溶解的UDCA在局灶缺血模型中的神经保护作用

摘要

本公开提供了治疗、改善或减轻向脑血流损失相关的至少一种症状的组合物和方法，所述向脑血流损失包括但不限于缺血性卒中。本公开的组合物可包含胆汁酸化合物和碳水化合物，其中这两种物质在所选pH值范围内的溶液所有pH值保持在溶液中。症状可包括梗塞体积、功能恢复、细胞凋亡和/或eNOS表达。

说明书

技术领域

本发明公开涉及提供可降低卒中的一或多种胆汁酸的澄清水溶液的系统和方法。

背景技术

根据最近美国统计，估计每年有超过400,000名首次卒中的患者。此外，卒中是残疾的首要原因并且是引起死亡的第三主要原因。男性比女性患卒中的风险更高。所有卒中的约80％可能是急性缺血性卒中(由于，例如，颅内血栓或颅外栓塞)。所有卒中的约四分之一发生在65岁以下的个体中，卒中是老年性疾病的看法是有些争议的。

向脑灌注丧失之后的最初几秒到数分钟可发生缺血级联反应。缺少治疗性介入，将导致神经损伤。该损伤可分为两个区域，产生不可逆损伤的梗塞区和损伤是可逆性的缺血半影。然而，在血循环丧失后的数小时和数天内，如同在梗塞区一样，半影损伤也变为不可逆。

发明内容

因此，存在对降低梗塞体积和/或保护神经功能的治疗的需要。所以，本发明涉及在缺血性卒中后可降低梗塞体积和/或增强功能恢复的胆汁酸组合物。在一些实施方案中，不局限于任何特定的作用机理，这可通过抑制细胞凋亡和/或增强eNOS表达起作用。一方面，本发明提供包含以下成分的组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，和(3)足量的水溶性淀粉转化产物，使得胆汁酸和淀粉转化产物存在选定pH范围内的任何pH值保持在溶液中。

本发明还涉及包含以下成分的组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，和(3)足量的水溶性非淀粉多糖，使得胆汁酸和多糖存在于所选pH范围内任何pH值的溶液中。

本发明还涉及包含以下成分的药物组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，(3)药学上适量的药物化合物，和(4)足量的水溶性淀粉转化产物和水溶性非淀粉多糖，使得胆汁酸、药物化合物和碳水化合物在选定pH范围内的任何pH值保持在溶液中。根据本发明的一个非限定性实施方案，药物化合物可以是抗卒中治疗分子或混合物。

本发明还涉及胆汁酸组合物的溶液剂型。这些溶液剂型可显示胆汁酸的生物利用度和/或吸收性和/或膜通透性提高。这些溶液剂型还可显示药物化合物的生物利用度和/或吸收性和/或膜通透性提高。此外，胆汁酸的存在可降低或消除药物的毒性和/或副作用。

在本发明的一些实施方案中，提供包含以下成分的组合物：(1)胆汁酸、胆汁酸衍生物、胆汁酸盐或与胺结合的胆汁酸，(2)水，和(3)足量的碳水化合物，使得胆汁酸组分和碳水化合物在选定pH范围内任何pH值保持在溶液中，其中该碳水化合物是水溶性淀粉转化产物和水溶性非淀粉多糖的组合。在既包含可溶性非淀粉多糖又包含大分子量淀粉转化产物的实施方案中，每种的量使得当它们一起组合在组合物中时，足够允许胆汁酸成分、大分子量淀粉转化产物、可溶性非淀粉多糖和药物化合物(如果有)在选定pH范围内的任何pH值保持在溶液中。

在本发明的一些实施方案中，提供可提高对药物的反应强度或药物功效的组合治疗组合物。这种组合物可允许施用更低剂量的药物化合物、在不同点攻击疾病综合症状、影响药物化合物的清除和/或改变药物化合物的吸收。在一些实施方案中，本发明的组合物可导致或有助于降低药物的毒性和/或副作用。

在一些实施方案中，本发明涉及降低患有缺血性卒中或具有缺血性卒中风险的对象中缺血性卒中梗塞体积的方法。这些方法可包括向对象施用包含以下成分的组合物：(a)胆汁酸物质，其选自胆汁酸、胆汁酸水溶性衍生物、胆汁酸盐和通过酰胺连接与胺结合的胆汁酸；(b)碳水化合物，其选自水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖；和(c)水，其中胆汁酸物质和碳水化合物在所选pH范围内的溶液所有pH值都保持在溶液中，并且其中梗塞体积被减小。

在一些实施方案中，本发明涉及提高患有缺血性卒中或具有缺血性卒中风险的对象中功能恢复的方法。根据一些实施方案，功能恢复可包括但不限于任何神经、认知、感觉和/或运动功能的任何恢复。这些方法可包括向对象施用包含以下成分的组合物：(a)胆汁酸物质，其选自胆汁酸、胆汁酸水溶性衍生物、胆汁酸盐和通过酰胺连接与胺结合的胆汁酸；(b)碳水化合物，其选自水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖；和(c)水，其中胆汁酸物质和碳水化合物在所选pH范围内的所有pH值都保持在溶液中，并且其中功能恢复被改善。

根据一些实施方案，本发明涉及在患有缺血性卒中或具有缺血性卒中风险的对象中增加eNOS表达而减小梗塞体积的方法。这些方法可包括向对象施用包含以下成分的组合物：(a)胆汁酸物质，其选自胆汁酸、胆汁酸水溶性衍生物、胆汁酸盐和通过酰胺连接与胺结合的胆汁酸；(b)碳水化合物，其选自水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖；和(c)水，其中胆汁酸物质和碳水化合物在所选pH范围内的所有pH值都保持在溶液中，并且其中eNOS表达增加。

