短小棒状杆菌制备猪传染性胸膜肺炎生物制剂的用途

摘要

本发明涉及短小棒状杆菌的新医药用途，尤其是提供了一种短小棒状杆菌制备猪传染性胸膜肺炎生物制剂的用途，并提供了短小棒状杆菌的的生物制剂。在基因水平对APP菌主要的血清1型和血清5型标准株基因差异进行了研究，构建了基因组差减文库和mRNA差减文库，并对主要差异基因片段进行分析和网上同源性比较，无论是基因组还是mRNA水平的差异基因，APP菌株都存在与短小棒状杆菌重要功能基因较多的同源基因片段。

说明书

技术领域

本发明涉及短小棒状杆菌的新医药用途，尤其是提供了一种短小棒状杆菌制备防治猪传染性胸膜肺炎生物制剂的用途，属于兽医学生物制药领域。

背景技术

本发明涉及的猪传染性胸膜肺炎是由放线杆菌(A.pleuropneumoniae)感染所至，是猪的一种高度接触传染性、致死性呼吸道传染病。自1957年由英国人Pattison等首次报道，至20世纪80年代已在世界各地广泛流行。近年来国际公认其为危害现代养猪业的重要传染病之一，在美国、丹麦、瑞士本病被列为主要猪病之一。随着养殖业规模化、集约化的发展，本病的发生呈爆发趋势，对养殖业的危害日益严重。发病率视各地的管理和所采取的预防措施不同，但一般较高(8.5~100％)，死亡率根据环境和菌株毒力不同，可在0.4％~100％之间。近年来，国内外的研究及临床实践表明，猪患呼吸系统疾病时，容易发生继发感染或混合感染。如本病与猪伪狂犬病、兰耳病、猪肺疫、猪支原体肺炎等病的混合感染，危害更加严重。这也是近年来该病呈现的最主要的流行方式。我国1987年由哈尔滨兽医研究所首次报道该病，以后陆续在许多省市发生本病。据报道1999年发病率40％，死亡率10％，2000年发病率75％，死亡率2％，2003年发病率10％-80％，死亡率6％-20％，2004年血清学普查阳性率74.6％。给养猪业造成了严重的经济损失。

本病病原为胸膜肺炎放线杆菌(ActinobacillusPleuropeumoniae，APP)。APP血清型多达15个，其中生物I型中的1、5、9、10、11五种血清型致病力最强。我国发现或流行的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9、10等型。由于主要血清型之间无有效的交叉免疫保护，严重制约了多价疫苗的开发研究，因而使得本病的预防变得非常困难。目前我国使用猪胸膜肺炎放线杆菌三价灭活疫苗预防猪传染性胸膜肺炎，对部分血清型具有一定的保护作用。

已知短小棒状杆菌具有激活巨噬细胞、NK细胞、B细胞、抗肿瘤的作用。与本发明相近的专利技术是2003年9月3日公开的“厌氧短小棒状杆菌药用成分的分离方法、药用用途及药物制剂”，公开号为CN1439381。它公开了一种厌氧短小棒状杆菌药用成分的分离方法，并提供了其药用用途及药物制剂，介绍了其在人医学领域的治疗作用。本专利和已有的专利虽然使用同一种细菌，但使用方法、应用对象和使用目的互不相关，没有可比性。

发明内容

本发明提供一种短小棒状杆菌的新用途，发现了厌氧短小棒状杆菌对猪胸膜肺炎放线杆菌感染的治疗、预防作用。

本发明还提供了短小棒状杆菌制备猪传染性胸膜肺炎生物制剂，目的旨在治疗和预防猪传染性胸膜肺炎疾病。

本发明采用以往作为免疫增强剂的厌氧短小棒状杆菌用于治疗和预防猪胸膜肺炎放线杆菌感染，首先将厌氧短小棒状杆菌进行厌氧培养，收获菌体制成活菌苗，免疫动物，4周后用APP菌进行攻毒，被免疫动物可形成坚强的免疫保护力而对照组均死亡。

本发明采用的是对动物无致病作用的厌氧短小棒状杆菌制成的活菌制剂，安全、方便，而且对多种血清型APP菌感染都有保护作用。生物制剂具有菌苗容易培养、制备，毒副作用小，对多种血清型APP同时保护的优点。

