浮物形式将磁珠分配入溶解通道。溶剂蒸发时可观察到，磁珠退回到溶解通道的边缘区域中，因此而无法形成均匀的分布。通过将溶解通道横截面建构成阶梯状结构，可使磁珠分布在各梯级上，从而形成均匀的分布。

为达到可借助本发明的卡盒进行细胞破碎、PCR和所谓的DNA/蛋白质ELISA试验，优选的做法为，微型通道或微型空穴中存在具有DNA结合特性的基质，尤其是DNA结合磁珠。其中，溶解试剂和磁珠可共同包含在一唯一的干燥基质(Matrix)中。此外，卡中还存在用于ELISA分析的试剂。具体而言，ELISA分析需要两种试剂，即作为第一试剂的标记酶和作为第二试剂的酶基质。

卡盒中特别布置有一用于对杂交过程进行电检测的检测模块。所述检测模块优选由一贵金属/塑料复合物或一具有贵金属电极的半导体处理硅芯片构成。其中，电化学测量方法、磁测量方法或压电测量方法特别适用于进行电检测。

为应用本发明，在本发明的卡盒中特别存在一用于输入一全血试样的输入口。此外还存在用于输送水的构件，例如可连接在一外设供水设备或一集成式蓄水器上的流入口。微型通道或微型空穴中的干燥缓冲物质在供水后具有选定离子强度。

在将本发明用于分析全血中的白细胞时，优选存在用于将一全血试样与水或一缓冲溶液混合的构件。同时，存在用于使血液或血液/水混合物或血液/缓冲物混合物流经涂覆有溶解/磁珠试剂的微型通道或微型空穴的构件。

此外，针对专为DNA分析而须在本发明的卡盒中进行PCR的情况，还存在用于生成一磁场来将DNA/磁珠复合体固定在一PCR空穴中的构件。为达成这一目的，所述PCR空穴必须可以适当的方式封闭，且必须存在用于进行热循环的构件。

最后，本发明的卡盒中必须存在用于存放使用过的试样材料和使用过的试剂的构件，这些构件构成废物储存器。同时，所述构件必须适用于对至少一个废物储存器进行抗菌、无细胞或无微粒式排气。为在一并非为本发明涉及对象的读取设备中对卡盒进行读取，最后还必须存在用于固定卡盒的构件。

附图说明

下面借助附图所示的实施例并结合权利要求对本发明的其他特点和优点进行说明，其中：

图1为一卡盒及其各个微型通道/微型空穴系统的一概要图，所述微型通道/微型空穴系统带有相应的功能标示；

图2为一细胞破碎通道的俯视图；

图3为图5所示的细胞破碎通道的横截面图；

图4为通流通道横截面的两种可选方案的放大图；

图5为图1所示的PCR室的俯视图；

图6和图7为图5所示的PCR室的横截面图；

图8为图1所示的一ELISA试剂通道的俯视图；

图9和图10为图8所示的ELISA试剂通道的横截面图；以及

图11至图23为图1所示的卡盒在进行一自动分析过程中处于各处理状态时的俯视图。

具体实施方式

相同的或作用相同的元件在各附图中用相同的参考符号表示。下文将图1至图10以及图11至图23结合在一起说明。

图1显示的是一用于进行ELISA(“Enzyme Linked Immuno SorbentASSAY”，“酶联免疫吸附”)试验的卡盒100和存在于其中的微型通道或微型空穴系统的正视图，其中，为清晰起见，额外图示有相应的功能标示。具体而言，卡盒100由一带有流体结构的塑料底板101构成，所述流体结构上覆盖有一塑料膜。下文中将借助图2至图10对所述结构加以说明。

从图1所示的俯视图中可以看到上面连接有一分配段105的一试样入口102，通过所述试样入口可用选定方式送入特别用于核酸分析的液态试样，所述液态试样例如用于以解答人类基因问题为目的对全血中的白细胞进行分析。所述分配段上依次连接有一用于对试样进行细胞破碎的通道区110与一以进行DNA分析为目的的区域120，在这一区域内可进行用于选择性DNA繁殖(扩增)的PCR，借此将需要检测的DNA的浓度提高至足以在第三阶段时对其进行检测的程度。通过阀122、122′可将真正意义上的PCR室密封。在区域130中特别根据ELISA法对通过这种方式制成的试样进行检测。