在一些实施方案中，本发明涉及在患有缺血性卒中或具有缺血性卒中风险的对象中增强功能性抑制细胞凋亡和增加eNOS表达的方法。这些方法可包括向对象施用包含以下成分的组合物：(a)胆汁酸物质，其选自胆汁酸、胆汁酸水溶性衍生物、胆汁酸盐和通过酰胺连接与胺结合的胆汁酸；(b)碳水化合物，其选自水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖；和(c)水，其中胆汁酸物质和碳水化合物在所选pH范围内的所有pH值都保持在溶液中，并且其中细胞凋亡降低和eNOS表达增加。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗患有缺血性卒中或具有缺血性卒中风险的对象中缺血性卒中(例如治疗、改善或减轻缺血性卒中相关的至少一种症状)的方法。这些方法可包括向对象施用包含以下成分的组合物：(a)胆汁酸物质，其选自胆汁酸、胆汁酸水溶性衍生物、胆汁酸盐和通过酰胺连接与胺结合的胆汁酸；(b)碳水化合物，其选自水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖；和(c)水，其中胆汁酸物质和碳水化合物在所选pH范围内的所有pH值都保持在溶液中，并且缺血性卒中(例如缺血性卒中的至少一种症状)得以治疗。

根据一些实施方案，本发明涉及向对象脑中递送胆汁酸物质的方法(例如跨过血脑屏障)。这些方法可包括向对象施用包含以下成分的组合物：(a)胆汁酸物质，其选自胆汁酸、胆汁酸水溶性衍生物、胆汁酸盐和通过酰胺连接与胺结合的胆汁酸；(b)碳水化合物，其选自水溶性淀粉转化产物或水溶性非淀粉多糖；和(c)水，其中胆汁酸物质和碳水化合物在所选pH范围内的所有pH值都保持在溶液中，并且胆汁酸物质被递送到脑中。

附图说明

专利申请文件包含至少一个彩色附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开将根据请求并支付必要费用后由美国专利商标局提供。

可通过部分参考以下说明和附图来理解本发明的一些具体实例实施方案，其中：

图1A显示用Nissl染色的大鼠脑冠状截面；

图1B显示再灌注后2天和7天时梗塞体积的图示(数据表示为平均值±SD(分别为n＝6))；

图2A显示旋转爬杆试验(Rotarod test)结果的图示(每组9只大鼠；星号(“*”)表示P＜0.05；Mann-Whitney U检验)；

图2B显示改良肢体平衡试验(modified limb placing test，MLPT)结果的图示(每组9只大鼠；星号(“*”)表示P＜0.05；Mann-WhitneyU检验)；

图3A显示TUNEL标记后缺血半影中细胞的显微图；

图3B显示对侧和同侧半球的每个视野中TUNEL阳性细胞数的图示(数据表示为平均值±S.D.(条)值)；

图3C显示在每个治疗组观察到的caspase活性(任意单位)的图示(数据表示为平均值±S.D.)；和

图4显示通过Western印迹分析检测的eNOS表达。

具体实施方式

熊脱氧胆酸(3α-7β-二羟基-5β-胆烷酸)(“UDCA”)是熊胆汁的主要成分，它和其它形式的胆汁酸是高度疏水性的。许多都不溶于生理和酸性pH(例如低于约pH8.4)的水溶液中。此外，虽然当口服施用时UDCA和其它胆汁酸可以被良好耐受，但是它们具有非常苦的和不愉快的味道和余味。

UDCA的药理作用可包括但不限于，剂量依赖性：(1)替换和/或取代毒性胆汁酸，(2)细胞保护作用，(3)稳定和/或保护细胞膜，(4)抗凋亡作用，(5)免疫调节作用(例如由于激活细胞内糖皮质激素受体)，(6)抗炎作用(例如由于阻遏NF-kB和抑制一氧化氮合酶的诱导)，(7)刺激胆汁分泌，和(8)刺激胞吐作用和胆管膜转运蛋白(canalicular membrane transporter)插入。

一些形式的胆汁酸可用作一或多种病症的治疗剂。例如，UDCA可用于治疗一或多种病症，包括但不限于，防治许多类型的肝病。其医药用途可包括溶解射线可透性胆结石以及一或多种胆汁郁滞性病症，其包括但不限于原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、妊娠肝内胆汁淤积、囊性纤维化相关肝病、儿科肝病和肝脏的慢性移植物抗宿主病。

虽然胆汁酸具有作为治疗活性剂和作为载体和/或助剂的这些有用的药理学特性，但是由于胆汁酸的溶解性和/或生物利用度较差，它的商业应用受到限制。例如，许多胆汁酸制剂包括或者作为片剂成分或者作为溶液或悬液中的颗粒和/或沉淀的固体形式的胆汁酸。这些制剂可包含在pH1到8时溶解性较差的胆汁酸结晶。结晶UDCA的溶解非常慢并且不完全。

一些情况下，所施用的UDCA只有少于约30％到约60％可被吸收。这主要发生在小肠中，通过溶解受限的被动非离子扩散进行。在腔内pH超过约8.4时可改善UDCA结晶的溶解，但是在胰腺或十二指肠分泌期间体内还不能达到该值。因此，许多现有形式的胆汁酸的生物利用度是不足的。这进而意味着在施用许多现有形式的UDCA后，在全身循环中胆汁水平是极低的。因此，对于全身递送UDCA而言，许多现有胆汁酸制剂只有有限的效用，并且对于向脑递送UDCA而言，甚至效用更低。

肝细胞可吸收并接合UDCA，然后在称为首过清除过程中将其分泌在胆汁中。从施用UDCA后约1h到约3h，胆汁中UDCA的浓度可达到峰值。胆汁中游离UDCA可被胆管细胞(cholangiocyte)重吸收。这种称为肝胆短路(cholehepatic shunt)的现象可能与胆汁碳酸氢盐分泌的增加有关。长期摄取后，胆汁中UDCA富集程度可能与其每日施用量有关。使用一些现有UDCA制剂，每日剂量超过10±12mg/kg可能不会进一步增加胆汁中UDCA的比例。这可能是由于其差向异构化为鹅脱氧胆酸和/或不能抑制肝脏合成初级胆汁酸。因此，使用现有UDCA制剂时随着UDCA剂量增加，UDCA的吸收实际上可能降低。因此，需要溶解度、生物利用度和/或膜通透性增强的胆汁组合物。此外，需要更少经受从UDCA到CDCA差向异构化的胆汁组合物。

