一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法及其发酵培养基

摘要

本发明涉及一种伯克霍尔德菌发酵生产冠毒素的方法及其发酵培养基。发酵培养基为：葡萄糖2－30g/L，黄豆饼粉1－20g/L，牛肉膏0.3－10g/L，玉米浆2－20g/L，FeCl

说明书

技术领域

本发明涉及一种伯克霍尔德菌发酵生产冠毒素的方法及其发酵培养基。

背景技术

冠毒素(coronatine，简称COR)是二十世纪七十年代末发现的微生物产生的生理活性物质。冠毒素分子由两个特殊的结构部分构成，即：双环羧酸，称为冠面酸(coronafacic acid，简称CFA)和环丙基氨基酸，称为冠氨酸(coronamic acid，简称CMA)。研究显示，冠毒素由一些丁香假单胞致病菌变种产生(Bender，et al.1999)

冠毒素具有模拟高等植物十八碳途径信号分子的功能，可诱导植物过度生长、抑制根的伸长；当施于马铃薯块茎切断表面时，可引起块茎的过度肥大。研究显示，冠毒素可诱导水稻及小麦等禾本科作物颖花快速开放，可作为禾本科作物特别是杂交水稻花时调节剂，可使水稻母本或父本成熟颖花提早开放，使父母本花时接近或同步，由此能大幅度提高杂交水稻制种产量。(曾晓春、周燮，1999；曾晓春、周燮、吴晓玉，2004；闫芝芬，周燮，马春红等，2001；周燮、曾晓春，专利号98111562.4)

冠毒素的生产目前报道的最高产量为丁香假单胞致病变种(Pseudomonassyringae pv.glycinea)及其基因工程菌CGMCC 1276，产量达35-40mg/L，专利号ZL 200510011466.2；以及该致病变种经诱变选育获得的突变株，产量达87.2-112mg/L，其专利申请号200510085280.1。

当前冠毒素仅有少量产品在实验室条件下获得，仍无法工业化生产，其原因菌种自身的合成产物能力是限制该产物工业化的首要因素。

本发明通过自然筛选，获得一株伯克霍尔德菌属的产冠毒素菌株，其产量高于目前已报道的菌株，采用上述菌株生产冠毒素的方法并未见报道。本发明的菌株性能稳定，生长快速，适于工业化生产。

发明内容

本发明目的是提供一种伯克霍尔德菌发酵生产冠毒素的方法及其发酵培养基。

本发明运用洋葱伯克霍尔德菌株，其外文为Burkholderia cepacia，生产冠毒素的方法，利用此方法，冠毒素的生产能力一般在70-200mg/mL。冠毒素的生产能力最高可以在130-200mg/mL。

一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：采用伯克霍尔德菌属菌株。

一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：该方法包括：

A、选择菌种：

洋葱伯克霍尔德菌，其外文名字为Burkholderia cepacia；

B、选择培养基：

斜面培养基：葡萄糖2-30g/L，蛋白胨0.5-10g/L，牛肉膏0.3-10g/L，酵母膏0.3-10g/L，调节pH6.0-8.0；

种子培养基：葡萄糖2-30g/L，牛肉膏0.3-10g/L，玉米浆2-30g/L，FeCl₃ 1-10×10^-4g/L，K₂HPO₄ 0.2-6g/L，KH₂PO₄ 0.2-6g/L，MgSO₄·7H₂O0.01-0.5g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.03-2g/L，调节pH6.5-8.0；

发酵培养基：葡萄糖2-30g/L，黄豆饼粉1-20g/L，牛肉膏0.3-10g/L，玉米浆2-20g/L，FeCl₃ 1-10×10^-4g/L，K₂HPO₄ 0.2-6g/L，KH₂PO₄ 0.2-6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.6g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.03-2g/L，调节pH6.5-8.0；