从图1中还可看到入水口103至103。准备试样时可通过这些入水口在卡盒100中输入用作输送剂和溶剂的水。此外，还存在排气口104至104。

如上文所述，卡盒100特别具有一用于输入一全血试样的输入口102。另外存在用于引入水的构件。可存在一与一外设供水设备相连的流入口，或者存在一与一集成式蓄水器连接的馈入口。

正常情况下，微型通道或微型空穴101至131中充填有干燥的缓冲物质，其确保在供水后具有选定离子强度。为进行血液分析，存在有用于将全血试样与水或缓冲溶液混合的构件和/或用于使血液或血液-水混合物或血液-缓冲物混合物流经一涂覆有溶解磁珠试剂的微型通道或微型空穴的构件。

通道系统中设置有用作可容纳废物的储存器的较宽区域106、107、108、109。此外，还存在有一带有通道131或131′的区域，所述通道用于容纳不同的ELISA试剂。

图2至图4所示的参考符号101仍表示卡盒底板。所述底板包括一专门用于细胞破碎(“溶解”)、以特殊方式成形的通流通道111，所述通流通道具有由侧边构成、用于容纳试剂的阶梯状凹陷112。其中，所述凹陷具有多个级高为10μm至500μm的梯级，凹陷延伸度约为ca.1mm，深度约为100μm。

图4a显示的是一可选方案，即，在通流通道没有附加凹陷的情况下只将通流通道111的边缘区域113用于容纳溶解试剂。与此不同，图4b所示的试剂特别还含有用于结合被释放的DNA的磁珠，且均匀分布在通流通道111上的梯级112之间。如果磁珠接受过相应的预处理，其就具有DNA结合和蛋白质结合的特性。磁珠上可涂覆DNA结合的特性，必要时也可涂覆抗体。至于引入干燥物质作为含有溶解试剂与磁珠的基质的方法，特请参见申请人先前的专利申请DE 10 2004 021780 A1和DE 10 2004 021822。

图5至图7显示的是卡盒底板101中的一PCR室120的结构，其具有流体通道111。此处未对正常使用时用于封闭PCR室的阀布置进行显示。PCR室120中必须存在圆柱形凹陷124、124′，其用于容纳进行PCR所需的特殊试剂127、127′。特别如图7所示，一干燥的可储存的并且在室温条件下稳定的PCR试剂127、127′上先覆盖有一石蜡层128、128′。

具体而言，申请人具有相同申请优选权的平行申请DE 10 2004 050576.4和DE 10 2004 050510.1对在一卡盒中通过阀控热循环来正确进行PCR的方法进行了说明，这两份申请在此以引用的方式并入本文中。其中特别对用于DNA结合的磁珠的应用以及通过可控磁场并借助PCR室120中的DNA来聚集磁珠的方法进行了说明，在此就不再赘述。

图8至图10显示的是图1所示的ELISA试剂通道131和131′的构造和结构。如图9所示，盆形凹陷132至132⁶′适用于容纳预先分配的预定剂量的ELISA用试剂。这在开篇描述现有技术时所提及的WO 02/072262 A1中已详细说明，这份申请同样以引用的方式并入本文中。在图10中，圆柱形凹陷132至132⁶′已充填有干燥试剂133至133⁶′。其中，如借助特殊的捕获探针对必要时通过PCR进行试样杂交所要求的那样，第一试剂实现标记酶，第二试剂实现酶基质。在仅用示意表示的检测区130中，用于检测生化反应的不同传感器可位于一由贵金属/塑料复合物构成的模块中。特别在用半导体处理芯片(尤指硅基传感器)进行电化学测量时，可以电方式检测信号，并直接对其进行再处理。除电化学测量方法外，还可使用通过相关传感器而实现的磁测量方法和/或压电测量方法。