根据本发明的一些实施方案，熊脱氧胆酸(UDCA)的盐、前体和/或衍生物对经受向脑组织血液供应中断的对象具有有益作用。胆汁酸向脑的治疗性递送可以受阻于UDCA的肠肝循环作用、极低的血液UDCA浓度和由于其强亲水性和酸性引起的膜通透性降低。本发明的实施方案提供可改善或克服这些弊端的胆汁制剂。

根据本发明的具体实施例实施方案，检验了溶解的胆汁酸制剂的神经保护作用。根据短暂性局灶缺血模型制备63只短暂性局灶缺血大鼠。再灌注后立即向5组大鼠静脉内单次施用不同剂量的溶解UDCA；分别为仅盐水、25mg UDCA/kg、100mg UDCA/kg、400mg UDCA/kg、400mg TUDCA/kg。在每一组中，测量梗塞体积和功能结果，并且获得脑用于胆汁酸分析。在用溶解的UDCA治疗的大鼠中，梗塞体积降低并且行为评分提高。在溶解UDCA治疗组中，观察到半影内TUNEL阳性细胞减少、caspase活性降低和脑中UDCA浓度高。因此，不限于任何特定的作用机制，溶解的UDCA可通过抗凋亡机制和/或抗炎作用对脑缺血发挥神经保护作用。

在一些实施方案中，可溶性胆汁酸可包括但不限于任何类型的水溶性胆汁酸。在一些实施方案中，胆汁酸盐可以是任何水溶性的胆汁酸盐。根据一些实施方案，通过上述的胆汁酸和胺反应可形成胆汁酸的溶于水的盐，所述胺包括但不限于脂肪族游离胺例如trientine、二乙烯三胺、四乙烯五胺和碱性氨基酸如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、和氨，以及氨基糖如D-葡萄糖胺、N-烷基葡萄糖胺，和季铵衍生物如胆碱，杂环胺如哌嗪、N-烷基哌嗪、哌啶、N-烷基哌啶、吗啉、N-烷基吗啉、四氢吡咯、三乙醇胺和三甲醇胺。根据本发明的一些具体实施例的实施方案，胆汁酸的水溶性金属盐、胆汁酸和环糊精及其衍生物的包合物、和水溶性O-磺化胆汁酸也可以包括在可溶性胆汁酸盐中。

本发明的可溶性胆汁酸衍生物可以是那些与相应的未衍生胆汁酸在水溶液中一样可溶或更可溶的衍生物。胆汁酸衍生物包括但不限于在胆汁酸的羟基和羧基与包括但不限于卤素和氨基的其它功能基团形成的衍生物。可溶性的胆汁酸可包括游离酸形式的胆汁酸和无机酸(例如氢氯酸、硫酸、磷酸和酸性磷酸盐)和/或有机酸(例如柠檬酸、酒石酸和醋酸)。

根据一些实施方案，胆汁酸可包括但不限于熊脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、胆酸、猪脱氧胆酸、脱氧胆酸、7-氧代石胆酸、石胆酸、碘代脱氧胆酸、iocholic acid、牛熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid)、牛鹅脱氧胆酸(taurochenodeoxycholic acid)、牛磺脱氧胆酸、牛磺石胆酸(taurolithocholic acid)、甘熊脱氧胆酸(glycoursodeoxycholicacid)、牛磺胆酸、甘氨胆酸及其在甾核上羟基或羧基处的衍生物。在一些实施方案中，然而，本发明的组合物可排除一种或多种前述胆汁酸(例如牛熊脱氧胆酸)。

在本发明的一些实施方案中，与现有制剂相比，在溶液中递送胆汁酸(例如UDCA)可达到更高的体内胆汁酸(例如UDCA)水平。因此，与现有制剂相比，胆汁酸(例如UDCA)的治疗潜能可更加充分的得以实现。由于胆汁酸可完全溶解在本发明的制剂中，因此在一些实施方案中，即使施用较低剂量，也可达到较高的体内胆汁酸水平。

根据一些实施方案，可通过任何有效模式向对象施用本发明的组合物，所述有效模式包括但不限于，

可通过任何有效模式施用激素，包括但不限于通过任何孔(orifice)和/或通过皮肤。例如，施用途径可包括口服施用、舌下施用、胃肠外施用、皮内注射、皮下注射、甲状腺内注射、静脉内注射、鼻内施用、透皮施用和跨结膜施用。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以有选自以下的形式：可吸收片(ingestible tablet)、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、薄片(wafer)、丸剂、颗粒、散剂、扁囊剂、乳剂、液体、气雾剂、软或硬明胶胶囊、无菌注射液、灭菌粉末等等。

在本发明的一些实施方案中，很多胆汁酸可用作单制剂。两种或更多种不同疏水活性的胆汁盐的混合物可表现为中等疏水活性的单种胆汁盐。结果，两种不同疏水活性的胆汁酸混合物的去污性质和毒性介于单个组分之间。

适用于本发明的碳水化合物可包括水溶性淀粉转化产物和水溶性非淀粉多糖。根据本发明的一些实施方案，水溶性淀粉转换产物可包括在不同pH条件下部分或不完全水解淀粉直接得到的碳水化合物。非限定性实例可包括麦芽糊精、糊精、液体葡萄糖、玉米糖浆固体(液体葡萄糖干粉)和可溶性淀粉。在一些实施方案中，碳水化合物可选自MALTRIN^M200、MALTRIN^M2050、玉米糖浆固体和MALTRIN^M700、MALTRIN^M040、MALTRIN^M050、MALTRIN^M100、MALTRIN^M150、MALTRIN^M180、麦芽糊精，这两种都可由GPC^，Grain Processing Corporation of Muscatine，Iowa制造。对于该实施方案，术语“玉米糖浆”可包括玉米糖浆和液体葡萄糖。如果淀粉转化产物是聚合物，该聚合物可具有至少一个还原末端和至少一个非还原末端并且可以是直链或支链。分子量可从约100质量单位到超过106质量单位。