C、发酵步骤：

C1、将保藏的或市场上购买的洋葱伯克霍尔德菌作为斜面菌种划线于斜面上进行活化，在20-37℃下培养6-36小时；斜面活化的菌种接种于种子培养基中，在25-37℃条件下，180-300rmp摇床培养6-36小时，或在25-37℃条件下，静止培养6-36小时；再取种子培养基体积百分比3-20％的菌悬液转种于发酵罐中的发酵培养基中；

C2、发酵罐工艺过程：发酵温度20-35℃，搅拌速度120-600rmp，罐压0.02-0.08MPa，通气量0.6-1.2vvm，溶氧控制在10-80％，发酵液pH维持在4.5-8.5之间，发酵时间24-96小时；

通气量是这样定义的：指单位体积培养液单位时间分钟中通入的空气体积，单位可用vvm表示。

C3、发酵过程的补料控制：当培养基中残糖浓度低于1-5克/升，加入葡萄糖或含碳氮源营养液，使发酵液糖浓度控制在1-30克/升；

D、冠毒素的提取：

D1、发酵液的预处理、

调整发酵液的酸碱度pH维持在3-6之间；通过过滤或离心使菌体或不溶性沉淀物与含冠毒素的发酵液分离；

D2、色谱柱纯化、

将含冠毒素的发酵液采用吸附柱纯化；洗脱；干燥后得到高纯度的冠毒素。

一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：

D2、色谱柱纯化的具体步骤是

将含冠毒素的发酵液采用吸附柱初步纯化；吸附柱填料为弱极性或非极性吸附树脂，洗脱剂为乙醇等有机溶剂；

进一步精制采用无机基质为填料的色谱柱；以硅胶为填料，三氯甲烷和乙醇混合物，或三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮混合物为流动相；收集含有高纯度的冠毒素洗脱部分，干燥后可以得到高纯度的冠毒素干粉。

一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法所需要的发酵培养基：其中：发酵培养基组成为葡萄糖10g/L，黄豆饼粉5g/L，牛肉膏1g/L，玉米浆10g/L，FeCl₃4×10^-4g/L，K₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.01％，调节pH7.5。按该发酵培养基培养获得的冠毒素的生产能力最高。

本发明的优点：通过选择适当的菌株和合适的培养基、合适的培养工艺，得到高产量的冠毒素，其产量高于目前已报道的菌株、培养基、工艺。本发明的菌株性能稳定，生长快速，适于工业化生产。

具体实施方式

实施例1  250mL三角瓶的摇瓶发酵

洋葱伯克霍尔德菌BPF168接种于斜面培养基上，30℃下培养24小时。接着，斜面菌种接种于含50mL种子培养液的250mL三角瓶中，摇床转速200rmp，30℃下培养16小时。将培养好的种子液按5％接种量转种于含50mL发酵培养液的250mL三角瓶中，摇床转速为200rmp，30℃下培养3天，终点发酵单位为300mg/L。

各种培养基配方如下：

斜面培养基(g/L)：葡萄糖10，蛋白胨5，牛肉膏3，酵母膏1，pH7.0。

种子培养基(g/L)：葡萄糖10，牛肉膏10，玉米浆10，FeCl₃ 4×10^-4，K₂HPO₄2，KH₂PO₄ 4，MgSO₄·7H₂O 0.3，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1，pH7.2。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖10，黄豆饼粉5，牛肉膏1，玉米浆10，FeCl₃4×10^-4，K₂HPO₄ 2，KH₂PO₄ 4，MgSO₄·7H₂O 0.3，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.1，pH7.5。

实施例2  50L罐冠毒素生产

斜面和种子培养方式同实施例2。

发酵参数：发酵培养基装量35升，接种量10％，发酵温度30℃，搅拌速度300rmp，罐压0.05MPa，通气量0.6-1.2vvm，溶氧控制在10-80％，发酵液pH维持在6.5-7.5之间，发酵时间72小时。放罐单位310mg/L。

实施例3  不同发酵培养基配方菌株产冠毒素能力的比较

斜面和种子培养方式同实施例2，15L发酵罐发酵生产的发酵参数除发酵培养基配方不同及其装量为10升外，其余同实施例3。放罐后，测定发酵液冠毒素含量。从表1结果显示，采用本发明的培养基配方(发酵培养基3)，菌株发酵产冠毒素能力比另两组配方(发酵培养基1和发酵培养基2)分别提高378％和98％，效果明显。

