一种紫锥菊提取物及其制备方法和含量测定方法

摘要

本发明涉及一种紫锥菊提取物及其制备方法和含量测定方法，本发明的紫锥菊提取物是由下述方法制备而成：用40～70％的含水乙醇提取紫锥菊药材，过滤，得滤液和药渣，浓缩滤液得浸膏；用水或10～30％的含水乙醇提取所得药渣，过滤，得滤液和药渣，弃去药渣，浓缩滤液得浸膏；合并两步所得浸膏，混匀，干燥，得紫锥菊提取物。本发明的紫锥菊提取物成分完整，制备方法简单，成本低廉。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物提取物及其制备方法和含量测定方法，特别是一种紫锥菊提取物及其制备方法和含量测定方法，属于医药技术领域。

背景技术

紫锥菊属Echinacea植物是原产于美洲的一类菊科植物，早在18世纪，北美印第安人首次将紫锥菊作为药用，19世纪，北美移民也广泛应用，其后逐渐传至欧洲，在该属植物中作为药用的有三种，即紫锥菊Echinaceapurpurea，狭叶紫锥菊Echinacea angustifolia，和白紫锥菊Echinacea pallida，作为上呼吸道感染的常用药，并用于创伤、虫蛇咬伤等症，目前它们组成的各种制剂是当前国际上广泛使用的免疫增强剂。(刘一兵.紫锥菊属植物制剂的化学、免疫作用与临床.国外医药·植物药分册，2001，16(2)：47～54)

紫锥菊属植物的主要成分包括三大类，咖啡酸衍生物(主要是菊苣酸、紫锥菊苷、二咖啡酸奎尼酸等)、烷酰胺类化合物和多糖，此外还含有少量的黄酮等物质，不同种的紫锥菊植物中各种成分的含量稍有不同。目前各个国家用于控制紫锥菊质量标准的成分不同，如美国采用咖啡酸类成分的含量，澳大利亚采用咖啡酸类化合物或烷酰胺类化合物，而在欧洲，市场上主要的紫锥菊产品的标准是以多糖的含量确定，我国目前尚无统一的紫锥菊制剂标准，这就造成了紫锥菊制剂质量标准不统一的局面。而目前对于紫锥菊免疫增强作用的研究表明，紫锥菊的免疫活性并不是哪一个单独成分提供的，而是由多种成分协同作用提供的，因此紫锥菊属植物的提取方法变得尤为重要，方法不同，提取物中各类活性成分的含量便不同，甚至导致某类成分的缺失，比如国内外广泛采用的是用乙醇提取紫锥菊，这种方法不可避免的会导致提取物中多糖含量的损失，公开号为CN 1473602A的中国专利申请公开了一种紫锥菊提取物的制备方法，即用30～60％的乙醇回流提取2次，再经过过滤除杂、浓缩、干燥得紫锥菊提取物。

发明内容

本发明的目的是提供一种紫锥菊提取物及其制备方法和含量测定方法。

首先，本发明提供了一种紫锥菊提取物，其特征在于是由下述方法制备而成：

(a)用40～70％的含水乙醇提取紫锥菊药材，过滤，得滤液和药渣，浓缩滤液得浸膏；

(b)用水或10～30％的含水乙醇提取步骤(a)中所得药渣，过滤，得滤液和药渣，弃去药渣，浓缩滤液得浸膏；

(c)合并步骤(a)和(b)中所得浸膏，混匀，干燥，得紫锥菊提取物。

其中，所述的紫锥菊药材来源于紫锥菊属植物紫锥菊Echinacea purpurea，狭叶紫锥菊Echinacea angustifolia，和白紫锥菊Echinacea pallida。