根据本发明的一些实施方案，水溶性非淀粉多糖可在不同pH条件下通过不同的水解或合成机制得到。非限定性实例包括右旋糖酐、瓜耳胶、果胶、不可消化的可溶性纤维。如果是聚合物，该聚合物可具有至少一个还原末端和至少一个非还原末端，聚合物可以是直链或支链。分子量可从约100质量单位到超过106质量单位。

用于本发明实施方案的高分子量水溶性淀粉转化产物和/或可溶性非淀粉多糖的量是至少能使得制剂中所选用的胆汁酸在期望浓度和期望pH范围内可溶解的量。在本发明的一些实施方案中，防止UDCA沉淀所需的麦芽糊精与UDCA的大致最小重量比是6∶1(即在100mL水中每0.2g UDCA用1.2g、每1g UDCA用6g以及每2g UDCA用12g)。在本发明的一些实施方案中，麦芽糊精的大致最小量可以是30g每200mg鹅脱氧胆酸、12g每200mg 7-酮石胆酸、10g每200mg胆酸以及50g每200mg脱氧胆酸。在本发明的一些实施方案中，防止胆酸从本发明的水溶液剂型中沉淀所需的液体葡萄糖(商品light玉米糖浆)与UDCA的大致最小重量比可以是160∶1(即在100mL水中每500mg UDCA用80g、在200mL水中每500mg熊脱氧胆酸用80g)。主要根据溶液制剂中胆汁酸的绝对量而不是浓度来确定所需高分子量水溶性淀粉转化产物或可溶性非淀粉多糖的最小量。

在本发明的一些实施方案中，除了淀粉转化产物和/或非淀粉多糖以外，制剂可包含环糊精。在另一些实施方案中，本发明的组合物排除环糊精及其衍生物。

在本发明的一些实施方案中，制剂还包括膳食纤维。膳食纤维的非限定性实例可包括瓜耳胶、果胶、车前子(psyllium)、燕麦胶、大豆纤维、燕麦麸、玉米麸、纤维素和小麦麸。

在本发明的一些实施方案中，制剂还可包括乳化剂。在本发明的一些实施方案中，乳化剂可包括乳化剂和助悬剂。乳化剂的非限定性实例可包括瓜耳胶、果胶、阿拉伯胶、卡拉胶、羧甲基纤维素钠、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、黄原胶和失水山梨醇酯。

制剂不沉淀其胆汁酸、淀粉转化产物、可溶性非淀粉多糖和/或其药物化合物的所选pH范围可以是水溶液系统可获得的任何pH水平范围。例如，该范围可以是约pH1至约pH14或是约pH1至约pH10。在一些实施方案中，该范围可以是足以使药物制剂保持在溶液中的水溶液系统中可获得的pH水平范围的任何亚组。例如，根据施用方法，药物可以从制备、到施用、到体内吸收保持在溶液中。因此，所述组合物可用作药物制剂，其中在口腔、胃和肠中的主要pH水平中，药物化合物不沉淀而保持在溶液中。在本发明的一些实施方案中，在酸性条件下，胆汁酸保持溶解作为游离胆汁酸，尽管在酸性条件下，胆汁酸通常是不溶解的。

药物化合物可影响对另一种药物的反应(例如，定量或定性)。例如，当与胆汁酸共施用增加药物化合物治疗作用强度时，可发生定量作用。例如，当与胆汁酸共施用导致体内产生不同或另外的活性部分(moieties)时，可以发生定性作用。

根据本发明，可以考虑使用宽范围的药物。非限定性实例包括激素、激素拮抗剂、镇痛药、解热药、抗炎药、免疫活性药、抗新生药物、抗生素、抗炎剂、拟交感神经药、抗感染药、抗肿瘤剂和麻醉剂。非限定性实例还包括靶向或影响胃肠道、肝、心血管系统和呼吸系统的药物。药物化合物的非限定性实例还包括胰岛素、肝素、降钙素、氨苄青霉素、生长抑素八肽、柠檬酸西地那非、钙化三醇、双氢速甾醇、阿朴吗啡、育亨宾、trazadone、阿昔洛韦、盐酸金刚烷胺、盐酸金刚乙胺、西多福韦、甲磺酸地拉韦定、双脱氧腺苷、法昔洛韦、膦甲酸钠(foscarmet sodium)、氟尿嘧啶、更昔洛韦钠、碘苷、α-干扰素、拉米夫定、奈韦拉平、戊昔洛韦、利巴韦林、司他夫定、三氟尿苷、盐酸伐昔洛韦(valacyclovir)、扎西胞苷、齐多夫定、硫酸吲哚那韦、利托那韦、甲磺酸奈非那韦、甲磺酸沙喹那韦、d-青霉胺、氯喹、羟基氯喹、金硫葡萄糖、金硫丁二钠、醋硫葡金左旋咪唑、三嗪唑胺、异丙肌苷、甲基肌苷单磷酸盐、胞壁酰二肽、二氮嗪、盐酸肼苯哒嗪、米诺地尔、双嘧哌胺醇、盐酸异舒普林、烟酸、盐酸布酚宁、酚妥拉明、甲磺酸喹唑嗪、盐酸哌唑嗪、盐酸特拉唑嗪(terazocin.HCl)、盐酸可乐定、硝苯地平、吗多明、胺碘酮、乙酰水杨酸、维拉帕米、地尔硫、尼索地平(nisoldipine)、伊拉地平、苄普地尔、硝酸异山梨酯、戊四硝酯、硝酸甘油、西咪替丁、法莫替丁、尼扎替丁、雷尼替丁、兰索拉唑、奥美拉唑、米索前列醇、硫糖铝、盐酸灭吐灵、红霉素、铋化合物、前列地尔、沙丁胺醇、吡丁醇、硫酸特布他林、salmetrol、氨茶碱、二羟丙基茶碱、麻黄碱、乙基去甲肾上腺素、乙基异丙肾上腺素、异丙肾上腺素、异丙喘宁、奈多罗米、胆茶碱、茶碱、比托特罗、酚丙喘宁、布地缩松、氟尼缩松、倍氯美松双丙酸酯、丙酸氟地松、可待因、硫酸可待因、磷酸可待因、氢溴酸美沙芬、醋酸去炎松、孟鲁司特钠、扎鲁司特、苯噻羟脲、色甘酸钠、溴化异丙阿托品、奈多罗米钠苯甲酸盐、盐酸苯海拉明、重酒石酸二氢可待因酮、盐酸美沙酮、硫酸吗啡、乙酰半胱氨酸、愈创木酚甘油醚、碳酸铵、氯化铵、酒石酸锑钾、甘油、水合萜品、考佛塞尔棕榈酸盐、阿托伐他汀钙、cervastatin钠、氟伐他丁钠、洛伐他汀、普伐他丁钠、辛伐他汀、picrorrhazia kurroa、穿心莲(andrographis paniculata)、辣木(Moringa oleifera)、阔荚合欢(albizzia lebeck)、鸭嘴花(adhatodavasica)、姜黄(curcuma longa)、苦瓜(momordica charantia)、匙羹藤(gymnema sylvestre)、terminalia arjuna、印楝(azadirachta indica)、tinosporia cordifolia、甲硝唑、两性霉素B、克霉唑、氟康唑、氯丙炔碘、酮康唑、灰黄霉素、伊曲康唑、盐酸特比萘芬、硝酸益康唑、咪康唑、制霉菌素、硝酸奥昔康唑、硝酸硫康唑、二盐酸西替利嗪、地塞米松、氢化可的松、氢化泼尼松、可的松、儿茶素及其衍生物、甘草甜素、甘草酸、倍他米松、醋酸氟氢可的松、氟尼缩松、丙酸氟地松、甲基氢化泼尼松、生长抑素、赖甲环素(lispro)、胰高血糖素、胰岛素原、不可溶的胰岛素类、阿卡波糖、氯磺丙脲、格列吡嗪、格列本脲、盐酸二甲双胍、瑞格列萘、甲苯磺丁脲、氨基酸、秋水仙碱、磺吡酮、别嘌呤醇、吡罗昔康、托麦汀钠、吲哚美辛、布洛芬、二氟苯水杨酸、甲灭酸、萘普生和曲恩汀。