不同发酵培养基配方

发酵培养基1：葡萄糖10g/L，NH₄Cl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L，K₂HPO₄·3H₂O 3.6g/L，KH₂PO₄ 4.1g/L，FeCl₃ 3.2×10^-4g/L，pH6.8。(参考Palmer D.A.，Bender C.L.Appl Environ Microbiol.1993，59：1619-1626)

发酵培养基2：葡萄糖20g/L)，蛋白胨1.5g/L，FeCl₃15μmol/L，KH₂PO₄4.0g/L，K₂HPO₄ 1.8g/L，MgSO₄·7H2O 0.2g/L，pH6.8-7.0。

发酵培养基3：发酵培养基(g/L)：葡萄糖10g/L，黄豆饼粉5g/L，牛肉膏1g/L，玉米浆10g/L，FeCl₃ 4×10^-4g/L，K₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.01％，pH7.5。

      表1不同培养基配方冠毒素生产能力的比较

  培养基 发酵培养基1 发酵培养基2 发酵培养基3  冠毒素产量  (μg/mL) 60 145 287

实施例4  冠毒素的提取

①取实施例2或实施例3的发酵液，用盐酸调整发酵液pH至4，离心或过滤。

②清液过非极性或弱极性大孔吸附树脂柱，用pH4.0的80％酸性乙醇水溶液洗脱。

③以160-200目硅胶为填料，三氯甲烷和乙醇混合物，或三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮混合物为流动相，进行洗脱，收集。

④真空干燥或冷冻干燥，获得冠毒素干粉。冠毒素含量达94％。

实施例5

冠毒素的生产方法包括：

(1)高产菌株可利用的种子及发酵培养基种类包括碳源：葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、豆油、菜籽油、糖蜜、玉米浆、有机酸类等；氮源：各种氨基酸、各种硝酸盐、蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉、酵母粉、鱼粉、棉籽饼粉等；以及各种磷酸盐、各种金属盐类包括镁盐、钙盐、锰盐、铁盐、锌盐、钠盐等。

较适宜的斜面培养基(g/L)：葡萄糖2-30，蛋白胨0.5-10，牛肉膏0.3-10，酵母膏0.3-10，pH6.0-8.0。

较适宜的种子培养基(g/L)：葡萄糖2-30，牛肉膏0.3-10，玉米浆2-30，FeCl₃ 1-10×10^-4，K₂HPO₄ 0.2-6，KH₂PO₄ 0.2-6，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.5，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.03-2，pH6.5-8.0。

较适宜的发酵培养基(g/L)：葡萄糖2-30，黄豆饼粉1-20，牛肉膏0.3-10，玉米浆2-20，FeCl₃ 1-10×10^-4，K₂HPO₄ 0.2-6，KH₂PO₄ 0.2-6，MgSO₄·7H₂O0.01-0.6，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.03-2，pH6.5-8.0。

(2)采用一级或多级培养在小规模和大规模发酵中获得高产量。具体步骤包括：

①斜面活化：将保藏的斜面菌种划线于新配制的活化斜面上进行活化，在20-37℃下培养6-36小时。

②液体培养：斜面活化的菌种接种于液体培养基中，接种量为3-20％，在25-37℃条件下，180-300rmp摇床培养6-36小时，或在25-37℃条件下，静止培养6-36小时。

(3)利用上述菌种发酵生产：

①摇瓶发酵：按3-20％接种量接入发酵培养基中，在20-37℃条件下，180-300rmp摇床培养36-72小时。

②发酵罐工艺过程：接种量3-20％，发酵温度20-35℃，搅拌速度120-600rmp，罐压0.02-0.08MPa，通气量0.6-1.2vvm，溶氧控制在10-80％，发酵液pH维持在4.5-8.5之间，发酵时间24-96小时。