进一步的，本发明所述的紫锥菊提取物，其特征在于经下列步骤制备而成：

(a)取紫锥菊，粉碎，加10～15倍量40～70％的乙醇回流提取1～3小时，过滤，收集滤液，滤液减压回收乙醇，得浸膏；

(b)将步骤(a)中药渣用10～15倍量的水或10～30％的乙醇提取1～3小时，过滤，收集滤液，减压浓缩得浸膏；

(c)合并步骤(a)和(b)中所得浸膏，搅拌均匀，干燥，即得紫锥菊提取物。

更进一步的，本发明所述的紫锥菊提取物，其特征在于经下列步骤制备而成：

(a)取紫锥菊加12倍量60％的乙醇回流提取1小时，过滤，收集滤液，滤液减压回收乙醇，得浸膏；

(b)将步骤(a)中药渣用12倍量的水提取1小时，过滤，收集滤液，减压浓缩得浸膏；

(c)合并步骤(a)和(b)中所得浸膏，搅拌均匀，干燥，即得紫锥菊提取物。

其次，本发明提供了上述紫锥菊提取物中菊苣酸的含量测定方法，其特征在于包括下列步骤：

(a)取紫锥菊提取物50mg，精密称定，置容量瓶中，加30～40∶30～40甲醇-水溶液25～40ml，超声处理10min，放冷，加30～40∶30～40甲醇-水溶液稀释至刻度，离心3min，取上清液作为供试品溶液；

(b)精密称取菊苣酸对照品适量，加甲醇-水溶液溶解并稀释成浓度为7μg/ml的溶液，作为对照品溶液；

(c)色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填料，10～25∶70～75∶5～10甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氢呋喃为流动相，柱温40℃，检测波长327nm，理论塔板数按菊苣酸计算应不低于4000。

(a)分别精密吸取步骤(a)和(b)中供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算干燥品中菊苣酸的含量大于0.35％。

进一步的，本发明所述的紫锥菊提取物的含量测定方法，其特征在于包括下列步骤：

(a)取紫锥菊提取物50mg，精密称定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液35ml，超声处理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀释至刻度，离心3min，取上清液作为供试品溶液；

(b)精密称取菊苣酸对照品适量，加甲醇-水溶液溶解并稀释成浓度为7μg/ml的溶液，作为对照品溶液；

(c)色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氢呋喃为流动相，柱温40℃，检测波长327nm，理论塔板数按菊苣酸计算应不低于4000；

(d)分别精密吸取步骤(a)和(b)中供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算干燥品中菊苣酸的含量大于0.35％。

本发明的有益效果：

1、与现有技术中紫锥菊提取物相比，本发明提取方法所得紫锥菊提取物成分中不仅含有醇溶性的咖啡酸类衍生物(菊苣酸)，而且使紫锥菊的水溶性成分多糖得以完整保留，从而保证了紫锥菊提取物各类成分共同发挥免疫增强作用；

2、本发明紫锥菊提取物的制备方法步骤简单，成本低廉，适合于工业化生产；

3、建立了紫锥菊提取物中菊苣酸含量的高效液相色谱测定方法，该方法灵敏度高，可控性好，为保证紫锥菊提取物的质量稳定、可控奠定了良好的基础。

具体实施方式

下面通过实施例的方式对本发明做进一步的说明，但不应理解为是对本发明的进一步限定，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想的前提下，做出其它多种形式的修改、替换或变更所实现的技术均属于本发明的范围。

【实施例1】紫锥菊提取物的制备与含量测定

制备：取紫锥菊10kg，粉碎，加10倍量40％的乙醇回流提取2小时，过滤，收集滤液，滤液减压回收乙醇，得浸膏(相对密度为1.06)；药渣用10倍量20％的乙醇提取1小时，过滤，收集滤液，减压浓缩得浸膏(相对密度为1.13)；合并所得浸膏，搅拌均匀，喷雾干燥，即得紫锥菊提取物。

含量测定：取紫锥菊提取物50mg，精密称定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液25ml，超声处理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀释至刻度，离心3min，取上清液作为供试品溶液；精密称取菊苣酸对照品适量，加甲醇-水溶液溶解并稀释层浓度为7μg/ml的溶液，作为对照品溶液；色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氢呋喃为流动相，柱温40℃，检测波长327nm，理论塔板数按菊苣酸计算应不低于4000。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算干燥品中菊苣酸的含量为0.65％。

【实施例2】狭叶紫锥菊提取物的制备和含量测定

制备：取狭叶紫锥菊10kg，粉碎，加12倍量60％的乙醇回流提取1小时，过滤，收集滤液，滤液减压回收乙醇，得浸膏(相对密度为1.07)；药渣用12倍量的水提取1小时，过滤，收集滤液，减压浓缩得浸膏(相对密度为1.13)；合并所得浸膏，搅拌均匀，喷雾干燥，即得紫锥菊提取物。