可以包括在本发明组合物中的药物化合物的另外的实例包括，但不限于，当加入到本发明制剂中时变得可溶或保持可溶的任何化合物、增强另一种药剂效力的任何化合物(例如通过放大期望反应、降低达到相同作用水平需要的剂量、使得作用机制多样化或增强吸收)，和降低药剂毒性的任何化合物(例如同时施用和/或在另外的时间施用)、根据本发明组合物包括另外的药物化合物的一些实施方案，溶液中的胆汁酸可用作助剂、载体或增强剂。例如，胆汁酸可增强另外的药物组合物的治疗作用或代谢。

在一些实施方案中，治疗活性剂可包括但不限于抗凝剂(例如茴茚二酮、双香豆素、华法林钠、柠檬酸葡萄糖溶液、达那帕罗钠、肝素钠)、纤维蛋白溶解抑制剂(例如氨基己酸、氨甲环酸)、抗血小板化合物(例如盐酸噻氯匹定、氯吡格雷重硫酸盐、表非替得、盐酸替罗非班)、钙通道阻滞剂(例如阿罗地平盐类、盐酸苄普地尔、盐酸地尔硫、非洛地平、硝苯地平)、皮质类固醇(例如倍他米松、地塞米松、氟氢可的松、氟尼缩松、氢化可的松)、神经节阻滞剂(例如盐酸美加明、樟脑磺酸替奥芬)、造血生长因子(例如红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子)、止血化合物(例如微纤维胶原、可吸收的明胶、凝血酶)、一氧化氮供体(例如L-精氨酸、一氧化氮合酶抑制剂)、血栓溶解剂(例如amciximab、阿替普酶、链激酶、尿激酶)、血管活性剂(例如二氮嗪、盐酸肼苯哒嗪、米诺地尔)、东方药物(例如丹参、灯盏花、抵当汤)和个体化合物(例如银杏叶(ginkgo biloba)、鲁贝鲁唑、甘露醇溶液、萘呋胺、己酮可可碱、丙戊茶碱、己可碱、吡拉西坦、前列环素、葛根素、sanchi、茶碱、氨茶碱、替利扎特、三氟醋柳酸、长春西汀)。

可以用pH调节剂进行本发明的一些实施方案。非限定性实例包括盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、醋酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、eidetic acid、磷酸盐和碱。

在本发明的一些实施方案中，改变制剂使得其可以作为液体、固体、粉末或片剂施用。在本发明的一些实施方案中，制剂包含在糖浆、稠糖浆或糊中。糖浆的非限定性实例是麦芽糊精溶液，其中麦芽糊精的浓度低于1.0kg/L。稠糖浆的非限定性实例是麦芽糊精溶液，其中麦芽糊精的浓度在1.0kg/L到1.2kg/L之间，其中包括端值。糊的非限定性实例是麦芽糊精溶液，其中麦芽糊精的浓度大于1.2kg/L。

在一些实施方案中，本发明的组合物可以与其它卒中疗法联合施用，所述其它卒中疗法包括但不限于支持性护理、神经并发症的治疗、抗血栓疗法、溶栓疗法和重组组织型纤维溶酶原激活剂(rt-PA)疗法。

根据本发明的一些实施方案，包含胆汁酸化合物和碳水化合物的水溶液是澄清的(即没有肉眼可见的沉淀)。根据一些实施方案，澄清度可以通过视觉检查和/或分光光度法评价(Dasta JF et al.，Am.J.Hospital Pharm.(1988)45：2361-2366)。根据使用分光光度法的实施方案，可以在任何有用波长包括但不限于260nm、400nm、580nm、680nm和720nm测定吸光度。在一些实施方案中，本发明溶液的吸光度与单独的水或含碳水化合物但不含胆汁酸化合物的水进行比较。在一些实施方案中，比较差异可小于0.1个吸光度单位，而在另一些实施方案中，可以小于0.05个吸光度单位。在一些实施方案中，差异可小于0.01个吸光度单位，或者甚至小于0.005个吸光度单位。