③发酵过程的补料控制：当培养基中残糖浓度低于1-5克/升，加入补料培养基，使发酵液糖浓度控制在4-30克/升。

补料培养基：碳源，或碳氮源的组合，或者发酵培养基。

在多级发酵过程中，种子的培养过程可根据发酵规模相应重复并逐级放大。

(4)对发酵液提取方法进行考察后证实，较合适的提取步骤包括：

①发酵液的预处理

调整发酵液的酸碱度有助于进一步纯化。可使用的酸碱调节剂包括：盐酸、草酸、氢氧化钠、石灰、氨水等，其中盐酸更为适合。通过过滤或离心使菌体或不溶性沉淀物与发酵液分离。

②色谱柱纯化

冠毒素发酵液可采用吸附柱初步纯化。吸附柱填料为弱极性或非极性吸附树脂，洗脱剂为有机溶剂，较适宜的为乙醇，如pH2.0-6.0的50-85％的酸性乙醇水溶液。

进一步精制可采用无机基质为填料的色谱柱。如：以160-200目硅胶为填料，三氯甲烷和乙醇混合物，或三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮混合物为流动相。

收集含有高纯度的冠毒素洗脱部分，干燥后可以得到冠毒素干粉。较好的干燥方式是冷冻干燥。

采用本发明菌种和生产方法获得冠毒素，产品纯度高，工艺成本低，适用于工业化生产。

实施例6、一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：采用伯克霍尔德菌属菌株。

实施例7、一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：该方法包括：

A、选择菌种：

洋葱伯克霍尔德菌，其外文名字为Burkholderia cepacia；

B、选择培养基：

斜面培养基：葡萄糖2g/L，蛋白胨0.5g/L，牛肉膏0.3g/L，酵母膏0.3g/L，调节pH6.0；

种子培养基：葡萄糖2g/L，牛肉膏0.3g/L，玉米浆2g/L，FeCl₃1×10^-4g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.01g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.03g/L，调节pH6.5；

发酵培养基：葡萄糖2g/L，黄豆饼粉1g/L，牛肉膏0.3g/L，玉米浆2g/L，FeCl₃ 1×10^-4g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，KH₂PO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O0.01g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.03g/L，调节pH6.5；

C、发酵步骤：

C1、将保藏的或市场上购买的洋葱伯克霍尔德菌作为斜面菌种划线于斜面上进行活化，在20℃下培养6小时；斜面活化的菌种接种于种子培养基中，在25℃条件下，180rmp摇床培养6小时，或在25℃条件下，静止培养6小时；再取种子培养基体积百分比3％的菌悬液转种于发酵罐中的发酵培养基中；

C2、发酵罐工艺过程：发酵温度20℃，搅拌速度120rmp，罐压0.02MPa，通气量0.9vvm，溶氧控制在10％，发酵液pH维持在4.5，发酵时间24小时；

C3、发酵过程的补料控制：当培养基中残糖浓度低于1克/升，加入葡萄糖或含碳氮源营养液，使发酵液糖浓度控制在1克/升；

D、冠毒素的提取：

D1、发酵液的预处理、

调整发酵液的酸碱度pH维持在3；通过过滤或离心使菌体或不溶性沉淀物与含冠毒素的发酵液分离；

D2、色谱柱纯化、

将含冠毒素的发酵液采用吸附柱纯化；洗脱；干燥后得到高纯度的冠毒素。

实施例8、一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：该方法包括：

A、选择菌种：

洋葱伯克霍尔德菌，其外文名字为Burkholderia cepacia；

B、选择培养基：

斜面培养基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏10g/L，调节pH8.0；

种子培养基：葡萄糖30g/L，牛肉膏10g/L，玉米浆30g/L，FeCl₃10×10^-4g/L，K₂HPO₄ 6g/L，KH₂PO₄ 6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚2g/L，调节pH8.0；

发酵培养基：葡萄糖30g/L，黄豆饼粉20g/L，牛肉膏10g/L，玉米浆20g/L，FeCl₃ 10×10^-4g/L，K₂HPO₄ 6g/L，KH₂PO₄ 6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.6g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚2g/L，调节pH8.0；