图11至图23显示的均是图1所示的卡盒100的俯视图，其中，卡盒100中参与分析过程的区域分别有所标示：为此将卡盒100插入一附图未作详细图示的分析设备内，所述分析设备并非为本专利申请的涉及对象。

下面借助十一个具体操作步骤a)至m)对分析过程进行说明，进行分析前先将卡盒插入一具有用于容纳卡盒的构件的分析设备中，将卡盒固定在分析设备中后，分析设备便开始工作。结合图1，具体有以下几个步骤：

a)约注入10μl血液作为测量试样。通过分配毛细管自动分配成1μl。

b)将剩余血液冲入空腔106(废物1)。

c)接着用水稀释1μl血液试样，并将其输入细胞破碎通道110。在此进行血液细胞的细胞破碎(溶解)和被释放的DNA与磁珠的结合。

d)接着将磁珠输入PCR室，并在此处聚集磁珠。进行一清洗过程，其中，将清洗溶液汇集在空腔107(废物2)中。

e)结束清洗过程。

f)接着封闭PCR室阀122、122′，并进行PCR。

g)进行PCR的同时在含有酶基质的ELISA试剂通道131内注水。

h)进行PCR的同时在含有标记酶的ELISA试剂通道131′内注水。

i)PCR结束后打开PCR室阀122、122′，引导PCR产物流过检测模块130，在此处借助特殊的捕获探针进行杂交(形成废物3，通道108)。

j)进行从酶基质通道至废物通道108(废物3)的排气。

k)进行从标记酶通道至废物通道108(废物3)的排气。

l)标记酶溶液经过用于进行标记的检测模块130流动至废物区109(废物4)内。

m)酶基质溶液经过对杂交过程进行酶-电化学检测的检测模块130流动至废物区109(废物4)内。

分析过程至此结束。特别在进行电化学检测时，可以电方式读取生成的信号，并由处理器按规定程序分析所述信号。

根据图1详细借助通道和空穴说明的卡盒例如通过注模成型工艺用一聚合材料制成，所述聚合材料例如为聚碳酸酯。其中，先制备具有朝上敞开结构的卡片底板101，将试剂置入起初敞开的通道或空穴内，再对试剂进行干燥处理。以适当的方式将检测模块装入卡盒内，尤其是粘附在卡盒中。最后，例如用一弹性膜覆盖在通道和空穴的上方，从而使其达到可进行正常使用时的封闭状态。

也可在卡盒封闭和制成之前，在覆盖物侧上在敞开的卡片基板101上安装某些例如用作密封材料和/或排气材料的特殊设备。

借助图11至图23所示的对一全血试样的特殊DNA分析示例对具体的测量方法进行说明。通常将所述卡盒用于DNA分析和/或蛋白质分析，其中，(如上文所述)使用一适当的读取设备和相应的分析算法。借此可产生选定的操作方法，通过所述操作方法可将借助示例加以说明的卡盒实用地用于医学上的“Point of Care(床旁分析)”的分散性应用中。

最后，专门针对DNA分析对上文详细说明的卡盒的集成式操作方法进行总结，所述操作方法可归结为下列各分步骤的组合：

—将试样装入卡盒

—将卡盒插入读取设备

—开始全自动的分析过程

—通过分配段进行试样分配

—清洗分配段

—稀释试样，并将其送入溶解通道

—滞留在溶解通道中

—通过磁珠聚集器将DNA-磁珠复合体聚集在PCR室中

—用水清洗DNA-磁珠复合体

—封闭PCR室

—进行PCR

—进行PCR时：在两个ELISA试剂通道中注水

—打开PCR室

—将PCR产物输送入检测室

—在检测室中进行杂交

—对两个ELISA试剂通道进行排气

—用ELISA试剂1填满和清洗检测室

—用ELISA试剂2填满和清洗检测室

—进行电化学测量。

进行电化学测量时，先用载有酶标记的抗体溶液(ELISA试剂1)彻底清洗检测室。再用酶基质(ELISA试剂2)清洗检测室。在可事先规定的不同温度下和在酶基质溶液流速可变的情况下，以已知方式进行电化学测量。

进行蛋白质分析时使用相应的操作方式，不过在此情况下不使用PCR。