在一些实施方案中，本发明的胆汁溶液可以被干燥(“干s-UDCA)。可以通过冷冻干燥、蒸发或本领域已知的任何其它脱水方法从胆汁酸组合物的溶液制剂得到干燥形式。本发明的溶液可以进行部分干燥以产生半固体形式。该溶液可以彻底干燥以形成固体、粉末和颗粒。在一些实施方案中，干燥形式可具有其原始水含量的小于约20％。在一些实施方案中，干燥形式可具有其原始水含量的小于约10％。在一些实施方案中，干燥形式可具有其原始水含量的小于约5％。在一些实施方案中，干燥形式可具有其原始水含量的小于约1％。在一些实施方案中，干燥形式可具有其原始水含量的小于约0.2％。在一些实施方案中，水溶液的干燥形式可基本上无水。可通过流体方法、浅盘方法(tray process)、干燥方法和/或冷冻方法进行干燥。干燥形式可直接施用、作为固体剂型施用或在施用前与水结合进行施用。

在一些实施方案中，可根据2001年2月5日提交的美国专利申请No.09/778,154和/或2004年11月24日提交的美国专利申请No.10/996,945中公开的方法制备本发明的组合物，这两个专利的全部内容通过引用并入本文。

实施例

实施例1：可溶性UDCA制剂

制备包含完整UDCA和低葡萄糖效价的水溶性淀粉的溶解UDCA(s-UDCA)的澄清水溶液。简要地说，将6.48g氢氧化钠颗粒溶解在500ml纯化水中，接下来，在室温下，在搅拌条件下将60g UDCA溶解在该氢氧化钠溶液中。然后，将400g碳水化合物(麦芽糊精)一点点的加入到澄清溶液中并搅拌。在所得澄清溶液中加入适于药物制剂的量的甜味剂、防腐剂(和/或甜味剂和呈味剂)。用磷酸氢钠将澄清溶液的pH调节为7-7.5。加入纯化水使得总体积为1000mL。如果需要，通过0.22μm和GP plus膜的无菌杯式过滤器(stericup filterunit)过滤该澄清溶液。

实施例2：可溶性UDCA制剂

制备包含完整UDCA和低葡萄糖效价的水溶性淀粉的溶解UDCA(s-UDCA)的澄清水溶液。简要地说，将1.1g氢氧化钠颗粒溶解在500ml纯化水中，接下来，在室温下，在搅拌条件下将10g UDCA溶解在该氢氧化钠溶液中。然后，将500g碳水化合物(玉米糖浆固体)一点点的加入到澄清溶液中并搅拌。在所得澄清溶液中加入适于药物制剂的量的甜味剂、防腐剂(和/或甜味剂和呈味剂)。用磷酸氢钠将澄清溶液的pH调节为7-7.5。加入纯化水使得总体积为1000mL。

该组合物的Cmax为20.4μg/mL，比报道的NovartisPharmaceuticals，Newark，New Jersey生产的actigall高7倍。数据来自″Results of a phase I multiple-dose clinical study of ursodeoxycholicAcid″Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2004 May；13(5)：861-7。此外，该组合物显示比actigall小5.5倍的Tmax和高2,500倍的溶解度(50g/L)。表1显示实施例2中制剂与其他制剂的比较。

表1：口服施用后不同UDCA剂型在人中的药物动力学参数

  制剂 基质  AUC  Cmax  Tmax  Simoni  et al.  肠溶包衣 500mg UDCA  15.3μg  8h mL^-1  Parquet  et al.  胶囊 500mg UDCA  4.43  μg/mL  Panini  et al.  2-羟丙基-β-  环糊精配合物 426mg UDCA  8.1μg  4h mL^-1  6.1  μg/mL  63  分钟  商业片剂 450mg UDCA  3.8μg  4h mL^-1  2.9  μg/mL  83分钟  实施例  2  含碳水化合物的  液体制剂 500mg UDCA  23μg  4h mL^-1  20.4  μg/mL  15分钟 650mg UDCA  25.2μg  4h mL^-1  15  μg/mL  60分钟

实施例3：可溶性UDCA制剂

制备包含完整UDCA和低葡萄糖效价的水溶性淀粉的溶解UDCA(s-UDCA)的澄清水溶液。简要地说，将2.27g氢氧化钠颗粒溶解在100ml纯化水中，接下来，在室温下，在搅拌条件下将25g UDCA溶解在该氢氧化钠溶液中。分别地，将745g碳水化合物(麦芽糊精)一点点的加入到400mL纯化水中并搅拌直到溶解。将所得澄清碳水化合物溶液和UDCA钠盐溶液合并并搅拌。向所得澄清溶液中加入适于药物制剂的量的甜味剂、防腐剂(和/或甜味剂和呈味剂)。用磷酸氢钠将澄清溶液的pH调节为6.5-7.5。加入纯化水使得总体积为1000mL。

在90到95℃下，旋转蒸发仪中真空(1.3×10^-1Pa)干燥所得的溶液，得到溶解UDCA的干燥粉末形式。

实施例4：试验动物和可溶性UDCA的施用

用氯胺酮(300mg/kg)/盐酸甲苯噻嗪(4mg/kg)麻醉63只重约250g的Sprague-Dawley雄性大鼠(Genomics)，并通过面罩通20％氧气。动脉P_CO2维持在35到40mmHg，用发热垫控制直肠温度并维持在约37℃。大鼠自由饮水但是在手术前1天禁食过夜。

通过腔内线栓(intraluminal thread occlusion)法诱导大脑中动脉局灶性梗塞。简要地说，开切口以暴露左颈总动脉杈。确定并结扎翼突腭支。用具有硅酮涂敷末端的尼龙缝合线实现颈总动脉的栓塞。从外部颈动脉开始向前到内部颈动脉的内腔，直到阻塞大脑中动脉起源(Yanaka et al.，1996，J.Neurosurg.85：125)。监测大脑流动，如果流动相对于基线降低了75％就认为已栓塞。90分钟后彻底除去缝合线进行再灌注。