C、发酵步骤：

C1、将保藏的或市场上购买的洋葱伯克霍尔德菌作为斜面菌种划线于斜面上进行活化，在37℃下培养36小时；斜面活化的菌种接种于种子培养基中，在37℃条件下，300rmp摇床培养36小时，或在37℃条件下，静止培养36小时；再取种子培养基体积百分比20％的菌悬液转种于发酵罐中的发酵培养基中；

C2、发酵罐工艺过程：发酵温度35℃，搅拌速度600rmp，罐压0.08MPa，通气量0.6vvm，溶氧控制在80％，发酵液pH维持在8.5，发酵时间96小时；

C3、发酵过程的补料控制：当培养基中残糖浓度低于5克/升，加入葡萄糖或含碳氮源营养液，使发酵液糖浓度控制在30克/升；

D、冠毒素的提取：

D1、发酵液的预处理、

调整发酵液的酸碱度pH维持在6；通过过滤或离心使菌体或不溶性沉淀物与含冠毒素的发酵液分离；

D2、色谱柱纯化、

将含冠毒素的发酵液采用吸附柱纯化；洗脱；干燥后得到高纯度的冠毒素。

实施例9、一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：该方法包括：

A、选择菌种：

洋葱伯克霍尔德菌，其外文名字为Burkholderia cepacia；

B、选择培养基：

斜面培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨3g/L，牛肉膏3g/L，酵母膏4g/L，调节pH7.0；

种子培养基：葡萄糖15g/L，牛肉膏4g/L，玉米浆12g/L，FeCl₃6×10^-4g/L，K₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚1g/L，调节pH7.5；

发酵培养基：葡萄糖10g/L，黄豆饼粉10g/L，牛肉膏2g/L，玉米浆10g/L，FeCl₃ 5×10^-4g/L，K₂HPO₄ 1g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.8g/L，调节pH7.0；

C、发酵步骤：

C1、将保藏的或市场上购买的洋葱伯克霍尔德菌作为斜面菌种划线于斜面上进行活化，在28℃下培养16小时；斜面活化的菌种接种于种子培养基中，在28℃条件下，240rmp摇床培养12小时，或在28℃条件下，静止培养12小时；再取种子培养基体积百分比10％的菌悬液转种于发酵罐中的发酵培养基中；

C2、发酵罐工艺过程：发酵温度25℃，搅拌速度400rmp，罐压0.06MPa，通气量1vvm，溶氧控制在60％，发酵液pH维持在7.0，发酵时间72小时；

C3、发酵过程的补料控制：当培养基中残糖浓度低于3克/升，加入葡萄糖或含碳氮源营养液，使发酵液糖浓度控制在6克/升左右；

D、冠毒素的提取：

D1、发酵液的预处理、

调整发酵液的酸碱度pH维持在4；通过过滤或离心使菌体或不溶性沉淀物与含冠毒素的发酵液分离；

D2、色谱柱纯化、

将含冠毒素的发酵液采用吸附柱纯化；洗脱；干燥后得到高纯度的冠毒素。

实施例10

一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法，其中：

D2、色谱柱纯化的具体步骤是将含冠毒素的发酵液采用吸附柱初步纯化；吸附柱填料为弱极性或非极性吸附树脂，洗脱剂为乙醇等有机溶剂；

进一步精制采用无机基质为填料的色谱柱；以硅胶为填料，三氯甲烷和乙醇混合物，或三氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮混合物为流动相；收集含有高纯度的冠毒素洗脱部分，干燥后可以得到高纯度的冠毒素干粉。

其余分别重复实施例7、8、9。

实施例11

一种伯克霍尔德菌生产冠毒素的方法所需要的发酵培养基：其中：葡萄糖10g/L，黄豆饼粉5g/L，牛肉膏1g/L，玉米浆10g/L，FeCl₃ 4×10⁴g/L，K₂HPO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，聚氧丙烯聚氧乙烯甘油醚0.01％，调节pH7.5。其余分别重复实施例7、8、9。