以下为本发明进行了厌氧短小棒状杆菌预防APP感染的动物实验研究：

本发明在基因水平对APP菌主要的血清1型和血清5型标准株基因差异进行了研究，构建了基因组差减文库和mRNA差减文库，并对主要差异基因片段进行分析和网上同源性比较，发现无论是基因组还是mRNA水平的差异基因，APP菌株都存在与短小棒状杆菌(CP)重要功能基因较多的同源基因片段。表明CP菌可能与APP菌存在共同抗原，为此开展了CP菌预防APP菌感染的实验研究。

一、方法：

1、CP菌培养

取CP菌株原始保存菌液化0.5ml，用1-2ml生理盐水稀释，接种于4-5g碎肉培养基中，37℃厌氧培养4-5天，传至抗氧化剂培养基中，置厌氧培养箱内，厌氧培养3天。再传至肝透析液培养基中，厌氧培养3-7天，收集菌体，用生理盐水洗涤3次，稀释成20亿-50亿/ml备用。

2.免疫原制备

取黄芪多糖干粉10克，用蒸馏水配成4％的水溶液，100℃流通蒸汽灭菌30分钟。待凉至室温后，在无菌条件下将黄芪多糖水溶液与CP菌液等量混后，反复搅拌均匀。制成5亿/ml CP菌的免疫用制剂。取0.1ml分别注入普通肉汤、碎肉培养基，进行杂菌检验，另取1ml制剂，分别给5只体重18-22克的昆明系小鼠进行腹腔注射，0.2ml/只。观察1周，普通肉汤、碎肉培养基进行镜检，除已知的短小棒状菌外无其它细菌生长，小鼠全部健活为合格。即为免疫用CP制剂，2-8℃可保存6个月。

3.免疫动物

将36只体重18-22克的昆明系小鼠随机分组，第1组16只，第2组16只，均采用CP抗原制剂免疫，0.2ml(1亿菌)/只，腹腔注射，间隔1周，再免疫1次。第3组和第4组作为对照，分别用含2％黄芪多糖(与CP免疫制剂中的含量相同)的水溶液进行腹腔注射，0.2ml/只，注射时间和次数与第1组、第2组相同。各组小鼠相同条件下饲养于洁净环境，自由采食和饮水。

4.血清抗体检测

免疫后第2周和4周，分别用CP、APP 1型、APP 5型菌体超声裂解物包被ELISA反应板，进行血清抗体检测。

5.攻毒试验

将APP菌接种于BHI液体培养基在37℃培养16-18h，用生理盐水洗涤菌体3次，恢复原体积，进行活菌计数。在首次免疫后的第35天，第1组和第3组小鼠分别用10倍LD₅₀的APP血清5型攻毒，每只腹腔接种0.2ml，约含菌为5.1×10⁶ CFU；第2组和第4组小鼠分别用10倍LD₅₀的APP血清1型攻毒，每只腹腔接种0.2ml，约含菌为8.0×10⁷ CFU。观察1周。

6.APP菌体检测

攻毒小鼠死亡后立即无菌采集腹腔液、肝脏、肺脏，采用BHI培养基分离培养APP菌，同时采用APP特异引物进行PCR检测。存活小鼠在1周后采用APP特异引物对其肝脏和肺脏进行PCR检测。

二、结果：

1.血清检测结果

免疫组小鼠均可检测到对CP、APP菌1型和5型的抗体，对照组未检测到抗CP、APP抗体。结果见下表。

表1实验小鼠血清抗体效价检测结果

CP APP1 APP5第2周 第4周 第2周 第4周 第2周 第4周第一组1∶400 1∶3200 1∶200 1∶1600 1∶200 1∶1600第二组1∶400 1∶1600 1∶200 1∶1600 1∶200 1∶1600第三组0 0 0 0 0 0第四组0 0 0 0 0 0

2.攻毒结果

攻毒后24小时内第1组小鼠死亡2只，第2组小鼠死亡1只，其它小鼠观察1周均健康存活。第3组和第4组小鼠均在24小时内全部死亡。小鼠存活率见图1。经统计学分析，第1组和第2组小鼠存活率与对照组比较，差异极显著，t≤0.01。

3.APP菌检测结果

各组死亡小鼠在腹腔液、肝脏、肺脏都分离到了APP菌，死亡小鼠脏器PCR检测都扩增到450bp APP的特征条带。图2。攻毒后存活的小鼠在攻毒后第6天处死，采集肺脏和肝脏进行PCR检测，没有检出APP菌。