将大鼠分成5组，再灌注后，每组立即接受单次静脉内注射载体(n＝18)、25mg s-UDCA/kg(n＝9)、100mg UDCA/kg(n＝18)、400mg UDCA/kg(n＝9)、和400mg TUDCA/kg(n＝9)。

在恢复期间，评价大鼠的前肢屈肌(forelimb flexion)和对侧转圈来确认缺血。试验期间MCA栓塞后的任何时间都没有观察到抓挠现象。使用反馈调节加热系统维持直肠温度在37±0.5℃。麻醉恢复后自由进食和饮水。试验期间将大鼠放置在温度为24±0.5℃的通气笼中。2周后限制颗粒的量为30g/天以控制体重，直到28天为了高效(for theefficient)

实施例5：血浆和脑中的胆汁酸分析

注射s-UDCA、TUDCA或载体1小时后，收集血液和脑，并通过HPLC进行胆汁酸分析。简要地，取全血，凝结并离心，分离血浆并冷冻。适当的、人道麻醉(5％水合氯醛)和经心脏磷酸缓冲液灌注后，取脑，快速冷冻并保存于-70℃。通过HPLC(JASCO HPLC胆汁酸分析系统)测量游离UDCA的浓度。例如，根据2001年2月5日提交的美国专利申请No.09/778,154通过HPLC分析胆汁酸，该专利的全部内容通过引用并入本文。

结果如表2所示。与注射载体的对照动物的脑不同，随s-UDCA注射量的增加，注射UDCA的动物脑中UDCA浓度增加。注射25mgs-UDCA动物脑中观察到的UDCA浓度高于注射400mg TUDCA的动物。注射载体的对照动物脑中或血清中没有检测到游离UDCA。

表2.每组脑和血液中HPLC胆汁分析结果

  s-UDCA/  每只大鼠体重  大鼠脑组织中  游离UDCA的浓度  大鼠血液中  游离UDCA的浓度  峰保留  峰保留  (nmol/g  脑)  时间(分钟)  (μmol/L)  时间(分钟)  对照  0  -  0  -  UDCA 26mg/Kg  8.6  14.108  71.6  14.208  UDCA 100mg/Kg  9.5  14.108  165.2  14.217  UDCA 400mg/Kg  103.6  14.258  738.1  14.242  TUDCA 400  mg/kg  7.3  14.000  0  14.000

实施例6：行为试验

栓塞后第2天和第7天进行旋转爬杆试验和改良的肢体放置试验(MLPT)，如前所述(Jeong et al，.2003，Stroke 34：2258)。简要地说，预先训练3天被安排进行行为试验的大鼠，以减轻在旋转爬杆试验中的学习作用(Chen et al.，2001，Stroke 32：1005)。在旋转爬杆试验中，将大鼠置于加速中的旋转圆筒上(4-40rpm)，测定动物在转杆上停留时间，测定3次。

旋转爬杆试验数据在图2A中显示为与内部基线对照(缺血前)相比的最大持续时间百分比。当在第7天试验时，单接受载体的大鼠在圆筒上停留时间为基线时间的36.6％，而接受100mg/kg s-UDCA的大鼠的停留时间为基线时间的76.3％。

MLPT由两个肢体放置任务组成，其通过检查对触觉和本体感受刺激的反应评价前肢和后肢的感觉运动统合(sensorimotorintergration)(Jeong et al.；Song et al.，2003，Stroke 34：2215)。首先，每只大鼠悬吊在桌上10cm，观察并评价前肢向桌子的伸展情况：正常伸展，0分；非正常屈曲，1分。接下来，将每只大鼠置于桌子的边缘，将其前肢放置在桌子外并悬吊在桌子边缘，允许自由活动。轻轻降低每个前肢(前肢-第二任务，后肢-第三任务)并检查恢复和放置。最后，将每只大鼠放置在桌子边缘以检查前肢的侧向放置。以以下方式对3个任务进行评分：正常行为，0分；延迟(2秒)和/或不完全行为，1分；没有行为，2分；7分意思是指最大神经缺陷并且0分表示正常行为。结果如图2B所示。单独接受载体的动物的评分为3.2，而接受100mg/kg s-UDCA的大鼠的评分为1.5。

用s-UDCA处理的动物表现优于对照动物。此外，与25mg/kgUDCA组和400mg/kg TUDCA组相比，100mg/kg UDCA组的动物显示显著更好的行为。7天后的旋转爬杆和MLPT中，与对照组相比，100mg/kg s-UDCA处理组显示最佳行为，在25mg/kg s-UDCA组和400mg/kg TUDCA组程度较低(图2)。再灌注后第28天，旋转爬杆行为比预先训练水平改进80％，而注射载体的对照组显示40％(没有显示数据)。起始体重和在4周期间的那些相似。

实施例7：梗塞体积

行为试验后，取脑，用脑基质装置通过整个脑切1mm厚的系列切片。每个切片随后用Nissl染色。使用图像分析系统(Image-Pro Plus^TM，Media Cybernetics，Silver Spring，MD)示踪并测量每个切片的梗塞和对侧损伤(contralesional)区的皮层、纹状体和半球体积。使用计算机图像分析系统确定损伤程度和量。为了完成这个，得到每个切片的数字图像并通过描绘Nissl没有降低的区域描绘损伤区域。在坏死如此严重以至于实际上丢失组织的情况下，并因此不能直接评价边界，使用对侧的轮廓评估损伤的脑体积。通过Cavalieri法计算梗塞的总体积。

