一种新的具有抗菌活性的大环内酯类化合物Macrolactin Q

摘要

本发明涉及一个从中国东海芽孢杆菌次级代谢产物中分离获得的新的抗菌天然产物——Macrolactin Q，如式(1)所示。该化合物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。采用海水培养基发酵培养芽孢杆菌201721菌株，发酵液经Sephadex LH－20、中压液相以及RP C

说明书

技术领域

本发明涉及一种从海洋枯草芽孢杆菌的次级代谢产物中提取的新的抗菌化合物Macrolactin Q及其在制备抗菌药物中的应用。

背景技术

全球生物的种类约50万种，其中80％来自于海洋，因此，海洋是个巨大的生物资源宝库。鉴于陆地资源日趋匮乏，开发利用海洋资源已成为全球关注的前沿科学问题。在海洋资源中，海洋生物资源最为重要，是尚未充分开发利用的资源宝库，其中又以海洋药用生物资源的开发为热点。海洋特殊生态环境中的生物资源已成为拓展天然药用资源的新空间。到目前为止，已经发现15,000多种海洋天然产物，其中两百多种已申请专利。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)201721为革兰氏阳性，杆菌。美国加利福尼亚大学K.Gustafson教授于1989年从深海海洋细菌的次级代谢产物中同时得到具有不同抗菌选择性的6种大环内酯类化合物Macrolactin A-F，(K.Gustafson et al.J.Am.Chem.Soc.1989，111，7519)，以后又相继报道了11种同类结构的此类成分即MacrolactinG-N以及7-O-succinoylmacrolactinA和7-O-succinoylmacrolactin F。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从生长于中国东海芽孢杆菌的次级代谢产物中提取的一种新的具有抗菌活性的大环内酯类化合物Macrolactin Q及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。

本发明所用的菌种是从中国东海海泥样品中分离获得的芽孢杆菌201721菌株，现保存于第二军医大学生物化学与分子生物学教研室及中国典型培养物保藏中心(CCTCC菌种保藏号M207008)。本发明从芽孢杆菌201721中分离获得一个活性新天然产物Macrolactin Q，该化合物为黄色油状物，分子式C₂₄H₃₄O₆，高分辨质谱：419.2454(M+H)⁺，¹H和¹³C核磁共振谱数据见表1。

      表1  Macroactin Q的¹H和¹³C核磁共振谱数据

  C ¹³Cppm  H ¹Hppm  C-1  C-2  C-3  C-4  C-5  C-6  C-7  C-8  C-9  C-10  C-11  C-12  C-13  C-14  C-15  C-16  C-17  C-18  167.84  117.86  145.37  129.93  142.05  42.57  73.60  138.85  127.38  130.64  131.51  72.36  72.95  40.86  69.03  135.51  130.86  131.75   H-2  H-3  H-4  H-5  H-6  H-7  H-8  H-9  H-10  H-11  H-12  H-13  H-14  H-15  H-16  H-17  H-18   5.6，m，1H  6.6，dd，1H  7.2，dd，1H  6.2，dd，1H  2.4，2.5，m，2H  4.1，dd，1H  5.8，dd，1H  6.4，dd，1H  6.1，m，1H  5.5，dd，1H  4.5，dd，1H  4.0，dd，1H  1.5，m，2H  4.3，dd，1H  5.6，m，1H  6.1，m，1H  6.0，dd，1H

  C-19  C-20  C-21  C-22  C-23  134.76  32.64  25.36  35.99  71.55  H-19  H-20  H-21  H-22  H-23  5.6，m，1H  2.1，2.2，m，2H  1.5，m，2H  1.6，m，2H  5.1，m，1H  C-24  20.18  H-24  1.2，d，3H

采用600MHz的核磁共振仪测定，样品溶解于氘代甲醇。

同时，还测定了该化合物多种二维核磁共振谱(TOCSY，DQCOSY，HMQC，HMBC和NOESY)，确定了该化合物所有的碳原子和氢原子的归属及该化合物的化学结构，结构式如下：

本发明中化合物的制备方法如下：

(1)将201721菌株从试管斜面上接种到装有发酵培养基的250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装70ml培养基，28℃摇床恒温培养，转速90r/min。培养一天后将种子培养液接种到2000ml的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装700ml发酵培养基，按10％接种量接种，同上培养条件培养4d。发酵培养基成分：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，葡萄糖6.0g，人工海水(或陈海水)1000ml，pH6.5。人工海水配方：NaCl 25.0g，Na₂SO₄ 4.0g，KCl 0.7g，NaHCO₃ 0.20g，KBr0.10g，H₃BO₃ 0.03g，NaF 0.003g，53mL 1.0mol/L MgCl₂溶液，10mL 1.0mol/lCaCl₂溶液，0.90ml 0.1mol/L SrCl₂溶液，1mL微量元素(微量元素储备液：EDTA 50g，KOH 31g，FeSO₄·7H₂O 4.98g，H₂SO₄ 1ml，H₃BO₃ 11.42g，ZnSO₄·7H₂O 8.82g，MnCl₂·4H₂O，1.44g，MoO₃ 0.71g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49g，蒸馏水1000mL)，蒸馏水1000ml，pH调为6.5。