含量测定：取狭叶紫锥菊提取物50mg，精密称定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液35ml，超声处理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀释至刻度，离心3min，取上清液作为供试品溶液；精密称取菊苣酸对照品适量，加甲醇-水溶液溶解并稀释层浓度为7μg/ml的溶液，作为对照品溶液；色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氢呋喃为流动相，柱温40℃，检测波长327nm，理论塔板数按菊苣酸计算应不低于4000。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算干燥品中菊苣酸的含量为1.20％。

【实施例3】白紫锥菊提取物的制备和含量测定

制备：取白紫锥菊10kg，粉碎，加15倍量70％的乙醇回流提取3小时，过滤，收集滤液，滤液减压回收乙醇，得浸膏(相对密度为1.08)；药渣用15倍量的水提取1小时，过滤，收集滤液，减压浓缩得浸膏(相对密度为1.15)；合并所得浸膏，搅拌均匀，喷雾干燥，即得紫锥菊提取物。

含量测定：取白紫锥菊提取物50mg，精密称定，置容量瓶中，加36∶35甲醇-水溶液40ml，超声处理10min，放冷，加36∶35甲醇-水溶液稀释至刻度，离心3min，取上清液作为供试品溶液；精密称取菊苣酸对照品适量，加甲醇-水溶液溶解并稀释层浓度为7μg/ml的溶液，作为对照品溶液；色谱条件为：以十八烷基键合硅胶为填料，20∶72∶8甲醇-0.1mol/L磷酸溶液-四氢呋喃为流动相，柱温40℃，检测波长327nm，理论塔板数按菊苣酸计算应不低于4000。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μl，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，按外标法计算干燥品中菊苣酸的含量为0.70％。

【实施例4】本发明提取物对免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

取KM种小鼠72只，♀♂各半，按体重随机分为：正常组、模型组、实施例1提取物组、实施例2提取物组、实施例3提取物组、紫锥菊醇溶性提取物组，每组12只。各组分别灌服上述相应的药物，正常和模型组给予等容量的蒸馏水，连续给药14天。于第7日，除正常组外，每组小鼠按50mg/kg，0.1ml/10g腹腔注射新鲜配制的CY药液，连续给药3天(每天均为新鲜配制)，于第11天再次给于腹腔注射新鲜配制的CY药液，期间继续给予各药物，第12天剖取脾脏，脾脏组织在无菌条件下用无血清1640培养基洗涤两次，用眼科弯剪机械分离各组脾淋巴细胞，混合每组12只小鼠脾脏细胞，用氯化胺处理5min，使红细胞充分裂解，离心收集淋巴细胞，洗涤3次，用含20％小牛血清的1640培养基稀释细胞，按3×10⁵/孔接种于两个96孔培养板，每孔总体积为200μl，用Con A(5μg/ml)处理细胞，放置含37℃，5％CO₂孵箱中恒温培养。淋巴细胞培养72h后，用MTT法测定细胞增殖数，结果见表1。

表1本发明紫锥菊提取物对免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖的影响((n＝12，X±S))

  组别  剂量(mg/kg)  脾淋巴细胞增殖能力  正常组  模型组  实施例1提取物组  实施例2提取物组  实施例3提取物组  紫锥菊醇溶性提取物组  -  -  200  200  200  200  0.135±0.035  0.092±0.012^**  0.228±0.102^##  0.301±0.176^##△  0.246±0.119^##△  0.198±0.074^##

注：与正常组比较^*P＜0.05，^**＜0.01；与模型组比较^#P＜0.05，^##＜0.01；

与紫锥菊醇溶性提取物组比较^△P＜0.05，^△△＜0.01。

从表1结果可以看出，与正常组比较，模型组脾淋巴细胞增殖能力显著降低，P＜0.01，表明造模成功；与模型组比较，各药物组脾淋巴细胞增殖能力均显著增强，P＜0.01，表明本发明提取物具有增强免疫低下小鼠脾淋巴细胞增殖能力的作用；与紫锥菊醇溶性提取物组相比，实施例2提取物组和实施例3提取物组对脾淋巴细胞增殖能力作用均优于紫锥菊醇溶性提取物组，并有显著的统计学意义(P＜0.05)，表明本发明紫锥菊提取物对免疫低下小鼠的免疫增强作用优于单独的紫锥菊醇溶性提取物组。