明确确定的灰(pale)区，被认为是梗塞，可在左半球看到(图1A)。接受100mg s-UDCA的动物，尤其在皮层中，在第2天时梗塞体积显著降低(图1A)。

100mg s-UDCA处理组在第2天的平均梗塞体积(41.03±29.2mm³)小于注射载体的梗塞的一半(90.59±33.03mm³，P＜0.05)(图1B)。再灌注后第7天观察到相似的结果；对照组86.64±18.78mm³、25mg s-UDCA组39.07±26.36mm³、100mg UDCA组26.87±26.63mm³(图1B)。而400mg s-UDCA组中动物的梗塞体积小于对照组中动物，在该具体试验中的差异可能没有统计学显著性。

实施例8：TUNEL染色

再灌注后第2和7天，使用TUNEL定量凋亡细胞。使用DNA片段检测试剂盒(cat.no.QIA33；Oncogene，Boston，MA，USA)完成TUNEL。在100μl 3％ H₂O₂中浸入5分钟后，在增湿室中37℃下在TdT标记反应混合物(试剂盒提供)中孵育切片90分钟，然后在终止缓冲液中37℃下孵育5分钟。PBS洗涤切片，然后在封闭缓冲液(试剂盒提供)中室温孵育30分钟，用二氨基联苯胺-H₂O₂溶液显色，并用甲基绿复染。根据形态学标准，染色质缩聚和核片段化的TUNEL阳性核被认为是可能的凋亡细胞，弥散性浅褐色标记核和细胞浆的TUNEL阳性细胞被认为是可能的坏死细胞。

在TUNEL染色中进行了定量检测。选择侧部尾壳核(lateralcaudoputamen)和上部额顶叶皮层用于分析，因为这两个区域典型地受缺血损伤影响，并且代表不同程度的皮层脑功能降低。在此MCA栓塞模型中，有可能侧部尾壳核包含缺血核而额顶叶皮层包含边缘区或半影区。通过盲法观察(blinded investigator)分析每个切片每区域的5个非重叠显微视野和每个脑中的两个切片。在高倍视野(×400)下计算每个区域中凋亡细胞数，以数目/mm²表示。

图3A显示标记组织的显微照片，图3B显示结果图表。

如图3A所示，再灌注后7天检测所有组的侧部尾壳核和额顶叶皮层中的TUNEL阳性凋亡细胞(图3A)。这些结果显示25mg和100mgs-UDCA显著降低与MCA栓塞同侧半球中的TUNEL阳性细胞数。

定量分析显示25mg s-UDCA组后凋亡细胞约减少50％。此外，当施用更高剂量100mg s-UDCA时，凋亡细胞减少达到约70％。具体而言，观察到载体对照大鼠在每个视野具有67.5个TUNEL阳性细胞(采样数)(图3B)；作为对比，观察到接受100mg s-UDCA大鼠在每个视野具有16.7个TUNEL阳性细胞(HFP)。使用Student’s t-检验统计凋亡细胞。

实施例9：caspase活性

再灌注后第7天，在分离缓冲液中匀浆全脑，立即放置在裂解缓冲液(5mM Tris-HCl、pH7.4、20mM EDTA和0.5％ Triton-X 100)中4℃放置15分钟，以评价DEVD特异性caspase活性。然后在4℃下1000g离心裂解物10分钟，并在4℃下17,000g离心上清液20分钟。使用Bradford法(Bio-Rad，Richmond，CA，USA)测定蛋白浓度。Ac-DEVD-AMC[N-乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-AMP(7-氨基-4-甲基香豆素)](Pharmingen，San Diego，CA，USA)用于caspase-3活性分析，将200μg蛋白、200μl反应缓冲液(20mM HEPES、pH7.5、10％甘油醇、4mM DTT)和5μl(1μg/μl)的重构的Ac-DEVD-AMC加入到96孔板的每个孔中。该反应混合物在37℃孵育1小时。使用荧光分光光度计(LS-50B，Perkin-Elmer，Wellesley，MA，USA)在380nm激发波长和460nm发射波长下测量释放的AMC量。

使用比色分析底物DEVD-pNA测量，图3C显示s-UDCA还阻止caspase-3的活化。再灌注后第7天，25mg和100mg s-UDCA组显示caspase-3活性降低。星号(“*”)代表p＜0.05，表示通过ANOVA和随后Fisher’s保护最小显著差异检验分析，对照组和缺血后组之间有显著差异。与对照组相比(0.56±0.51，n＝3)，发现再灌注后第7天100mg s-UDCA组中caspase-3活性显著降低(1.72±0.32，n＝3)。注射25mgs-UDCA或400mg s-UDCA的动物中caspase活性也降低，尽管在该实施例中，400mg s-UDCA中的降低可能没有统计学显著性。

实施例10：Western-Blot分析

为了进一步评价任何神经保护作用，再灌注后第7天用Western-Blot评价eNOS表达。结果如图4所示。

不限于任何作用机制，前述结果可以显示通过抑制细胞凋亡和增强eNOS表达，s-UDCA可以在缺血卒中后减小梗塞体积并增强功能恢复。在一些实施方案中，100mg UDCA/kg剂量可以更有效，而400mg UDCA/kg剂量可能与较高的死亡率有关。在一些具体实例实施方案中，由于麦芽糊精而使溶液粘度增加可能涉及死亡率增加。根据一些实施方案，s-UDCA可能与脑和血液中UDCA浓度有关。然而，尽管注射TUDCA后脑中UDCA浓度轻微增加，施用UDCA和TUDCA后，脑和血液中没有检测到TUDCA。

实施例11：生理参数

手术后1周，对照、25mg、100mg s-UDCA组的所有动物存活。但是，400mg s-UDCA组频繁发生呼吸困难和死亡(死亡率75％)，这可能是由于静脉注射粘性s-UDCA溶液堵塞血管造成的，这通过尸检得到证实。在存活的动物中，生理参数，包括平均动脉压、血气、血糖和体温，在梗塞之前、之中或之后的任何实验组中没有显著差异。

实施例12：统计分析

数据以平均值±S.D表示。使用单向方差分析进行生理变量的统计分析。使用Student’s t-检验确定各组之间梗塞体积和凋亡细胞数的任何差异的显著性。通过方差分析和随后Fisher’s保护最小显著差异检验检测caspase-3活性水平。p值＜0.05认为是显著的。