(2)将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌体后收集发酵液上清。将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为氯仿-甲醇(4∶1)。(3)将所得洗脱相蒸干后通过中压液相(瑞士Buchi公司Fraction CollectorC-660，UV-Photomaker C-635，Pump manager C-615，Pump Module C-605)再次纯化，流动相及洗脱条件为：甲醇(0％～40％)-水60min，甲醇(40％～60％)-水180min，甲醇(60％～100％)-水80min，流速3.0ml/min，218nm检测，收集梯度为甲醇(60％～100％)-水的洗脱峰，浓缩后HPLC进一步纯化，使用Zorbax半制备C₈反相柱(9.4mm×250mm)制备，流动相为乙腈∶水(28∶72)，流速2.0mL/min，218nm检测，收集t_R为21.5min的洗脱峰制备出化合物macrolactin Q。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1  201721海洋菌株的发酵培养

a.201721海洋菌株的发酵培养基如下：蛋白胨5.0g，酵母膏1.0g，葡萄糖6.0g，人工海水(或陈海水)1000ml，pH 6.5。人工海水配方：NaCl 25.0g，Na₂SO₄ 4.0g，KCl 0.7g，NaHCO₃ 0.20g，KBr 0.10g，H₃BO₃ 0.03g，NaF 0.003g，53mL 1.0mol/L MgCl₂溶液，10mL 1.0mol/l CaCl₂溶液，0.90ml 0.1mol/LSrCl₂溶液，蒸馏水1000ml，1mL微量元素(微量元素储备液：EDTA 50g，KOH 31g，FeSO₄·7H₂O 4.98g，H₂SO₄ 1ml，H₃BO₃ 11.42g，ZnSO₄·7H₂O 8.82g，MnCl₂·4H₂O，1.44g，MoO₃ 0.71g，CuSO₄·5H₂O 1.57g，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.49g，蒸馏水1000mL)，pH调为6.5。

b.发酵培养过程：将201721菌株从试管斜面上接种到装有发酵培养基的12只250ml三角瓶中进行种子培养，每个三角瓶装70ml培养基，28℃摇床恒温培养，转速90r/min。培养一天后将种子培养液接种到12只2000ml的三角瓶中进行扩大培养，每瓶装700ml发酵培养基，按10％接种量接种，同上培养条件培养4d。

实施例2  活性化合物的分离提取

将完成发酵培养过程的菌液经过滤，除去菌体后收集发酵液上清。将发酵液上清用乙酸乙酯等体积萃取，重复3次，合并萃取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，将浸膏用Sephadex LH-20粗分段，流动相为氯仿-甲醇(4∶1)。将所得洗脱相蒸干后通过中压液相(瑞士Buchi公司Fraction Collector C-660，UV-Photomaker C-635，Pump manager C-615，Pump Module C-605)再次纯化，流动相及洗脱条件为：甲醇(0％～40％)-水60min，甲醇(40％～60％)-水180min，甲醇(60％～100％)-水80min，流速3.0ml/min，218nm检测，收集梯度为甲醇(60％～100％)-水的洗脱峰，浓缩后HPLC进一步纯化，使用Zorbax半制备C₈反相柱(9.4mm×250mm)制备，流动相为乙腈∶水(28∶72)，流速2.0mL/min，218nm检测，收集t_R为21.5min的洗脱峰制备出化合物macrolactin Q。

实施例3  活性化合物Macrolactin Q的活性测定结果

采用微量肉汤稀释法(戴自英，刘裕昆，汪复  实用抗菌药物学  上海：上海科学技术出版社，1992，7～8)测定对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的MIC值。采用稻瘟霉活性测定法(Hisayoshi K，，Michio N，Takeshi Y，et al.JAntibiotics，1996，49(9)：873-878.)测定化合物macrolactin Q对稻瘟霉的抑制活性。结果显示，化合物macrolactin Q抗大肠杆菌的MIC值为0.2μg/ml，抗金黄色葡萄球菌的MIC为0.7μg/ml，抑制稻瘟霉生长的最大稀释倍数为64。

本发明的大环内酯类化合物Macrolactin Q对稻瘟霉和大肠杆菌及金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用，具有作为制备抗菌药物的潜在用途。