三、结论

短小棒状杆菌制成的活菌制剂免疫小鼠，可以保护小鼠免受APP感染，并且在攻毒一周后将体内APP菌清除。

附图说明

图1、APP菌攻毒小鼠存活率；

图2、死亡小鼠APP菌PCR检测结果

左起第1泳道为Marker DL2000，其它依次为第3组小鼠肝、肺；第4组小鼠肝、肺。

具体实施方式

实施例1

短小棒状杆菌铝胶佐剂制剂

取短小棒状杆菌菌株用2ml生理盐水稀释，接种于4g碎肉培养基中，37℃厌氧培养5天，传至硫乙醇酸钠抗氧化剂培养基中，厌氧培养，再传至肝透析液培养集中，厌氧培养5天，收集菌体，用生理盐水稀释成30亿-50亿/ml，加入20％铝胶佐剂，反得摇匀备用。取0.1ml分别注入普通肉汤、碎肉培养基，进行杂菌检验，另取1ml制剂，分别给5只体重18-22克的昆明系小鼠进行腹腔注射，0.2ml/只。观察1周，普通肉汤、碎肉培养基进行镜检，除已知的短小棒状菌外无其它细菌生长且小鼠全部健活为合格。所得制剂即为用于猪传染性胸膜肺炎的短小棒状杆菌生物药品。2-8℃保存6个月。

实施例2

短小棒状杆菌黄芪多糖佐剂冻干粉剂

取实施例1制备的短小棒状杆菌菌体10克，在无菌条件下用生理盐水稀释成50亿/ml，加入2％的黄芪多糖佐剂，再加2％脱脂牛乳，1％葡萄糖，反复混匀，装入5ml的疫苗瓶，每瓶装量为2ml，置-20℃冷冻24小时，再转入-70℃冷冻48小时，最后放入真空冷冻干燥机进行冻干，即得用于防治猪传染性胸膜肺炎的短小棒状杆菌冻干剂。每支含短小棒状杆菌100亿。-20℃保存2年。

实施例3

制备本发明胶囊制剂

取实施例3制备的厌氧短小棒状杆菌冻干粉20克，加入赋形剂药用淀粉30克，充分混合均匀，装入胶囊，每粒含厌氧短小棒状杆菌的药用成分200毫克。

实施例4

提取物粉针注射剂：

取短小棒状杆菌菌株用2ml生理盐水稀释，接种于4g碎肉培养基中，37℃厌氧培养5天，传至硫乙醇酸钠抗氧化剂培养基中，厌氧培养，再传至肝透析液培养集中，厌氧培养5天，收集菌体，用生理盐水稀释成300亿-450亿/ml，加入3倍的脱水剂(-46℃冷丙酮)，置4℃冰箱过夜，收集菌体，用冷丙酮洗2次，将沉淀物至37℃干燥成菌粉，研磨后备用。

取3克菌粉加入100ml生理盐水制成悬液，用胰蛋白酶0.1-0.6mg/ml，37℃-55℃消化3-6小时，然后升高温度80-120℃终止消化，用PBS洗涤，收集沉淀，在同上重复消化一次；离心收集沉淀，加入胃蛋白酶0.1-0.6mg/ml在0.2M Tris液中20-37℃消化12-36小时，高速离心，洗涤，取沉淀物重复消化过程一次，离心，生理盐水洗涤2次，然后进行脱脂杀菌处理：用乙醚/乙醇0.5-1.5/1-2(V/V)脱脂24-72小时，2-4次，收集沉淀用氯仿脱脂24-72小时2-4次，收集沉淀，用氯仿/甲醇3-1/0.5-2(V/V)24-72小时，2-4次然后生理盐水洗涤，冷冻干燥制成CP药用成分纯化物。

短小棒状杆菌提取纯化物  15克

氯化纳    75克

注射用水  1000ml

制备过程：将短小棒状杆菌药用成分纯化物、氯化纳溶解与适量的注射用蒸馏水中，用1～5％的氢氧化钠溶液调PH8.5，加注射用水至1000ml，通过0.2μm的微孔滤膜过滤所得溶液，在无菌条件下装入安瓶，冷冻干燥。